專利名稱：：一種化橘紅藥材的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種藥材的質(zhì)量控制方法，特別涉及化橘紅藥材的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
：RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)，即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，是1990年由Williams等和Welsh等發(fā)展起來的一項(xiàng)DNA分子標(biāo)記技術(shù)。RAPD技術(shù)是建立在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，它用一系列不同的隨機(jī)排列堿基序列的寡核苷酸單鏈作為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行單引物擴(kuò)增，完成DNA合成。重復(fù)上述過程，即可產(chǎn)生片段大小不等的擴(kuò)增產(chǎn)物，通過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物片段的多態(tài)性反映了基因組DNA的多態(tài)性。根據(jù)現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究，中藥材(不含礦物藥)所依賴的生物資源"物種"的多樣性是由于其基因多態(tài)性的結(jié)果，而基因多態(tài)性可在DNA分子診斷技術(shù)水平上檢測(cè)，這比在形態(tài)、組織和化學(xué)水平上檢測(cè)更能代表其變異類型的遺傳標(biāo)記。RAPD技術(shù)所需待檢樣品少，而且快速、簡(jiǎn)便。中藥化橘紅為蕓香科植物化州柚C/trasgra/^is'Tomentosa'或柚C/^t/sgr朋c/A(L.)0sbeck的未成熟的外果皮?；蓁质菑V東省化州市特有的樹種，其未成熟的干燥外層果皮即作為化橘紅入藥，習(xí)稱"毛橘紅"，系道地藥材，品質(zhì)最優(yōu)，曾列為皇室專用祛痰圣藥。柚外果皮1977年才被作為化橘紅入藥，習(xí)稱"光橘紅"，其藥材雖非道地化橘紅，其主要活性成分含量較低，藥理功效不如"毛橘紅"?；偌t氣芳香，味苦、微辛，歸肺、脾經(jīng)，具散寒，燥濕，利氣，消痰等功效，用于風(fēng)寒咳嗽，喉癢痰多，食積傷酒，嘔惡痞悶?；偌t富含黃酮類成分，其中柚皮苷、野漆樹苷均為活性成分。"毛橘紅"主產(chǎn)于廣東省化州市，己有1500多年的種植歷史，但至20世紀(jì)90年代初，僅存化州柚?jǐn)?shù)百株，物種面臨瀕危。目前，己出現(xiàn)大規(guī)?；偌tGAP產(chǎn)業(yè)化基地，而如何保證藥材質(zhì)量是確保化橘紅產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，現(xiàn)有技術(shù)根據(jù)形態(tài)外觀以及有效成份的含量來鑒別藥材的優(yōu)劣，從基因水平控制原藥材的質(zhì)量，未見報(bào)道
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種從基因水平對(duì)化橘紅藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的方法。本發(fā)明的化橘紅藥材的質(zhì)量控制方法，包括以下步驟(1)提取道地化橘紅藥材和待檢測(cè)藥材的基因組DNA;(2)將所提取的基因組DNA分別以序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；(3)用瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離；(4)比較待檢測(cè)樣品和道地化橘紅藥材的電泳圖對(duì)重復(fù)性好且清晰的條帶記數(shù)，有帶計(jì)為l，無帶計(jì)為O,得到l、0矩陣數(shù)據(jù)，按公式F=2NXY/NX+NY，D=l-F，計(jì)算待檢測(cè)藥材和道地藥材遺傳差異指數(shù)D，其中F為共享度，IV為檢測(cè)品種和良種共享的RAPD標(biāo)記數(shù),Nx，N、分別為待檢測(cè)藥材和道地藥材擁有的RA—PD標(biāo)記數(shù)；當(dāng)遺傳差異指數(shù)小于0.13或等于時(shí)，認(rèn)為是道地藥材。本發(fā)明所述的方法，其中步驟(4)，將待檢測(cè)樣品的DNA指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)頭A指紋圖譜進(jìn)行比較，遺傳差異指數(shù)優(yōu)選小于或等于0.09，系為優(yōu)良藥材，更優(yōu)選小于或等于O.Ol，系為優(yōu)等藥材。本發(fā)明的方法，.其中步驟A可以采用常規(guī)的方法提取植物基因組訓(xùn)A，也可以使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行提取。通過對(duì)不同DNA模板濃度、不同Taq酶濃度、不同鎂離子濃度以及不同底物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，瓊脂糖電泳檢驗(yàn)，優(yōu)選地，選擇60100ngDNA/25uL模板濃度，1.01.8U/25uL的Taq酶濃度，1.21.8mM的鎂離子濃度，170250uM的dNTPs進(jìn)行，退火溫度3436°C;最優(yōu)選地，選擇80ngDNA/25uL模板濃度，1.5U/25uL的Taq酶濃度，1.5mM的鎂離子濃度，200wM的dNTPs,循環(huán)參數(shù)為94°C，4min;隨后94。C，lmin;35°C，lmin;72°C，2min，43個(gè)循環(huán);最后72。C，7min。傳統(tǒng)上，通常是采用通過外觀觀察和測(cè)定活性成分等綜合方法來判斷化橘紅藥材的質(zhì)量，本發(fā)明的方法和傳統(tǒng)方法能夠很好地吻合。另外，RAPD技術(shù)方法快速、簡(jiǎn)便，只需要少量樣本即可實(shí)現(xiàn)，然而，其最大的缺點(diǎn)就是穩(wěn)定性較差，重復(fù)性不理想，本發(fā)明經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)，篩選出適合的實(shí)驗(yàn)條件，本方法穩(wěn)定而又重復(fù)性好，得到了待檢測(cè)藥材和道地藥材遺傳上的關(guān)系，可以保障從基因水平選擇良種，從源頭上保證藥材的質(zhì)量。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中的道地化橘紅藥材，系產(chǎn)自廣東化州產(chǎn)的蕓香科植物化州柚67trwgraW//s"Tomentosa"，黃酮類成分、柚皮苷和野漆樹苷含量高，具有特征性的HP1X指紋圖譜，并具有較好的祛痰、抗炎和鎮(zhèn)咳作用(林勵(lì)等，兩種化橘紅的質(zhì)量鑒別，廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001年，21(4):308-312)。例如，可以采用下述的傳統(tǒng)方法綜合判斷化橘紅的質(zhì)量(1)植物形態(tài)分類法定期采集毛橘紅與光橘紅原植物標(biāo)本，按照植物形態(tài)分類法對(duì)其原植物作比較。毛橘紅與光橘紅原植物形態(tài)主要區(qū)別見表1。(2)毛橘紅與光橘紅原植物顯微特征比較，結(jié)果見表2莖葉切片處理友法取生長(zhǎng)年限相同，直徑相近的化州抽與抽的莖以滑走切片法切成25yra厚的薄片。將此薄片以番紅和固綠進(jìn)行染色后，依次以低濃度到高濃度的乙醇進(jìn)行脫水、低濃度到高濃度的二甲苯進(jìn)行透明，最后以加拿大樹脂封片，晾干，得化州柚和柚莖的永久制片。取生長(zhǎng)年限相同,大小和厚度相近的化州柚與柚的葉片以蠟包埋后滑走切片法切成30ym厚的薄片，再照莖切片處理方法，得化州柚和柚葉的永久制片，于顯微鏡下觀察。(3)總黃酮含量測(cè)定方法(袖皮苷十鋁鹽分光光度法)分別準(zhǔn)確吸取抽皮苷對(duì)照品溶液(6.2mg/mL)0、1、2、3、4、5mL于25mL量瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確加人i00mL硝酸鋁lml，搖勻，以缺對(duì)照品者為空白對(duì)照，分別測(cè)定其在384nln處的吸收度值；以吸取量(mL)為橫坐標(biāo)，吸收值為縱坐標(biāo)，求得抽皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為-Y=0.1868x-0.0208，/=0.999%。精密稱定化橘紅約0.29，分別置索氏提取器中，加人乙醚90mL，提取至無色，棄去乙醚提取液，再加甲醇90mL，提取至無色，甲醇液放冷，移至量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別取定量供試品溶液與對(duì)照品溶液依法測(cè)定，在150min內(nèi)穩(wěn)定性均良好，加樣回收率為102.95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.42%，重現(xiàn)性、精密度均良好。(4)柚皮苷含量測(cè)定方法(高效液相色譜法)色譜柱LiChrospherIOO(RP-18c，5um，250mmx4咖，Merck);流動(dòng)相V甲醉V冰醋酸V水=35:4:61，過0.45um濾膜;流速:1.OnL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):283腿;柱溫40'C。準(zhǔn)確稱取袖皮普對(duì)照品，加甲醇溶解，制成90mg/L的溶液，作為對(duì)照品溶液。分別準(zhǔn)確吸取柚皮苷對(duì)照品溶液2'，4，6，8，10uL注人高效液相色譜儀，按上述條件進(jìn)行測(cè)定，以柚皮苷量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求得柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程5為Y4625.66909x+9.36902，嚴(yán)O.99992。精密稱取化橘紅約0.lg，分別置索氏提取器中，加人石油醚90mL,提取至無色，棄去乙醚提取液，再加甲醇90mL，提取至無色，甲醇液放冷，移至100mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別定量取供試品溶液與對(duì)照品溶液適量，按外標(biāo)峰面積法測(cè)定柚皮苷含量。加樣回收率為100.2%(RSD=2.43%)，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度均良好。(5)野漆樹普含量測(cè)定方法(薄層掃描法)準(zhǔn)確稱取野漆樹苷對(duì)照品，加甲醇溶解，制成270mg/L的溶液，作為對(duì)照品溶液。取化橘紅約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，加人石油醚90mL，提取至無色，棄去醚提液，再加甲醇90mL，提取至無色，移出濃縮、放冷，再移至10raL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別定量取供試品溶液與對(duì)照品溶液適量，以定量毛細(xì)管點(diǎn)樣于GF254預(yù)制薄層板上。展開劑a:V'配酷V醜:V水^10:5:9，搖勻、放置待分層后取上層液10mL+丙酮lml+甲酸0.02ml;展開劑b:V乙酸乙酯-V丙酮:V*=V=10:5:9，搖勻、放置待分層后取上層液lOmL十丙酮lmL。先用展開劑a上行展開，展距8cm，取出晾干后，再用展開劑b展開，展距8cm，取出，晾干，105'C烘15min，放冷，作光譜掃描，對(duì)照品色點(diǎn)與供試品色點(diǎn)均在A=342nm處有最大吸收峰，確定掃描波長(zhǎng)為342nm。準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5uL于同一薄層板上，先后用a、b展開劑展開2次，取出，晾干，掃描。掃描條件:飛點(diǎn)掃描，X二342nm處進(jìn)行。以面積值為縱坐標(biāo)，點(diǎn)樣量為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=103099.266X+13126.960，產(chǎn)0.999，按外標(biāo)峰面積法測(cè)定野漆樹苷含量。加樣回收率為95.17%(尺50=2.50%)，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度均良好。(6)指紋圖譜比較方法(高效液相色譜法)色譜柱MACHEREY-NAGEL(100-5C18，5um，250腿x4.6mm);經(jīng)考察確定流動(dòng)相A:甲醇，B:V水:V冰翻二61:4，梯度洗脫;流速1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):283nm(345nm為輔助參考波長(zhǎng))；柱溫:25'C。以柚皮苷、野漆樹苷、柚皮苷元對(duì)照品為參照物，取同一份供試品溶液，分別在O、1.5、3.5、5.5、25、27h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，考察保留時(shí)間和峰面積的一致性，柚皮苷的保留時(shí)間RSD和峰面積RSD分別為0.279y。和2.68y。，穩(wěn)定性良好。取同一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，考察色譜峰保留時(shí)間和峰面積的一致性，柚皮苷的保留時(shí)間RSD和峰面積RSD分別為0.304%和2.04%，精密度良好。小結(jié)毛橘紅原植物化州柚為光橘紅原植物柚的變種，兩者親緣關(guān)系雖近，但樹高、果實(shí)等原植物形態(tài)已有明顯差異(見表l)，其莖、葉的構(gòu)造差異也很明顯(見表2)。毛橘紅總黃酮含量高于光橘紅，其中主要活性成分柚皮苷的含量也高于光橘紅，兩種活性成分含量的主要差異為野漆樹苷，毛橘紅野漆樹苷含量為6.16-8.84mg'g—'，而光橘紅野漆樹苷含量?jī)H為其1/10左右，具有顯著性差異；此差異也造成兩者HPLC指紋圖譜的各自特點(diǎn)，兩者均以柚皮苷為第1高峰，但毛橘紅以野漆樹苷為此高峰，而光橘紅野漆樹苷僅為第4或第5高峰，此差異與兩者圖譜中的其他特征峰一起，構(gòu)成了易于鑒別兩者的特征性指紋圖譜(林勵(lì)等，兩種化橘紅的質(zhì)量鑒別，廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001年，21(4):308-312)。表1毛橘紅與光橘紅原植物形態(tài)主要區(qū)別<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2毛橘紅與光橘紅原植物顯微特征主要區(qū)別<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本發(fā)明的化橘紅藥材的質(zhì)量控制方法，其中步驟A可以采用常規(guī)的方法提取植物基因組DNA,也可以使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行提取。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員不需要過度實(shí)驗(yàn)就能夠選擇適合的提取方法。本發(fā)明通過對(duì)不同DNA模板濃度、不同Taq酶濃度、不同鎂離子濃度以及不同底物濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選，瓊脂糖電泳檢驗(yàn)表明，結(jié)果非常穩(wěn)定，重復(fù)性好。選擇結(jié)果如下選擇60100腦A/25uL模板濃度，例如可以是60ngDNA/25nL、70ngDNA/25yL、80ngDNA/25uL、90ngDNA/25iiL或100ngDNA/25uL;選擇1.01.8U/25uL的Taq酶濃度，例如可以是1.0U/25uL、1.1U/25uL、1.2U/25PL、1.3U/25uL、1.4U/25nL、1.5U/25uL、1.6U/25uL、1.7U/25uL或1.8U/25PL;選擇1.21.8mM的鎂離子濃度，例如可以是1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM或1.8mM;選擇170250uM的dNTPs，退火溫度3436。C，例如可以是170uM、180uM、190uM、200、210uM、220uM、230uM、240uM或250線最優(yōu)選地，選擇80ngDNA/25uL模板濃度，1.5U/25uL的Taq酶濃度，1.5mM的鎂離子濃度，200uM的dNTPs，循環(huán)參數(shù)為94°C,4min;隨后94°C，lmin;35°C,lmin;72°C，2min，43個(gè)循環(huán)；最后72'C，7min。通過本發(fā)明的方法，得到的檢測(cè)結(jié)果和傳統(tǒng)方法的檢測(cè)結(jié)果吻合度非常好。下面結(jié)合實(shí)施例具體說明本發(fā)明，實(shí)施例只是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步闡述，幫助理解本發(fā)明，而不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和材料儀器BSllO-電子天平(S，O.lmg);北京市六一儀器廠DYY-6C型電泳儀；Beckman-15CSR冷凍高速離心機(jī)；PCR儀(PE2400);純水儀(MilliporeQ-R);UVPGDS7600型凝膠成像儀；TECANSpectraFLUORplus多功能酶標(biāo)儀。試劑賽百盛GoidVoew染料；Biowestagarose(regular);上海生工SK2492型PCR擴(kuò)增試劑盒；上海生工隨機(jī)引物(序列表中序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11);上海申能博彩3s柱離心式植物基因組隨A試劑盒。實(shí)驗(yàn)材料標(biāo)準(zhǔn)品道地化橘紅(毛橘紅，化州柚C.grandis'Tomentosa，)樣品來自廣東化州基地老虎嶺(試驗(yàn)號(hào)Sn5)，采于2005.04.21,經(jīng)廣東省中藥研究所丘金裕主任中藥師鑒定。其藥材總黃酮含量不低于以柚皮苷計(jì)不低于11.5%，柚皮苷含量不低于9.0%,野漆樹苷含量不低于0.6%，具有特征性的HPLC指紋圖譜，并具有較好的祛痰、抗炎和鎮(zhèn)咳作用。待側(cè)樣品來源見下表-表l樣品來源試驗(yàn)號(hào)采收地點(diǎn)采收時(shí)間藥材名原植物學(xué)名Snl廣東化州李家園05.04.20Sn2廣東化州山車磚廠05.04.20Sn3廣東化州麗崗05.04.20Sn4廣東化州基地苗圃邊05.04.21Sn6廣東化州積田村小學(xué)05.04.21Sn7廣東化州積田門口坡05.04.21Sn8廣東化州積田大樹05.04.21Sn9廣東化州基地施肥區(qū)05.04.21SnlO廣東化州基地大茶嶺05.05.21Snll廣東化州基地農(nóng)中05.05.21Snl2廣西陸川清湖鎮(zhèn)旺村05.05.22Snl3廣西陸川清湖鎮(zhèn)秧地坡l05.05.22Snl4廣西陸川清湖鎮(zhèn)秧地坡205.05.22Snl5廣西陸川清湖鎮(zhèn)三水村l05.05.22Snl6廣西陸川清湖鎮(zhèn)三水村205.05.22Snl7廣西陸川古城鎮(zhèn)石嘴村05.05.22Snl8廣西陸川古城鎮(zhèn)樓腳小學(xué)05.05.22Snl9廣西陸川古城鎮(zhèn)下低坡村05.05.22Sn20廣東化州建設(shè)農(nóng)場(chǎng)高嶺七隊(duì)05.05.23Sn21廣東廣州龍洞省醫(yī)藥學(xué)校05.05.30Sn22江西黃崗謝家村旁05.07.14Sn23江西黃崗謝家村旁05.07.14C"ms^ra/7c/ys'Tomentosa'C.jgraW/s'Tomentosa''Tomentosa''Tomentosa''Tomentosa，'Tomentosa，'Tomentosa，毛橘紅化州柚毛橘紅化州柚毛橘紅化州柚C^^3力'S毛橘紅化州柚C^ra/7C^9毛橘紅化州柚C:^"a/7力's毛橘紅化州柚Cgrs//j\s-毛橘紅化州柚Cgra/3Ws光青柚(變種)C.gr朋c^sHow副毛橘紅化州柚(芽接苗)C^r朋o^s'Tomentosa'副毛橘紅化州柚(實(shí)生苗)61gra/w7s'Toraentosa'毛橘紅化州柚C5ra/3rf^'Tomentosa'副毛橘紅化州柚(變種)Cl^gra/M^s'Tomentosa，毛橘紅化州柚61《ra/K/is'Tomentosa'毛橘紅化州柚(變種)C.grafiJ/s'Tomentosa'毛橘紅化州柚C.gra/3(/j'51'Tomentosa'光橘紅柚(S:gra/o7sHow副毛橘紅化州柚(變種)C《r朋o7s'Tomentosa，光橘紅柚C^ra"fl7sHow光青柚(變種)C議朋力^How毛橘紅化州柚6:gra"o^'Tomentosa，枳殼(香橙)酸橙C朋r朋"鵬L,枳殼(臭橙)酸橙C朋ra/fi柳L.*基地即化州市綠色生命有限公司基地實(shí)驗(yàn)方法(1)標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜的建立DNA提取采用上海申能博彩公司的3s柱離心式植物基因組DNA試劑盒提取。稱取樣品干燥葉片約150mg，加石英砂研磨，按試劑盒使用說明方法進(jìn)行。DNA擴(kuò)增體系反應(yīng)體積為25yl。其成分為MgCl21.5ul(25mmol/L)，引物1.2y1(10umol/L)，dNTPs2.5nl(2ramol/L)，10Xbuffer緩沖液2.5y1，0.3nlTaq酶U/ul，80ngDNA樣品。循環(huán)參數(shù)為94°C，4min;隨后94。C，lmin;'35。C，lmin;72°C，2min;43個(gè)循環(huán)；最后72。C，7min。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA進(jìn)行電泳分離并拍照；(2)待檢測(cè)樣品的DNA指紋圖譜的獲得按照標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜的建立同樣的方法進(jìn)行；(3)將待檢測(cè)樣品的DNA指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜進(jìn)行比較對(duì)凝膠紫外成像系統(tǒng)中重復(fù)性好且清晰的條帶記數(shù)，有帶計(jì)為1,無帶計(jì)為0，得到l、0矩陣數(shù)據(jù)，按公式F=2NXY/NX+NY，D=l-F，計(jì)算帶檢測(cè)品種和良種之間遺傳差異指數(shù)D,其中F為共享度；NxY為檢測(cè)品種和良種共享的RAPD標(biāo)記數(shù)；Nx，隊(duì)分別為檢測(cè)品種和良種擁有的RAPD標(biāo)記數(shù)。待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品之間的遺傳差異指數(shù)見表2。表2.遺傳差異指數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>由表中可見，Sn4與標(biāo)準(zhǔn)品Sn5之間的遺傳差異指數(shù)等于0.01，是優(yōu)等道地藥材；Sn6、Sn7和Sn8與標(biāo)準(zhǔn)品Sn5之間的遺傳差異指數(shù)小于0.09，是優(yōu)良道地藥材；Snl4與標(biāo)準(zhǔn)品Sn5之間的遺傳差異指數(shù)小于O.13，認(rèn)為是普通道地藥材；而樣品Snl、Sn2、Sn3、Sn9、SnlO、Snll、Snl2、Snl3、Snl5、Snl6、Snl7、Snl8、Snl9、Sn20、Sn21、Sn22及Sn23與標(biāo)準(zhǔn)品Sn5之間的遺傳差異指數(shù)大于0.13，認(rèn)為不是道地藥材。采用前述傳統(tǒng)方法評(píng)價(jià)上述藥材，道地藥材具有特征性的外觀，柚皮苷和野漆樹苷含量高，并且具有特征性的HPLC指紋圖譜。特別是野漆樹苷，采用本發(fā)明的方法鑒定的優(yōu)等道地藥材野漆樹苷含量平均為9mg*g—'，優(yōu)良道地藥材野漆樹苷含量為8mg*g'，而普通道地藥材，野漆樹苷含量為6mg，g'。兩種方法吻合很好。從上述結(jié)果來看，決定藥材品質(zhì)的，產(chǎn)地是一方面，另一方面更重要的是其基因型。釆用本發(fā)明的方法，可以非常簡(jiǎn)單快捷地確定道地藥材和非道地藥材，以及道地藥材的品質(zhì)，為化橘紅的大規(guī)模種植提供重要的技術(shù)支持。本發(fā)明的實(shí)施例，只是作為一個(gè)例子來具體說明本發(fā)明，本發(fā)明的其它技術(shù)方案，同樣也能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。序列表〈110〉所有申請(qǐng)人姓名或名稱〈120〉一種化橘紅藥材的質(zhì)量控制方法〈160〉10〈210〉1〈211〉10<212>DNA〈213〉人工序列<220〉〈223〉引物〈400〉1ccttgacgca〈220〉<223>引物〈400〉2ggaggtgtt〈220〉<223〉引物〈400〉3ccacagcagt〈220〉〈223〉引物〈400〉4aatcgggctg〈220〉12〈223〉引物<400〉5gaccgcttgt〈220〉〈223〉引物〈400〉6ttggcacggg〈220〉<223〉引物〈400>7ggtctacacc〈220〉〈223〉引物<■〉8gagagccaac〈220〉<223〉引物〈400〉9ccgcatctac〈220〉<223〉引物〈400〉10gtcccgacga〈220〉〈223〉引物<400〉11gg.cactgagg權(quán)利要求1.一種化橘紅藥材的質(zhì)量控制方法，包括以下步驟(1)提取道地化橘紅藥材和待檢測(cè)藥材的基因組DNA；(2)將所提取的基因組DNA分別以序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；(3)用瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離；(4)比較待檢測(cè)樣品和道地化橘紅藥材的電泳圖對(duì)重復(fù)性好且清晰的條帶記數(shù)，有帶計(jì)為1，無帶計(jì)為0，得到1、0矩陣數(shù)據(jù)，按公式F＝2NXY/NX+NY，D＝1-F，計(jì)算待檢測(cè)藥材和道地藥材遺傳差異指數(shù)D，其中F為共享度，NXY為檢測(cè)品種和良種共享的RAPD標(biāo)記數(shù)，NX，NY分別為待檢測(cè)藥材和道地藥材擁有的RAPD標(biāo)記數(shù)；當(dāng)遺傳差異指數(shù)小于0.13或等于時(shí)，認(rèn)為是道地藥材。2.如權(quán)利要求l的方法，其中步驟(4)的遺傳差異指數(shù)小于或等于0.09。3.如權(quán)利要求2的方法，其中步驟(4)的遺傳差異指數(shù)小于或等于O.Ol。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟B進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中模板濃度是60100ng5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟B進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中Taq酶濃度為1.0L8U/25pL。6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟B進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中鎂離子濃度為1.21.8mM。7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟B進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系中dNTPs為170250nM/25nL進(jìn)行。8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟B進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的退火溫度為3436'C。9.如權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟B進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板濃度是80ngDNA/25PL，Taq酶濃度是1.5U/25uL，鎂離子濃度是1.5mM，dNTPs是200nM進(jìn)行，循環(huán)參數(shù)為94°C，4min;隨后94。C,lmin;35°C，lmin;72°C，2min,43個(gè)循環(huán)；最后72。C，7min。全文摘要本發(fā)明提供了一種從基因水平對(duì)化橘紅藥材進(jìn)行質(zhì)量控制的方法，包括以下步驟(1)提取道地化橘紅藥材和待檢測(cè)藥材的基因組DNA；(2)將所提取的基因組DNA分別以序列1、2、3、4、5、6、7、8、9、10和11為引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；(3)用瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離；(4)比較待檢測(cè)樣品和道地化橘紅藥材的電泳圖。本方法穩(wěn)定而又重復(fù)性好，得到了待檢測(cè)藥材和道地藥材遺傳上的關(guān)系，可以保障從基因水平選擇良種，從源頭上保證藥材的質(zhì)量。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101559123SQ200810152398公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2008年10月21日優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日發(fā)明者勵(lì)林,歐劍鋒申請(qǐng)人:廣州綠色生命藥業(yè)有限公司