專利名稱：6α-甲基潑尼松龍中間體的生物脫氫制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甾體藥物中間體的制備方法，特別涉及一種孕甾藥物中間體的生物脫
氫制備方法。
背景技術(shù)：
6a-甲基潑尼松龍(methylprednisolone， CAS :83-43-2 ;簡稱甲潑尼龍)是一 種皮質(zhì)激素藥物，它具有抗炎，抗內(nèi)毒素，抑制免疫，抗休克等藥理作用，可以制成臨床用針 劑，在臨床上具有非常重要的作用。分子式如下
1，2位脫氫工序甲潑尼龍生產(chǎn)過程中的一個關(guān)鍵步驟，直接影響到甲潑尼龍的 質(zhì)量和收率?，F(xiàn)有技術(shù)中脫氫工藝一般用SeOj兌氫，Se(^是劇毒物質(zhì)，污染大，且反應(yīng) 收率低，一般只有55^，產(chǎn)物質(zhì)量差，產(chǎn)物中殘留的微量Se(^很難消除。中國專利申請 200710201635. 8公開了一種甲潑尼龍脫氫物的制備方法，采用節(jié)桿菌生物脫氫的方法對甲 潑尼龍中間體1，2位進(jìn)行生物脫氫。然而該申請公開的技術(shù)方案中既沒有公開生物脫氫所 采用菌株的任何保藏信息，又沒有公開生物脫氫所采用的培養(yǎng)基的配方，由于現(xiàn)有技術(shù)中， 采用不同菌株與不同的培養(yǎng)基時生產(chǎn)脫氫物的收率有很大的差別，造成該專利申請其公開 的技術(shù)方案無法實(shí)施。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種新的甾體藥物1，2位的生物脫氫方 法。其特征是，以式(1)化合物為底物采用簡單節(jié)桿菌生物脫氫的方法得到式(2)化合物。
反應(yīng)式如下
&為H， 0Ac ; &為011;或者1 2，1 3為雙鍵或環(huán)氧；
R4為H， a -OH， P _0H，或=0 ;
Rs為H， CHs或者二 CH2
化合物(1)不為以下幾種化合物 (1)6 a -甲基-lip ，17a-二羥基-孕甾-4-烯-3，20_二酮；
(2)6 a -甲基-17a ，21_二羥基-孕甾_4_烯3， 11， 20-三酮-21
(3)6 a -甲基-lip ，17 a ，21_三羥基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮-21
(4)6 a -甲基-17a-羥基-孕甾_4_烯-3， 11 ， 20-三酮；
(5)6 a -甲基-lip ，17 a ，21 —三羥基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮。
所述的生物脫氫具體工藝為將式(1)化合物粉碎或以溶劑溶解，投入已培養(yǎng)好 節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)，轉(zhuǎn)化后提取得到脫氫物即化合物(2)。所述溶劑選 自但不僅限于甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)，DMF (N， N- 二甲基甲酰胺)中的一種或幾種， 溶解倍數(shù)為常溫下能將底物溶解的最小倍數(shù)，所述粉碎投料的式(1)化合物優(yōu)選微粉化為 09。(90%通過粒徑)《lOOym的微粒。所述的甾體藥物中間體即化合物(1)優(yōu)選以下幾種 化合物中的任意一種 ，17a-二羥基-孕甾-4-烯-3，20_二酮； (2) 17 a ，21_二羥基_孕甾_4_烯3， 11， 20-三酮-21.
(3) IIP ，17 a ，21-三羥基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮-21
(4) 17 a -羥基-孕甾-4-烯-3， 11， 20-三酮；
(5) 6 a -甲基-lla ， 17 a ，21_三羥基-孕甾_4_烯-3， 20-二酮-21
(6) 11a ，17a-二羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；
(7) lla ，17a ，21-三羥基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯;
(8) 6a_甲基-lla-羥基-孕甾-4， 16-二烯-3， 20-二酮；
(9) 11a-羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；
(10) 11 a _羥基_孕甾-4， 16- 二烯-3， 20- 二酮；
(11) 6 a -甲基-lla-羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；
(12) 6 a -甲基-11 a ，21- 二羥基-16a ，17a -環(huán)氧-孕甾_4_烯-3， 20- 二







酮-21
(13)6-次甲基-lla ，17a-二羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；
作為底物的化合物(1)的投料濃度為《4% (相對于發(fā)酵液容積)；優(yōu)選投料濃度 為1% 3%，發(fā)酵溫度30 34"，生物脫氫反應(yīng)時間36 72小時。 生物脫氫反應(yīng)結(jié)束后終止反應(yīng)，優(yōu)選采用將發(fā)酵液升溫至70 9(TC而使菌體滅 活的方法，終止反應(yīng)后用優(yōu)選采用溶媒萃取發(fā)酵液的形式提取脫氫產(chǎn)物。所述萃取用溶媒 優(yōu)選乙酸乙酯。 所述生物脫氫所使用的的簡單節(jié)桿菌(拉丁命名Arthrobacter simplex)，優(yōu)選
以下幾種菌株AS 1.754、 AS 1.94*(均由中國科學(xué)院微生物研究所提供)。 所述的生物脫氫反應(yīng)可以采用以下發(fā)酵工藝 斜面培養(yǎng)一級培養(yǎng)一二級培養(yǎng)一加入化合物(1)發(fā)酵 進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)一終止反應(yīng) 所述的生物發(fā)酵工藝還可采用任何公知的生物發(fā)酵工藝方法，如參考《生物合成
藥物學(xué)》(化學(xué)工業(yè)出版社，2000年出版，褚志義主編；666 675頁)中公開的生物發(fā)酵工藝。 所述的生物脫氫所用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比 斜面培養(yǎng)基(％ ):葡萄糖1.3，酵母膏1.3，瓊脂2.0，以及余量的蒸餾水， pH7. 0-7.2，用于斜面培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)基(％):葡萄糖l.O，酵母膏O. 16， KH2P040.25，玉米漿0. l，以及余量的 蒸餾水，pH 7. 0-7. 2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物脫氫反應(yīng)中。 與現(xiàn)有技術(shù)中采用Se02脫氫的工藝相比采用本發(fā)明所述的生物脫氫工藝，脫氫轉(zhuǎn) 化率可以達(dá)到70 90%，并且避免了劇毒的含硒雜質(zhì)的殘留，此外，本發(fā)明提供的生物脫 氫工藝可以適用于多種甾體中間體，即可以適用于合成甲潑尼龍的多條合成路線，使得合 成甲潑尼龍時合成路線的選擇更為靈活。 下面結(jié)合具體實(shí)施方式
進(jìn)一步說明本發(fā)明所述的技術(shù)方案，具體實(shí)施方式
中公開 的技術(shù)方案是對本發(fā)明技術(shù)方案的進(jìn)一步說明，不能解釋為對本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例方式底物轉(zhuǎn)化率的測定轉(zhuǎn)化率用反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的底物質(zhì)量占初始底物總質(zhì) 量的百分比來表示。采用HPLC測定，分離柱為C18柱，檢測波長為240nm，流動相是乙腈 水(體積比)=60 : 40的溶于流速為1. 5mL/min。采用面積歸一法計算底物轉(zhuǎn)化率。
斜面培養(yǎng)將斜面培養(yǎng)基分裝于15mL的試管中，滅菌30min后擺成斜面。斜面于 37t:培養(yǎng)箱中放置2d，觀察無染菌情況即可進(jìn)行接種。接種后斜面于3(TC下培養(yǎng)2d，然后
置于4t:冰箱中保存。 —級培養(yǎng)從生長良好的簡單節(jié)桿菌斜面上取菌體，接入裝有30ml培養(yǎng)基的 250mL三角瓶中，30 34°C ， 180r/min振蕩培養(yǎng)，24小時 二級培養(yǎng)將完成一級培養(yǎng)后的發(fā)酵液以5%接種量接入裝有150ml培養(yǎng)基的 lOOOmL二級種子培養(yǎng)三角瓶中，以同樣的條件進(jìn)行二級培養(yǎng)，二級培養(yǎng)時間為24小時
生物脫氫與二級培養(yǎng)相同的接種量接入5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度30 34t:，攪拌 轉(zhuǎn)速180r/min，通氣量1. 5L/min，培養(yǎng)24小時后加入底物進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)。
實(shí)施例1 :以1113 ， 17 a - 二羥基-孕甾_4_烯_3， 20- 二酮為底物；
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 3rC，將溶于DMF的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為1X，反應(yīng)溫度為3rC。反應(yīng)時間為 60小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮， 測得底物轉(zhuǎn)化率為73.5%。 實(shí)施例2 :以17a ，21-二羥基-孕甾_4_烯3， 11， 20-三酮-21-醋酸酯為底物;
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 32°C ，將溶于四氫呋喃的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為2% ，反應(yīng)溫度為32°C 。反應(yīng)時 間為48小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相 濃縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為77. 3%。 實(shí)施例3 :以IIP ，17a ，21-三羥基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯為底 物； 將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 33t:，將溶于二氧六環(huán)的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為1%，反應(yīng)溫度為331:。反應(yīng)時 間為36小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相 濃縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為81. 6% 。 實(shí)施例4 :以17 a -羥基-孕甾_4_烯_3， 11， 20-三酮為底物；
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 34°C ，將微粉化的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為2% ，反應(yīng)溫度為34°C 。反應(yīng)時間為36 小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，測 得底物轉(zhuǎn)化率為80. 1%。 實(shí)施例5:以6a-甲基-lla，17a，21-三羥基-孕甾_4_烯_3， 20- 二酮-21-醋 酸酯為底物； 將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 32°C ，將溶解于乙醇的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為0. 5% ，反應(yīng)溫度為32°C 。反應(yīng)時 間為42小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相 濃縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為77. 1%。 實(shí)施例6 :以11 a ， 17 a - 二羥基-孕甾_4_烯_3， 20- 二酮為底物；
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 34t:，將溶解于二氧六環(huán)的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為2%，反應(yīng)溫度為34°C。反應(yīng) 時間為36小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī) 相濃縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為82. 1%。 實(shí)施例7 :以lla ，17a ，21-三羥基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮_21_醋酸酯為底 物； 將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 30°C ，將溶于DMF的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為2% ，反應(yīng)溫度為30°C 。反應(yīng)時間為 68小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮， 測得底物轉(zhuǎn)化率為70. 1%。 實(shí)施例8:以6a-甲基-lla -羥基-孕甾_4， 16- 二烯_3，20_ 二酮為底物；
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為
732°C ，將溶于甲醇的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為0. 5% ，反應(yīng)溫度為32°C 。反應(yīng)時間 為48小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃 縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為75.3%。 實(shí)施例9 :lla-羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾_4_烯_3， 20-二酮為底物；
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 33°C ，將微粉化的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為4% ，反應(yīng)溫度為33°C 。反應(yīng)時間為42 小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，測 得底物轉(zhuǎn)化率為78.9%。 實(shí)施例10 :以11 a -羥基-孕甾_4， 16- 二烯_3，20_ 二酮為底物；
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.94*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 34t:，將溶于二氧六環(huán)的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為1%，反應(yīng)溫度為341:。反應(yīng)時 間為38小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相 濃縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為78. 5%。 實(shí)施例11 :以6a-甲基-11 a -羥基-16 a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯-3，20_二 酮為底物； 將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754*)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 為30°C ，將溶于四氫呋喃的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為1 % ，反應(yīng)溫度為30°C 。反應(yīng) 時間為72小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī) 相濃縮，測得底物轉(zhuǎn)化率為70. 7. %。 實(shí)施例12 :以6a-甲基-lla ，21-二羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾_4-烯_3， 20-二酮_21-醋酸酯為底物； 將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 31°C ，將溶于乙醇底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為0. 5 % ，反應(yīng)溫度為31°C 。反應(yīng)時間為 60小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮， 測得底物轉(zhuǎn)化率為72.9%。 實(shí)施例13 :以6-次甲基-11 a ， 17 a - 二羥基-孕甾_4_烯_3，20_ 二酮為底物
將簡單節(jié)桿菌(AS 1.754)依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、一級培養(yǎng)和二級培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 34°C ，將微粉化的底物投入5L發(fā)酵罐中，投料濃度為2% ，反應(yīng)溫度為34°C 。反應(yīng)時間為60 小時，反應(yīng)完成后升溫至7(TC終止反應(yīng)，采用乙酸乙酯萃取提取發(fā)酵液，將有機(jī)相濃縮，測 得底物轉(zhuǎn)化率為80. 1%。
權(quán)利要求
一種甾體藥物中間體1，2位的生物脫氫方法，以式(1)化合物為底物采用簡單節(jié)桿菌生物脫氫的方法得到式(2)化合物，反應(yīng)式如下R1為H，OAc；R2為OH；或者R2，R3為雙鍵或環(huán)氧；R4為H，α-OH，β-OH，或＝O；R5為H，CH3或者＝CH2；化合物(1)不為以下幾種化合物6α-甲基-11β，17α-二羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；6α-甲基-17α，21-二羥基-孕甾-4-烯3，11，20-三酮-21-醋酸酯；6α-甲基-11β，17α，21-三羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯；6α-甲基-17α-羥基-孕甾-4-烯-3，11，20-三酮；6α-甲基-11β，17α，21一三羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮；其特征是將式(1)化合物粉碎或以溶劑溶解，投入已培養(yǎng)好節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后提取得到脫氫物即化合物(2)。F2008101528777C0000011.tif
2. 如權(quán)利要求1所述的生物脫氫方法，其特征是所述溶解底物的溶劑選自甲醇、乙醇、四氫呋喃、二氧六環(huán)、DMF中的一種或幾種，溶解倍數(shù)優(yōu)選常溫下能將底物溶解的最小倍數(shù)。
3. 如權(quán)利要求l所述的生物脫氫方法，其特征是所述的底物優(yōu)選微粉化為D9?！?0iim的微粒。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一所述的生物脫氫方法，其特征是作為底物的化合物(1)的 投料濃度為《4%。
5. 如權(quán)利要求1至4中任一所述的生物脫氫方法，其特征是作為底物的化合物(1)的 投料濃度優(yōu)選1% 3%，發(fā)酵溫度為30°C 34t:，生物脫氫反應(yīng)時間為36 72小時。
6. 如權(quán)利要求1至5所述的生物脫氫方法，其特征是所使用的簡單節(jié)桿菌(拉丁命名 Arthrobacter simplex)優(yōu)選保藏編號分別為AS 1. 754、AS 1. 94*的兩種種菌株中的一種 或幾種。
7. 如權(quán)利要求1至7所述的生物脫氫方法，其特征是所述的生物脫氫反應(yīng)可以采用以 下發(fā)酵工藝。斜面培養(yǎng)一一級培養(yǎng)一二級培養(yǎng)一加入化合物(1)發(fā)酵進(jìn)行生物脫氫反應(yīng)—終止反應(yīng)
8. 如權(quán)利要求1至8所述的生物脫氫方法，其特征是所述的生物脫氫所采用的培養(yǎng)基優(yōu)選采用以下配比斜面培養(yǎng)基(％ ):葡萄糖1. 3，酵母膏1. 3，瓊脂2. 0，以及余量的蒸餾水，pH7. 0-7. 2， 用于斜面培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基(％ ):葡萄糖l.O，酵母膏O. 16， KH2P040.25，玉米漿0. 1，以及余量的蒸餾 水，pH 7. 0-7. 2，用于一級、二級培養(yǎng)和最終的生物脫氫反應(yīng)中。
9. 如權(quán)利要求1至9所述的生物脫氫方法，其特征是所述作為底物的化合物(1)優(yōu)選 以下幾種化合物中的一種IIP ，17a-二羥基-孕甾-4-烯-3，20_二酮； 17a ，21-二羥基-孕甾-4-烯3， 11， 20-三酮-21-醋酸酯; IIP ，17a ，21-三羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮-21_醋酸酯; 17 a -羥基-孕甾-4-烯-3， 11， 20-三酮；6a-甲基-lla ，17a ，21-三羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮_21-醋酸酯；lla ，17a-二羥基-孕甾-4-烯-3，20_二酮；lla ，17a ，21-三羥基-孕甾_4_烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯;6a-甲基-lla-羥基-孕甾-4，16-二烯-3，20_二酮；11a-羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；11 a -羥基-孕甾-4， 16- 二烯-3， 20- 二酮；6a-甲基-11 a-羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；6a-甲基-lla ，21-二羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯_3， 20-二酮-21-醋酸酯。
10. 如權(quán)利要求1至9所述的生物脫氫方法，其特征是所述作為底物的化合物(1)更優(yōu)選以下幾種化合物中的一種6a-甲基-lla ，17a ，21-三羥基-孕甾-4-烯-3，20-二酮_21-醋酸酯；6a-甲基-lla-羥基-孕甾-4，16-二烯-3，20_二酮；6a-甲基-11 a-羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯-3，20_二酮；6a-甲基-lla ，21-二羥基-16a ，17a-環(huán)氧-孕甾-4-烯_3， 20-二酮-21-醋酸
全文摘要
6α-甲基潑尼松龍中間體的生物脫氫制備方法，以式(1)化合物為底物，采用簡單節(jié)桿菌生物脫氫的方法得到式(2)化合物，具體工藝為將式(1)化合物粉碎或以溶劑溶解，投入已培養(yǎng)好節(jié)桿菌的發(fā)酵罐中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，提取、分離并精制，干燥后得脫氫物即化合物(2)，脫氫轉(zhuǎn)化率可達(dá)70～90％。
文檔編號C12P33/02GK101760495SQ20081015287
公開日2010年6月30日 申請日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者趙琳, 陳松, 陳立營 申請人:天津金耀集團(tuán)有限公司