專利名稱：一種超氧化物歧化酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶的制備方法，尤其涉及一種超氧化物歧化酶的制備方法，屬于
生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
超氧物歧化酶(Superoxide dismutaee簡稱SOD)是一種新型酶制劑，是生物體內(nèi) 重要的抗氧化酶，廣泛分布于各種生物體內(nèi)，如動物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理 活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)的水平高低意味著衰老與死亡 的直觀指標(biāo)；由于現(xiàn)代生活壓力，環(huán)境污染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形 成；現(xiàn)已證實，由氧自由基引發(fā)的疾病多達60多種。SOD可對抗與阻斷因氧自由基對細胞 造成的損害，并及時修復(fù)受損細胞，復(fù)原因自由基造成的對細胞傷害。它對于治療因超氧離 子引起的各種疾病均有一定的療效，尤其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑痕瘡，皮肌炎等均有明顯 效果。此外，在防輻射，防衰老，抗腫瘤等方面也已進入臨床。 超氧物歧化酶原來從牛血中制取，現(xiàn)多從豬血中提取，商品名為0rgotdin。目前， 國內(nèi)外超氧化物歧化酶(SOD)的生產(chǎn)主要經(jīng)過采血、取血球、丙酮沉淀、熱處理、透析、上 柱、濃縮、冷凍干燥而成，其主要步驟如下 1、將"抗凝劑"加水配制好后按1 : 5的比例接屠宰豬、?；蜓虻难海⒉煌５?攪拌(防止結(jié)塊)，血液取回后，離心除去血漿，用氯化納(0.9%)溶液洗滌后離心，去除上 清液，再洗滌離心，連續(xù)三遍，得干凈的紅細胞； 2、將干凈的紅細胞加去離子水，5t:以下攪拌30分鐘以上，然后加入25%倍量的
乙醇和一定量的三氯甲烷，攪拌后上離心機離心去血紅蛋白，收集上清液； 3、在0t:左右，將上清液加入1.2-1.5倍量的丙酮，沉淀3小時以上，離心，除
去上清液，得沉淀物，再將沉淀物加去離子水后溶解，再離心，除去不溶性蛋白，上清液于 55-65t:熱處理10-15分鐘，再用冷卻水冷卻至l(TC以下； 4、在(TC下溫度條件下，將上清液加入適量丙酮，再沉淀3小時-5小時，離心，除去 上清液，沉淀再加去離子水，充分?jǐn)嚢?，再離心除去不溶性蛋白，清液置透析袋中動態(tài)透析 6-8小時，得透析液； 5、將透析完的液體加到已用2. 5mmol/L 6磷酸緩沖液平衡好的 EDAE-SEPHADEXA-50柱上吸附，用6、2. 5-50mmol/L磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫，收集 S0D活力的洗脫液； 6、洗脫液用超濾器超濾、濃縮、再用凍干機冷凍干燥36小時，出成品S0D。(注以 上操作溫度控制在5°C以下， 一般制備時間為2-4天)。 采用上述制備工藝的生產(chǎn)車間要達到制藥業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，工藝非常復(fù)雜，要使用大量的 機械設(shè)備、容器、和各種儀器裝置，還要使用大量的乙醇，氯仿、丙酮等有害的化學(xué)試劑， 此外，丙酮和乙醇還不能使用一個回收裝置，所以出品率極低，每公斤血液只能生產(chǎn)出 0. 01-0. 03克S0D，甚至更少，而且活力標(biāo)準(zhǔn)大多為3500u/mg左右。
所以，生產(chǎn)實踐中急需要一種制備工藝簡捷、不需要復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備，生產(chǎn)成本 低，環(huán)境友好、適合工業(yè)化生產(chǎn)的超氧化物歧化酶的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的超氧化物歧化
酶的制備方法，該方法制備工藝簡捷、不需要復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備，生產(chǎn)成本低，環(huán)境友好，產(chǎn)率
高，所制備的超氧化物歧化酶活力高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 —種超氧化物歧化酶的制備方法，包括 (1)將動物凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白沉淀劑，過濾，收集濾液；
(2)將濾液離心，取上清液，超濾，取截流液，冷凍干燥，收集凍干粉，即得。
其中，所述的動物凝血塊可以是屠宰后的豬、?；蜓虻哪獕K，優(yōu)選為牛凝血塊。
優(yōu)選的，所述的蛋白沉淀劑由以下重量份的組分組成5-磺基水楊酸1 1. 5份， 硫酸鉀75 85份和15 25份蒸餾水；其中，5_磺基水楊酸和硫酸鉀優(yōu)選用分析純；將 上述3種組分混合在一起，攪拌均勻，即得；其中，所加入的蛋白沉淀劑的用量，按重量比計 算，優(yōu)選為向動物凝血塊中加入1%的蛋白沉淀劑。 優(yōu)選的，步驟(1)中所述的過濾為先用60-120目(優(yōu)選為80目)濾網(wǎng)過濾第1 次，再用板框過濾器過濾第2次。 優(yōu)選的，步驟(2)中所述的超濾采用板式膜超濾器進行超濾；為了達到更好的效 果，更優(yōu)選的，采用板式膜超濾器超濾2次，其中，第1次超濾所用板式膜超濾器的膜孔徑為 50000D，第2次超濾所用板式膜超濾器的膜孔徑為30000D。 步驟(2)中所述的冷凍干燥優(yōu)選在零下42t:的溫度條件下進行冷凍干燥；更優(yōu)選 的，首先在零下20 17°C的溫度條件下凍干6 8小時，然后在零下10 7°C的溫度條件 下凍干1-3小時(更優(yōu)選為2小時)。 步驟(2)中在冷凍干燥完成之后，將溫度升至2(TC，再收集凍干粉。 本發(fā)明方法與國內(nèi)外目前制備超氧化物歧化酶的生產(chǎn)工藝相比，主要具有以下幾
方面的優(yōu)點 1、本發(fā)明方法可以用凝血塊作為制備超氧化物歧化酶的原料現(xiàn)有的制備工藝多 以動物血液為制備原料，本發(fā)明的方法可以將所取回的動物凝血塊直接使用，這樣對原料 的要求就大大降低，從而更有利于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 2、工藝簡單，所制備的超氧化物歧化酶活力高本發(fā)明方法，由于其工藝非常簡單 (凝血塊破碎成漿，加入"清除劑"機械處理清除所有不要的蛋白質(zhì)，超濾或析出去小分子 S0D提取即完成)，所制備的SOD很少流失或變性失活，而現(xiàn)有的制備工藝需要十幾道工序， 多種方法處理，大部分SOD在處理過程中流失或變性失活。本發(fā)明方法所制備的S0D活力 能達到8000u/mg以上，甚至能達到9221u/mg個活力單位。而現(xiàn)有方法所制備SOD的活力 大多在2500u/mg-4000u/mg之間。 3、用時短本發(fā)明方法從開始生產(chǎn)到出成品S0D只需幾個小時，而現(xiàn)有的工藝需 要耗時100個小時左右，與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明方法顯著的節(jié)省了人力、物力和時間。
4、產(chǎn)率高采用本發(fā)明方法制備S0D，每公斤血塊可生產(chǎn)50萬個活力單位的S0D，采用同樣的原料，現(xiàn)有的方法只能生產(chǎn)出1萬-10萬個活力單位S0D。 5、成本低本發(fā)明方法生產(chǎn)SOD的工藝過程簡單、原料要求低、設(shè)備要求低，故生 產(chǎn)成本也得以大幅度的降低。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
實施例1 1.取100kg牛凝血塊放入攪拌罐中室溫攪拌，攪拌時加入蛋白沉淀劑(由以下三
種組分混合在一起而得5-磺基水楊酸0. lkg，硫酸鉀7. 5kg和蒸餾水1. 5kg) 1L，持續(xù)攪拌
20分鐘；先用80目濾網(wǎng)過濾，然后用板框過濾器過濾，收集濾液； 2.取濾液用高速管式離心機離心(轉(zhuǎn)速16000rpm)，取上清液，備用； 3.將上清液用板式膜超濾器進行第一次超濾，膜孔徑為50000D，取濾出液，備用； 4.將步驟3所得到的濾出液經(jīng)板式膜超濾器進行第二次超濾，膜孔徑為30000D，
取截流液，備用。 5.取截流液進行冷凍干燥，首先在零下20 17°C的溫度條件下凍干6 8h ;然 后在零下10 7t:溫度條件下持續(xù)凍干2h ;凍干結(jié)束后，升溫至2(TC，收集凍干粉，裝入無 菌袋中，密封，得S0D成品，零下4t:保存。經(jīng)檢測，本發(fā)明方法的收率為50萬個活力單位的 SOD/kg血i央，酶活性為4000 12000u/mg。
實施例2 1.取100kg豬凝血塊放入攪拌罐中室溫攪拌，攪拌時加入蛋白沉淀劑(由以下三 種組分混合在一起而得5-磺基水楊酸0. 15kg，硫酸鉀8. 5kg和蒸餾水2. 5kg) 1L，持續(xù)攪 拌15分鐘；先用60目濾網(wǎng)過濾，然后用板框過濾器過濾，收集濾液；
2.取濾液用高速管式離心機離心，取上清液，備用； 3.將上清液用板式膜超濾器進行第一次超濾，膜孔徑為50000D，取濾出液，備用；
4.將步驟3所得到的濾出液經(jīng)板式膜超濾器進行第二次超濾，膜孔徑為30000D， 取截流液，備用。 5.取截流液進行冷凍干燥，將凍干溫度零下42°C ，首先在零下20 17°C的溫度條 件下凍干6 8h ;然后在零下10 7t:溫度條件下持續(xù)凍干2h ;凍干結(jié)束后，升溫至20°C ， 收集凍干粉，裝入無菌袋中，密封，得SOD成品，零下4t:保存；經(jīng)檢測，本發(fā)明方法的收率為 50萬個活力單位的SOD/kg血塊，酶活性為4000 12000u/mg。
實施例3 1.取100kg羊凝血塊放入攪拌罐中室溫攪拌，攪拌時加入蛋白沉淀劑(由以下三 種組分混合在一起而得5-磺基水楊酸0. 12kg，硫酸鉀8kg和蒸餾水2kg) 1L，持續(xù)攪拌25 分鐘；先用120目濾網(wǎng)過濾，然后用板框過濾器過濾，收集濾液；
2.取濾液用高速管式離心機離心，取上清液，備用。 3.將上清液用板式膜超濾器進行第一次超濾，膜孔徑為50000D，取濾出液，備用；
4.將步驟3所得到的濾出液經(jīng)板式膜超濾器進行第二次超濾，膜孔徑為30000D, 取截流液，備用。 5.取截流液進行冷凍干燥，將凍干溫度零下42°C ，首先在零下20 17°C的溫度條 件下凍干6 8h ;然后在零下10 7t:溫度條件下持續(xù)凍干2h ;凍干結(jié)束后，升溫至20°C ， 收集凍干粉，裝入無菌袋中，密封，得SOD成品，零下4 °C保存。
權(quán)利要求
一種超氧化物歧化酶的制備方法，包括(1)將動物凝血塊一邊攪拌一邊加入蛋白質(zhì)沉淀劑，過濾，收集濾液；(2)將濾液離心，取上清液，超濾，取截流液，冷凍干燥，收集凍干粉，即得。
2. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于所述的動物凝血塊是豬、?；蜓虻哪獕K。
3. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)沉淀劑由以下重量份的組 分組成5-磺基水楊酸1 1. 5份，硫酸鉀75 85份和15 25份蒸餾水。
4. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于步驟(1)中按重量百分比計算，向動物凝血塊中加入1%的蛋白質(zhì)沉淀劑。
5. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的過濾是先用60-120目 濾網(wǎng)過濾第1次，再用板框過濾器過濾第2次。
6. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的超濾采用板式膜超濾 器進行超濾。
7. 按照權(quán)利要求6的制備方法，其特征在于所述的超濾是采用板式膜超濾器超濾2 次，其中，第1次超濾所用板式膜超濾器的膜孔徑為50000D，第2次超濾所用板式膜超濾器 的膜孔徑為30000D。
8. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的冷凍干燥在零下42t: 的溫度條件下進行冷凍干燥。
9. 按照權(quán)利要求8的制備方法，其特征在于所述的冷凍干燥是首先在零下20 17°C 的溫度條件下凍干6 8小時，然后在零下10 7t:的溫度條件下凍干1-3小時。
10. 按照權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于步驟(2)中在冷凍干燥完成之后，將溫 度升至2(TC，再收集凍干粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超氧化物歧化酶的制備方法，包括(1)將動物凝血塊一邊攪拌一邊加入可消化雜蛋白的清除劑，過濾，收集濾液；(2)將濾液離心，取上清液，超濾，取截流液，冷凍干燥，收集凍干粉，即得。本發(fā)明方法制備工藝簡捷，不需要復(fù)雜的生產(chǎn)設(shè)備，生產(chǎn)成本低，環(huán)境友好，產(chǎn)率高，所制備的超氧化物歧化酶活力高，可適合進行工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/08GK101717756SQ200810148899
公開日2010年6月2日 申請日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者李紹銘 申請人:哈爾濱仁皇藥業(yè)股份有限公司