專利名稱：一種適合于維生素e代謝工程的種子特異性啟動(dòng)子的制作方法
一種適^1 E糊IS的種辨異14^動(dòng)子
獄細(xì):本發(fā)明屬于生物1 ^領(lǐng)域。具微膽鵬中分離到一種種鄰異鵬
動(dòng)子，^動(dòng)子能W^tk驅(qū)動(dòng)纟姓素E^^xS有^因^at物中的^i，為^^EftmiS
背景獄鄉(xiāng)t^E是8種生wm類化溯的總稱，僅由植物和^t飾菌所合成，為 iSf人體正常生理功t^f必需。它作為一#*)!(:^化劑，可以清除機(jī)體用氧時(shí)0^放的自由基，延 緩鼓，^f肌肉、中樞神錢郷血管正常鄉(xiāng)，臨^J:可用來治療與預(yù)防高腿、逾il禍、 心mSS、動(dòng)脈硬化、血栓、不孕癥、^S^賺。在8種^^E中，a-生W^fS14m高，且 最容易駄體艦收。目前，植糊^AI^然鄉(xiāng)t^ E攝取的錢來源。然而在大多雖物種 子中，、 14*高的a-生WB^MI艮低，如豆油中，^14ft高的a-生Wm^M僅占7%,而^I4很 低6 1^式，生^# 卻高達(dá)70%，魏t^E總WS14很低。艦微瑰,鵬高
油料種子中a-生WS^ft^l^E，:iB6^i^^面。種^f^異^動(dòng)子的^已^jg^
植^子成5^:的觀環(huán)節(jié)。
目1 1^##鵬動(dòng)子的研魅要局限^~^^子貯存蛋白基因上，如X^S^貯
存蛋白^^球蛋白、P"伴球蛋白和油菜中i^e存蛋白— 究。而且，調(diào)^ie存蛋白胚乳特 異性^s因的上游序列B^nasffl于植物脂的微:cg中。然而不同儲(chǔ)糊質(zhì)的合成與積累
獻(xiàn)不同，魏驅(qū)動(dòng)貯存蛋白的啟動(dòng)子鵬i^l^E等脂^m工程中可倉繼狩嘬ft^。 如有資3lWt, napin啟動(dòng)子在種子K^發(fā)育^t^掛卜,因^i。維生素E屬^J^種月離性 物質(zhì)，它在植,內(nèi)的^m^尚;^楚。但皿^^E在植,子中的功^i，它的積累 ^1S該與種子油脂的積^^ffi關(guān)。
脂肪^M^H^—種多酶復(fù)合體，廣泛雜升字花^^屬等油料作物中。總合體定 位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，由四種功能相^S^，催化18C脂肪^^的延伸^m^旨肪酸，如花生 四,、^#。 3-醐旨酰-COA合^i該多酶復(fù)M的^i^分，是^旨肪^^^的限 娜，^^著脂肪^l^的被,因此又被稱為脂肪^E^1^^ 1 (fetty acidelongase 1, FAE1)。我們克隆了該基因的啟動(dòng)子，并證實(shí)它是一種適舒維生素E代謝工程的種預(yù)異腿動(dòng)子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的^Jii共一種,于維生素E代謝工程的啟動(dòng)子。 本發(fā)明在于使維生素E代謝相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效,，以刻艮JC存蛋白啟動(dòng)子在
種子胚胎發(fā)育晚期;^旨導(dǎo)夕卜源基因^i的缺陷，從而增加目的基因^l^種子中的積累量。
本發(fā)明所述的適^B隹生素E代謝工程的種，異性啟動(dòng)子FAE1 ，其核^Mff列，列表所
示的序列。
本發(fā)明還提供了含有上述啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pMD18-T-FAEl于IMT和植物表達(dá)載體 pFAEl-!ML
本發(fā)明戶腿的啟動(dòng)子FAE1應(yīng)用于維生素E代謝工程中，能W^她驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生飾甲雜移麟 因在轉(zhuǎn)基因大豆中的^fe將野生型種子中占優(yōu)勢形式的Y-生Wm和S-生育酚分別^轉(zhuǎn)化成 a-生育酚和P-生飾。
圖1是種鄰異'腿動(dòng)子FAE1片斷的電泳圖，M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(bp); 1,2: FAE1啟動(dòng)子的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2是重組^pMD18-T-FAEl-TMT的酶切分析，M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(bp); 1， 3， 5， 7: /M膨?qū)酶切；2， 4， 6， 8:/MI脇I酶切；
圖3是pFAEl-TMT重M粒的酶切鑒定，M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(bp) ; 1,2:1雙
酶切；
圖4是種鄰異性^ii載體的示意圖，pFAEl: FAE1啟動(dòng)子；？麗，生育酚甲難移酶 基因；UTT和NOS"T:録終鵬列；NPTII:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；
圖5是轉(zhuǎn)基因^S在卡那霉素抗性培養(yǎng)基上的篩選，抗性芽生長正常，葉片為、 色，而非 抗性芽葉片為灰白色；
圖6是轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定，其中1,2,3,4是不同轉(zhuǎn)基因株系，5，是陰1^j"照；6是陽性 對照；鄉(xiāng)例l、啟動(dòng)子分離施
本發(fā)明戶皿的適^i隹生素E代謝工程的種，異性啟動(dòng)子擬mMF異性啟動(dòng)子分離方,
括下述步驟
(1) 提取擬南，因組DNA;
(2) 設(shè)計(jì)并合働口下兩條引物；
引物l 5'《cccaagcttctagtagattg改ggttggtttcco3' 下劃線為iZ/wdl鵬切位點(diǎn) 引物2 5'-aaaactgcaetgctotgtttgtgtcggaaaataat陽3'下劃線為尸wl酶切位點(diǎn)，
(3) 以擬南芥葉片基因組DNA為模板擴(kuò)增FAE1基因啟動(dòng)子片斷。PCR體系為15 mL，包含3 nmol dNTPs、 1.9pmol每種弓l物、0.375 U BlendT叫DNA聚合,口 50 ng基因組DNA。 PCR^f牛 為94。C5min; 94。C40s; 58。C32s; 72。C100s; 40個(gè)循環(huán)；72。C7min; 4。C保存。
(4) 純化后的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMD18-T7-TMT分別進(jìn)行所wdlI/尸W I雙酶切，10 ^酶切體系 為0.3U/// dIII， 0.3U尸wl， 60ng質(zhì)粒，1 10xM緩沖液，用7JC定容至10 ^。酶切 目的產(chǎn)物用0.7%瓊月^ 分離后回收。設(shè)計(jì)酶連體系將兩個(gè)回收目的片斷連接構(gòu)鍾組 質(zhì)粒pMD18-T-FAEl于TMT， 6nL酶連反應(yīng)體系如下T-載體200ng， FAE1啟動(dòng)子片段32 ng，T4連接酶6U， 10x緩沖液0.6 ^L。重M粒pMD18-T-FAEl-y-TMT轉(zhuǎn)化;^桿菌DH5a-FT 感受態(tài)細(xì)胞，涂械含氨節(jié)青霉素(50pg/mL)的LB篩選平社，過夜培養(yǎng)。抗,選和 麟PCR篩選轉(zhuǎn)化子，再衫瞇陽性 解法小量提取質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒PCR篩選和限制 性內(nèi)切酶酶切分析，從而獲得S^M粒pMD18-T-FAEl-y-TMTo想匕京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行測 序。
織例2、本發(fā)明臓的有M^翻
方飽括下述步驟 (1) 種子特異性表込載體pFAEl-!MT的構(gòu)建
質(zhì)粒 ^18-1^^1卞1\11用歷《(1111與&/1雙酶切，回收約1.7kb片段(FAEl-TMT)。用同樣限制性內(nèi)切,酶切植物^t;體pBin438，以切除其上的Q增強(qiáng)子和CaMV35S雙啟動(dòng)子，回收大 片段。將回收得到的FAEl-TMT片段與pBin438大片段連接，轉(zhuǎn)〗tiaDH5a-FT，涂布到^20mg/L卡 那霉素的LB篩選平板上。菌落PCR，質(zhì)粒PCR及酶切鑒定如前，獲得的陽性重組子命名為 pFAEl-TMr，即為最終的植物種，異性^ii載體。同時(shí)按相同的方法構(gòu)建^S球蛋白G7啟動(dòng)子 驅(qū)脊TMim體作為對照-用CaC12法制備根癌農(nóng)桿細(xì)A權(quán)感受態(tài)細(xì)胞'用凍鵬將重鵬立 FAE1 tTMT和pGl-TMT轉(zhuǎn)皿農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。
(2) 農(nóng)桿菌介導(dǎo)將外源基因轉(zhuǎn)化旭胚尖 挑取含外源基因重M粒的農(nóng)桿菌LBA4404，接種到含20 mg/L鏈霉素和100 mg/L卡那霉
素的液體LB培養(yǎng)基中過夜，然后按^l只比l:50轉(zhuǎn)入50mL辦羊液體LB中，搖至^arU，離心 收集菌體塞"W液體共培養(yǎng)職基a/2MSB+6m^LBAP+200MM乙酰丁香酮)，調(diào)整爿6oo至0.5。 取出在培養(yǎng)基上預(yù)i歸24h的胚尖，^hM菌液中感染20h，取出胚鈔卜植體，在無菌皿上吸 T^面的菌液，轉(zhuǎn)移到固體共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗處共培養(yǎng)5^6d，用無菌7JC洗去外植體表面的農(nóng)桿菌， 再轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基(1/2MSB+0.2 mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+300 mg/L頭孢霉素)上光下25~28°C, 光照16h;Bg#， 6~7天后，再將外植^^移到篩選培養(yǎng)基(1/2MSB+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+300 mg^頭孢霉素+100 mg/L卡那霉素)JJ4行抗性篩選培養(yǎng)，每10 d繼代一次，靴性芽長至3~5咖 (大約l個(gè)月辦其切下轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，至長戯整植株。
(3) 轉(zhuǎn)基因I4物的篩選
對抗性培養(yǎng)基上再生的;te植株，用CTAB，取葉片基因組DNA，用TMT-E3/IMT-E4為 引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，f繊陽性植株。種植田間，收獲種子。
(4) 種子中各種生育i^"量的測定
稱取種子0.2~0.5&在液氮中磨碎，轉(zhuǎn)入2ml含0.8。/。丁羥甲苯的酒精中，震蕩，然后7500tpm 下離心2min去掉歹爐和碎片。濾^^(X2咖濾膜過腺放到2ml鵬管中-20。C保存，充N2千燥。 測定時(shí)重新溶解于異辛烷四氫呋喃(85: 15， W0。禾,Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國 安捷倫禾4S有限公司)系統(tǒng)測定，層析斜牛為TCC-100柱，流動(dòng)相為異辛烷四氫,(97.5:2.5， P7T)，皿固定在1.2mL'min"，檢測^^波長為290 nm， ai^波長為325nm。取3次平均值。選擇兩種不同啟動(dòng)子構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因植株各3株，種植收獲種子，然后HPLC分析測定各種生 育酚的含量，以野生^S為對照。結(jié)果如表l所示。從表l不難看出，野生型種子中Y-生W1K &生^^分別占73.2%和17.6%，在Fae啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株中，，生育酚^t化成了 a-生 ■， &生育酚^1化成了卩-生育酚，這種轉(zhuǎn)化發(fā)生得最為徹底，僅其中一個(gè)株系中含有微量 的，生育酚。相比之下，Gl啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株中，這種轉(zhuǎn)化發(fā)生的不徹底，仍有7.6~8.8% ，生飾，25~3.3%5-生育酚嚇在植株中沒有得到轉(zhuǎn)化。
表l不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因植株中M育酚的^S
株系總生育齡量 (ng/mg種子)01-生育斷％)卜生育斷％)，生育斷％)&生微％)
野生型365. 78.40.873.217.6
FAE-1378.2股910.1——
FAE-2390.687.812.1——
FAE-3386.585.614.20.2
Gl-l375.678.59.89.22.5
Gl-2367.479.28.78.83.3
Gl-3381.281.38.27.62.9
7SEQUENCE LISTING
<110〉南開大學(xué)
〈120〉一種適奸維生素E代謝工程的種辨異性啟動(dòng)子 <160〉1
<211>943 <212>DNA
<213>擬南芥 C4ra6^fo/Miy ^za&2na) <400> 1
ctagtagatt ggUggttgg tttccatgta ccagaaggct taccctatta gttgaaagtt 60 gaaactttgt tccctactca attcctagtt gtgtaaatgt atgtatatgt aatgtgtata 120 aaacgtagta cttaaatgac taggagtggt tcttgagacc gatgagagat gggagcagaa 180 ctaaagatga tgacataat taagaacgaa tttgaaaggc tcttaggttt gaatcctattc 240 gagaatgttt ttgtcaaaga tagtggcgat tttgaaccaa agaaaacatt taaaaaatca 300 gtatccggtt acgttcatgc aaatagaaag tggtctagga tctgattgta attttagact 360 taaagagtcc cttaagattc aatcctggct gtgtacaaaa ctacaaataa tatattttag 420 actatttggc cttaactaaa cttccactca ttatttactg aggttagaga atagacttgc 480 gaataaacac attcccgaga aatactcatg atcccataat tagtcagagg gtatgccaat 540 cagatctaag aacacacatt ccctcaaatt ttaatgcaca tgtaatcata gtttagcaca 600 attcaaaaat aatgtagtat taaagacaga aatttgtaga cttttttttg gcgttaaaag 660 aagactaagt ttatacgtac attttatttt aagtggaaaa ccgaaatttt ccatcgaaat 720 atatgaattt agtatatata tttctgcaat gtactatttt gctattttgg caactttcag 780 tggactacta ctttattaca atgtgtatgg atgcatgagt ttgagtatac acatgtctaa 840 atgcatgctt tgtaaaacgt aacggaccac aaaagaggat ccatacaaat acatctcata 900 gcttcctcca ttattttccg acacaaacag agca 94權(quán)利要求
1、一種適合于維生素E代謝工程的種子特異性啟動(dòng)子FAE1，其核苷酸序列是序列表所示的序列。
2、 一種含有權(quán)利要求l戶，啟動(dòng)子的重會(huì)!M粒pMD18-T-FAEl于TMT 。
3、 一種含有權(quán)利要求l戶腿啟動(dòng)子的植t^ii載體pFAEl-TMT 。
4、 權(quán)利要求1戶，的啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種適合于維生素E代謝工程的種子特異性啟動(dòng)子。本發(fā)明在于使維生素E代謝相關(guān)的基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，以克服貯存蛋白類啟動(dòng)子在種子胚胎發(fā)育晚期才指導(dǎo)外源基因表達(dá)的缺陷，從而增加目的基因產(chǎn)物在種子中的積累量。本發(fā)明所述的適合于維生素E代謝工程的種子特異性啟動(dòng)子FAE1，其核苷酸序列是序列表所示的序列。本發(fā)明還提供了含有上述啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒pMD18-T-FAE1-γ-TMT及植物表達(dá)載體pFAE1-TMT。本發(fā)明所述的FAE1應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物中，能有效地驅(qū)動(dòng)維生素E代謝相關(guān)基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)，將在野生型種子中占優(yōu)勢形式的γ-生育酚和δ-生育酚分別全部轉(zhuǎn)化成α-生育酚和β-生育酚。
文檔編號C12N15/29GK101429509SQ20081015275
公開日2009年5月13日 申請日期2008年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日
發(fā)明者明 張, 陳喜文, 陳德富 申請人:南開大學(xué)