專利名稱:一種快速診斷唐氏綜合征的方法
一種快速診斷唐氏綜合征的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,特別是一種擴增21號染色體上D21S1440、D21Sll和PentaD3個STR基因座診斷唐氏綜合征的方法。
背景技術(shù):
唐氏綜合征(Down's syndrome, DS)又稱21-三體綜合征,是人類最常見的染色體病。主要表現(xiàn)為智力低下,常合并多種畸形,生活基本不能自理。我國每年大約有26 600個DS患兒出生,平均每20分鐘出生一個,每出生1例DS患兒大約給社會造成幾十萬元的經(jīng)濟負(fù)擔(dān),我國每年治療DS的總費用超過25億元人民幣。迄今醫(yī)學(xué)上尚無根治DS方法。降低DS患兒出生率的有效方法是產(chǎn)前診斷。通過產(chǎn)前診斷發(fā)現(xiàn)DS患兒,積極采取干預(yù)措施,避免DS患兒的出生。
由于DS篩查的普及,使產(chǎn)前診斷的需求呈明顯上升的趨勢。天津市2007年有近60 000例孕婦進(jìn)行DS篩査,有3 600例左右孕婦需進(jìn)行產(chǎn)前診斷一羊水細(xì)胞染色體檢査。但實際羊水細(xì)胞染色體檢査例數(shù)只有1 000例左右,檢出染色體病胎兒20余例。也就是說有2 600例孕婦因未做羊水細(xì)胞染色體,而導(dǎo)致50余例DS患兒出生。羊水細(xì)胞染色體檢查率低的原因除與孕婦的經(jīng)濟狀況、對羊膜腔穿刺并發(fā)癥的恐懼心理有關(guān)外,還與羊水細(xì)胞染色體報告時間過長有關(guān)。因為羊水細(xì)胞染色體的檢測需要10 14天的細(xì)胞培養(yǎng),21 28天方可出診斷報告,而且技術(shù)要求高,有培養(yǎng)失敗的可能性。現(xiàn)有的細(xì)胞遺傳學(xué)方法已不能滿足日益增長的產(chǎn)前診斷需要。這就要求我們建立一種適合本民族的快速產(chǎn)前診斷DS的方法,與細(xì)胞遺傳學(xué)互補,提高產(chǎn)前診斷率,真正做到防止先天缺陷兒的出生,降低我國人口出生缺陷率,提高我國人口素質(zhì)。
已知機體的各種有核細(xì)胞均有人類全套基因組DNA,而基因組中含有大量的重復(fù)序列,其中不少是短串聯(lián)重復(fù)序列(Short Tandem Repeat, STR )。 STR基因座數(shù)量多、穩(wěn)定具有高度多態(tài)性,可提供較多的遺傳信息量,而且在上下代的傳遞過程中遵循孟德爾共顯性遺傳定律;STR基因座具有種族的差異;STR基因座的每一個基因代表著一條染色體,是目前檢測染色體數(shù)目異常最合適的遺傳學(xué)標(biāo)記。國外己將擴增STR基因座作為診斷DS的方法之一。但由于STR基因座具有種族的
4差異,而且我國漢族群體占91.6。/。,因此有必要建立中國漢族群體擴增STR基因座診斷DS的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足,提供一種快速診斷唐氏綜合征的方法。該方法是擴增21號染色體D21S1440、 D21Sll和PentaDSTR基因座,測序膠檢測擴增產(chǎn)物,通過對擴增產(chǎn)物條帶及面積的分析達(dá)到診斷DS的目的。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的方案是設(shè)計一種擴增21號染色體D21S1440、D21Sll和PentaD STR基因座診斷DS的方法。其特征在于所述方法包括
(1) 用常規(guī)方法采集樣本,于一20'C保存?zhèn)溆?;所述樣本是羊水樣本、絨毛樣本或外周血樣本;
(2) 提取樣本中的DNA ,其中外周血樣本采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提??;羊水樣本或絨毛樣本采用鹽析法進(jìn)行DNA提??;
(3) 選擇與合成引物,其中
a. D21S1440引物序列
f-F AM-GAGTTTGA AAAT AAAGTGTTCTGC;r-CCCC ACCCCTTTT AGTTTT A;擴增產(chǎn)物為157 175bp;
b. D21S11引物序列
f- FAM -GTGAGTCAATTCCCCAAG;r- GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC;擴增產(chǎn)物為172 260bp;
c. PentaD引物序歹!j:
f隱FAM -GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;r- CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT;擴增產(chǎn)物為398bp 433bp;
5(4) PCR擴增
以提取的基因組DNA為模板,在9600 PCR儀上進(jìn)行擴增;反應(yīng)體系為25^L 50pL,其中模板0.2 0.4pL其終濃度0.6ng, dNTPs 0.5pL l.(VL其終濃度0.2mmol/L, T叫酶0.5^L l.OpL其終濃度0.04 U/pL, 10xPCR buffer 2.5pL 5.0pL其終濃度lxPCR buffer,引物f-FAM 0.03pL 0.06^L其終濃度0.12拜ol/L,引物r 0.03^L 0.06nL其終濃度0.12|xmol/L,最后補充ddH20至25pL 5(^L。
(5) PCR擴增產(chǎn)物的檢測
采用ABI PRISM 377測序電泳、GeneScan 3.1軟件及核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析擴增產(chǎn)物,對電泳條帶進(jìn)行峰面積定量檢測。
本發(fā)明擴增D21S1440、 D21Sll和PentaDSTR基因座診斷DS的方法,用以聯(lián)
合應(yīng)用診斷DS。
本發(fā)明將DNA模板通過D21S1440、 D21S1 l和PentaD熒光引物進(jìn)行PCR擴增,
熒光信號變量與擴增產(chǎn)物變量成正比,通過熒光的采集、分析和對擴增產(chǎn)物條帶進(jìn)行峰面積定量,實現(xiàn)對原始模板量的定量。應(yīng)用D21S1440、 D21Sll和PentaD擴增進(jìn)行DS的基因診斷時,染色體iH常樣本擴增可出現(xiàn)2種情況雜合子顯示2條帶/峰,0.7《峰下面積比值《1.4;純合子顯示l條帶/峰,峰面積與雜合子的比值〉1.4。DS個體樣本擴增可出現(xiàn)3種情況(1)任何1個基因座在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)3條帶/峰;(2)在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)2條帶/峰,峰下面積比值<0.7或>1.4; (3)在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)l條帶/峰,峰面積相當(dāng)于雜合子的3倍。
本發(fā)明應(yīng)用QF-PCR擴增D21S1440、 D21Sll和PeritaD STR基因座產(chǎn)前診斷DS,與染色體核型分析相比有以下優(yōu)勢(1)快速, 一般24 48小時即可得出結(jié)果,而通過染色體核型分析一般3 4周。(2)靈敏度為100%,特異度為97.39%。(3)取材少,0.5 3mL羊水即可以用于診斷,而染色體核型分析需用羊水20mL左右。(4)可以對大批量標(biāo)本同時進(jìn)行診斷,結(jié)果分析省時省力。(5)通過比較母親和胎兒的擴增結(jié)果,可以對母血污染的樣本做出正確診斷。(6)可以區(qū)分單卵雙胎和雙卵雙胎。(7)可以對多種樣本包括上皮細(xì)胞、性腺細(xì)胞等進(jìn)行分析,而且適用于少量及微量的DNA樣本,如孕婦外周血中胎兒細(xì)胞、卵裂球、極體和經(jīng)宮頸富集的胎兒細(xì)胞等。
應(yīng)用QF-PCR擴增STR基因座具有精確度高、自動進(jìn)樣和結(jié)果數(shù)據(jù)化等優(yōu)勢,是大規(guī)模產(chǎn)前診斷DS的理想工具。
圖1為D21S1440 STR基因座電泳圖2a泳道l遷移率曲線圖2b泳道l峰面積定量圖3a泳道5遷移率曲線圖3b泳道5峰面積定量圖4為DS個體D21S1440 STR基因座電泳圖;
圖5a泳道4遷移率曲線圖5b泳道4峰面積定量圖6a泳道5遷移率曲線圖6b泳道5峰面積定量圖7 為D21S11 STR基因座電泳圖8a泳道4遷移率曲線圖8b泳道4峰面積定量圖9a泳道2遷移率曲線圖9b泳道2峰面積定量圖IO DS個體D21S11 STR基因座電泳圖lla泳道3遷移率曲線圖llb泳道3峰面積定量圖12a泳道2遷移率曲線圖12b泳道2峰面積定量圖13 PentaD STR基因座電泳圖;圖14a泳道4遷移率曲線圖;圖14b泳道4峰面積定量圖;圖15a泳道5遷移率曲線圖;圖15b泳道5峰面積定量圖16 DS個體PentaD STR基因座電泳圖; 圖17a泳道5遷移率曲線圖; 圖17b泳道5峰面積定量圖; 圖18a泳道4遷移率曲線圖; 圖18b泳道4峰面積定量圖。
以下結(jié)合本發(fā)明的實施例參照附圖進(jìn)行詳細(xì)敘述。
具體實施方式
本發(fā)明選取漢族個體719例,包括外周血樣本389例、羊水樣本282例和絨毛樣 本48例。719例樣本經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)確診DS67例,652例染色體核型分析正常。
實驗方法
(一) 樣本采集
1. 羊水樣本按常規(guī)方法經(jīng)腹抽取2~3 mL羊水一2(TC保存?zhèn)溆茫换? 000rpm 離心5min,細(xì)胞沉淀用80%乙醇固定,一20'C保存?zhèn)溆谩?br>
2. 絨毛樣本按常規(guī)方法經(jīng)陰道取10 20mg絨毛,Hank's平衡溶液漂洗后, 一2(TC保存?zhèn)溆谩?br>
3. 外周血樣本取靜脈血2mL于EDTA-抗凝管中;或取200pL EDTA-抗凝 血按本室常規(guī)方法提取白細(xì)胞(white blood cell, WBC) , 一20'C保存?zhèn)溆谩?br>
(二) DNA提取
1.外周血樣本均采用DNA提取試劑盒(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司出 售),提取過程按說明書進(jìn)行。其過程如下
(1) 取200pL分離好的WBC, 8 000rpm離心3min,棄上清,生理鹽水洗滌 沉淀一次。
(2) 加入300nL 5mol/L異硫氰酸胍,用移液器反復(fù)吸打沉淀物4~6次,加 入10nLRNaseA, 37°C溫浴10min。
(3) 加入800pL 4 mol/L NaC104 (PH: 5.2) , 20pL Resin混勻,室溫5min。
(4) 8 000rpm離心30s,棄上清。
(5) 加入500pL 200mM NaCl、 50mM Tris-HCl (PH 7.5) 、 10mM EDTA、 無水乙醇的混合液,混勻,一20。C放置20min, 8 000rpm離心60s,棄上清。
8(6) 重復(fù)步驟(5)。
(7) 12 000rpm離心30s,吸干剩余液體,室溫放置5-10min。
(8) 加入50~100(iL TE Buffer,混勻,50。C保溫10min, 12 000 rpm離心60s, 吸取上清,即為基因組DNA。
2.羊水及絨毛樣本均采用鹽析法提取DNA。其過程如下
(1) 樣本處理取100laL80X乙醇固定的羊水細(xì)胞懸浮液,8 000rpm離心 5min,棄上清,生理鹽水洗滌沉淀2次;新鮮及凍存的羊水則直接取1 1.5mL, 12 000rpm離心10min,棄上清,生理鹽水洗滌沉淀2次;挑取10~20mg絨毛樣本 在Hank's液中漂洗去除血污后置于離心管中,生理鹽水洗滌2次。
(2) 加入300nL STE溶液,充分混勻后分別加入30pLSDS溶液和20(iL蛋 白酶K溶液。
(3) 混勻后5(TC恒溫水浴2.5~3h,至細(xì)胞完全融解,其間顛倒混勻數(shù)次。
(4) 自然冷卻至室溫,加入1/3體積的過飽和NaCl溶液(約llOpL),強 烈振蕩數(shù)次,5 OOOrpm離心15min。
(5) 轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中,加入等體積CHC13 (約40(HiL),混勻后 8 OOOrpm離心15min。
(6) 轉(zhuǎn)移水相至一新離心管中,加入2倍體積一20。C預(yù)冷的無水乙醇,一2(TC 冷凍至少2h, 12 000rpm離心30min,棄上清。
(7) 75%乙醇洗滌沉淀1次,12 000rpm離心15min,棄上清,沉淀即為所 需DNA,過夜晾干。
(8) 加15~30|iLTE Buffer溶解沉淀。
所有提取的基因組DNA用2.5%瓊脂糖凝膠以100V電壓電泳25min,以 1 OOObp DNA Marker為片段長度標(biāo)記,確定標(biāo)本DNA質(zhì)量和濃度。提取的DNA 于一20'C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
(三)引物的選擇與合成
經(jīng)過21號染色體上D21S1440、D21Sll、PentaD、D21S258、D21S212、D21S210 和D21S215等7個STR基因座的篩選,確定D21S1440、 D21S11、 Penta D 3個 STR基因座為診斷DS的候選基因座。根據(jù)GDB人類基因組數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報道, 確定D21S1440、 D21S11和PentaD 3個STR基因座的引物序列,正向引物5,-端 均由熒光染料5-羧基-熒光素(caboxyfluorescein國5-succimidyl ester, FAM)標(biāo)記, 由北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。
9200810152923.31. D21S1440:定位于21q22.3, GDB: 684003,擴增產(chǎn)物為157 175bp 引物序列f-FAM-GAGTTTGAAAATAAAGTGTTCTGC;
r-CCCCACCCCTTTTAGTTTTA
2. D21S11:定位于21q21.1, GDB: 188664,擴增產(chǎn)物為172 260bp 引物序列f- FAM -GTGAGTCAATTCCCCAAG;
r- GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC
3. PentaD:定位于21q,擴增產(chǎn)物為398bp 433bp
弓I物序列f- FAM隱GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;
r隱CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT (四)PCR擴增
以提取的基因組DNA為模板,在9600 PCR儀上進(jìn)行擴增。反應(yīng)體系為 25nL~50pL。反應(yīng)組分見表l。
表l PCR擴增體系
反應(yīng)組分加樣體積(pL)終濃度
模板0.2-0.40.6ng
dNTPs(10mM)0.5-1.00.2 mmol/L
Taq酶(2U/(iL)0.5-1.00.04 U/|iL
10xPCR buffer2.5-5.01 xPCR buffer
引物f-F AM0.03-0.060.12nmol/L
引物r (lOOpM)0.03-0.060.12|imol/L
ddH20補充體系至 25-5(^L
PCR擴增條件如下
預(yù)變性93°C~95°C 2min;變性93°C~95°C 30s,退火58°C~62°C 30s,延伸 72°C lmin共32個循環(huán);延伸72°C 5min后6(TC保溫30min, 4。C保存。
每次PCR反應(yīng)均設(shè)空白對照,所有操作均戴一次性手套在冰浴上進(jìn)行,所有 耗材均在高壓滅菌后一次性使用。 (五)PCR擴增產(chǎn)物的檢測
PCR擴增產(chǎn)物采用ABI PRISM 377測序電泳檢測。
1.預(yù)電泳20 30min至膠的溫度達(dá)到40°C。2. 取l^L的擴增產(chǎn)物與lpL內(nèi)標(biāo)混勻,95 'C變性2min,立即放在碎冰上冷 卻,盡快取lpL上樣。
3. 1 200V電泳2.5h。
4. 電泳結(jié)束后,打開膠圖(膠圖由測序儀軟件自動生成),即可分析結(jié)果。
1. 結(jié)果分析用GeneScan 3.1軟件進(jìn)行電泳數(shù)據(jù)分析。用GSG-核酸/蛋白凝 膠圖像分析管理系統(tǒng)對電泳條帶進(jìn)行峰面積定量檢測。所有操作均按操作指南進(jìn) 行。
2. DS診斷標(biāo)準(zhǔn)
(1) 任何1個基因座在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)3條帶,經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像 分析管理系統(tǒng)分析可見3個峰,即可診斷DS。
(2) 在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)2條帶,經(jīng)核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分 析可見峰下面積比值<0.7或>1.4的2個峰,可輔助診斷DS。
(3) 若在目標(biāo)片段范圍內(nèi)出現(xiàn)1條帶,則不能診斷DS。
本發(fā)明實驗719例樣本,D21S1440、 D21S11和Penta D 3個STR基因座均擴 增成功,擴增產(chǎn)物為156 438bp,與GDB人類基因組數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)報道相符。 一、D21S1440 STR基因座結(jié)果分析
719例樣本中染色體核型分析正常的652例,有645例電泳結(jié)果表現(xiàn)為2條 帶/峰,0.7《峰下面積比值《1.4,或1條帶,峰下面積與正常雜合子峰下面積比 M.4(見圖l 3b);有7例出現(xiàn)3條帶,為假陽性。
圖1可見泳道1、 3、 4顯示1條帶;泳道2、 5可見2條帶。圖2a可見對應(yīng) 泳道1的電泳條帶顯示1個峰,圖2b顯示峰下面積為l,為純合子;圖3a可見對 應(yīng)泳道5顯示2個峰,圖3b顯示峰下面積44.74/55.26,為雜合子。
67例染色體核型分析確診為DS的樣本,有21例樣本出現(xiàn)3條帶,峰面積均 值分別為32.72±3.63、 34.54±2.04和32.74±3.50; 27例樣本出現(xiàn)2條帶,峰面積均 值分別為66.06士2.84和34.12±2.77,其比值為1.96土0.24; 19例樣本出現(xiàn)1條帶。 48例可診斷為DS。
擴增D21S1440 STR基因座診斷DS的靈敏度為71.64% (48/67),特異度為 98.93% (645/652)。
D21S1440 STR基因座峰面積定量數(shù)據(jù)見表2 3,電泳圖及遷移率、峰面積定 量曲線圖見圖4~6b。
11表2 D21S1440 STR基因座21例3條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(% )
樣本號條帶l條帶2條帶3樣本號條帶l條帶2條帶3
376333.2636.1330.61353732.2537.2330.52
379423.2735.0641.67365832.0833.2934.63
387129.3233.4937.19334532.0932.5330.75
386636.4135.2628.33071632.7535.4332.48
363030.6238.3431.04372836.7135.4231.83
352633.5736.0830.53373330.2632.2231.07
360833.4236.8329.75071739.636.5833.16
352335.2830.0934.63368836.7232.0828.32
364136.8233.0930.09376232.5833.9733.45
羊水230.6833.5935.73羊水432.2435.6632.10
羊水827.2933.0439.67
表3 D21S1440 STR基因座27例2條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(%)
樣本號條帶l條帶2比值樣本號條帶l條帶2比值
378465.3934.611.89387068.1631.842.14
375968.331.72,15071266,7133.292.00
378266.5433.461.99071369.3230.682.26
380665.1534.851.87377862.9337.071.70
380570.2729.732.36352262.3537.651.66
376463.4936.511.74354967.5532.452.08
376269.3230.682.26364570.0629.942.34
380863.1236.881.71324062.9437.061.70
381267.1432.862.04364966.3933.611,98
383563.2836.721.72355263.4836.521.74
385869.0330.972.23071863,7736.231.76
383062.7437.261.68羊水l61.0338.971.57
羊水369,4435.361.97羊水569.9530.052.33
羊水765.7334.271.92
圖4可見泳道1、 3顯示1條帶;泳道2、 4可見2條帶;泳道5可見3條帶。 圖5a可見對應(yīng)泳道4的電泳條帶顯示2個峰,圖5b顯示峰下面積65.15/34.85; 圖6a可見對應(yīng)泳道5顯示3個峰,圖6b顯示峰下面積23.27/35.06/41.67。
二、D21SU STR基因座結(jié)果分析
719例樣本中染色體核型分析正常的652例,有643例電泳結(jié)果表現(xiàn)2條帶/
12峰、0.7《峰下面積比值《1.4,或1條帶、峰下面積與正常雜合子峰下面積比>1.4 (見圖7 9b);有9例出現(xiàn)3條帶,為假陽性。
圖7可見泳道1、 4顯示1條帶;泳道2、 3、 5可見2條帶。圖8a可見對應(yīng) 泳道4的電泳條帶顯示1個峰,圖8b顯示顯示峰下面積為1,為純合子;圖9a 可見對應(yīng)泳道2顯示2個峰,圖9b顯示峰下面積41.49/58.51,為雜合子。
67例染色體核型分析確診為DS的樣本,有18例樣本出現(xiàn)3條帶,峰面積 均值分別為33.53±3.24、 34.11±3.10和32.36士3.36; 33例樣本出現(xiàn)2條帶,峰面積 均值分別為65.79±3.02和34.21±3.02,其比值為1.95士0.26; 16例樣本出現(xiàn)1條帶。 51例可診斷為DS。
擴增D21S11 STR基因座診斷DS的靈敏度為76.12% (51/67),特異度為 98.62% (643/652)。
D21S11 STR基因座峰面積定量數(shù)據(jù)見表4-5,電泳圖及遷移率/峰面積定量 曲線圖見圖10~12b。
表4 D21S11 STR基因座18例3條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(%)
樣本號條帶l條帶2條帶3樣本號條帶l條帶2條帶3
378929.3632.5538.09377836.4433.0730.49
380532.9733.4933.54352631.9836.5431.48
380233.9632.8333.21355226.8839.1433.98
380135.4436.5827.98364232.4635.8131.73
383535.1129,8435.05368532,4840.5326.99
383033.0635.8731,07071734.1330.9234.95
071230.2832.0937.63071838.4433.9127.65
071338.4928.4333.08羊水530.0333.3136.66
羊水833.4336.4230.15羊水938.5732.6228.81
表5 D21SU STR基因座33例2條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(%)樣本號條帶l條帶2比值樣本號條帶1條帶2比值
375866.3933.611.98360869.8830,122.32
377271.4328.572.50357968.5131.492.18
380665.4234.581.89361461.8138.191.62
379462.1337.871.64352867.3232.682.06
376464.1135.891.79364568.1331.872.14
376260.9239.081.56352366.4233.581.98
380860.1739.831.51324064.2535.751.80
13387268.5331.472.18364964.5935.411.82
385869.8130.192.31364166.7133.292.00
387162.9537.051.70353769.3230.682.26
385565.0234.981.86365865.4934.511.90
387061.9838.021.63071570.1629.842.35
071469.1330.872.24374166.3133.691.97
352269.3730.632.26373367.0632.942.04
354965.0834.921.86羊水l62.5737.431.67
羊水364.5935.411.82羊水462.0437.961.63
絨毛l63.5436.461.74.
圖10可見泳道5顯示1條帶;泳道1、 3、 4可見2條帶;泳道2可見3條 帶。圖lla可見對應(yīng)泳道3的電泳條帶顯示2個峰,圖lib顯示峰下面積 64.11/35.89;圖12a可見對應(yīng)泳道2顯示3個峰,圖12b顯示峰下面積 33.96/32.83/33.21。
三、PentaDSTR基因座
719例樣本中染色體核型分析正常的652例,有651例電泳結(jié)果表現(xiàn)2條帶/ 峰,0.7《峰下面積比值《1.4;或1條帶,峰下面積與正常雜合子峰下面積比〉 1.4(見圖13~15);有1例出現(xiàn)3條帶,為假陽性。
圖13可見泳道4顯示1條帶;泳道1、 2、 3、 5可見2條帶。圖14a可見對 應(yīng)泳道4的電泳條帶顯示1個峰,圖14 b顯示顯示峰下面積為1,為純合子;圖 15a可見對應(yīng)泳道5顯示2個峰,圖15b顯示峰下面積52.8/47.2,為雜合子。
67例染色體核型分析確診為DS的樣本,有26例出現(xiàn)3條帶,峰面積均值 分別為33.55±4.06、 33.35士2.42和33.33±3.88; 34例樣本出現(xiàn)2條帶,峰面積均值 分別為65.55±3.02和34.45±3.02,其比值為1.92±0.26; 7例樣本出現(xiàn)1條帶。60 例可診斷為DS。
擴增Penta D STR基因座診斷DS的靈敏度為89.55% (60/67),特異度為 99.85% (651/652)。
Penta D STR基因座峰面積定量數(shù)據(jù)見表6~7,電泳圖及遷移率/峰面積定量 曲線圖見圖16~18b。
表6 Penta D STR基因座26例3條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(% )樣本號條帶l條帶2條帶3樣本號條帶l條帶2.條帶3
378440.0232.4327.55354936.2935.1730.94
375932.0727.6640.29363738.4132.7730.96
378926.9433.9539.11357938.4730.6324.95
376224.5935.7239.69352828.7636.5834.42
380832.5430.6836.28355230.4436.8231.64
380139.4733.2827.25364130.6937.9235.59
385839.4028.7331.87071536.5333.7233.03
386635.2933.0631 65372835.1430.4432.09
383035.7732.5931.64071730.7832.7732.95
377831.3932.7735.84368837.2636.2729.27
363029.4433鄰36.58352233.49334331.34
羊水l33.0833.9532.97羊水733.0833.9539.13
羊水929.7835.2235.0絨毛l33.0832.4934.43
表7 PentaD STR基因座34例2條帶樣本峰面積定量數(shù)據(jù)(% )樣本號條帶l條帶2比值樣本號條帶l條帶2比值
376368.4831.522.17071367.5132.492.08
378267.1632.842.04071469.3730.632.26
377265.7434.261.92352669.3330.672.26
380659.7340.271.48360863.7236.281-76
379468.5931.412.18361463.7736.231.76
380560.9439.061.56364561.8738.131.62
380266.3233.681.97352366.5833.421.99
381260.5839.421.54324070.3329.672.37
387263.5936.411.75353765.7434.261.92
386762.4737.531.66334567.2832.722.06
383564.8935.111.85071669.0830.922.23
387161.4938.511.6037"71.5328.472.51
385567.0632.942.04368568.7331.272.20
387064.9335.071.85376264.7735.231.84
071264.1135.891.79羊水261.8038.201.62
15羊水3 66.8433.16 2.02羊水4 63.5436.46 1.74
羊水5 67.3232.68 2.06羊水6 63.4936.51 1.74
圖16可見泳道3顯示1條帶;泳道1、 5可見2條帶;泳道2、 4可見3條 帶。圖17a可見對應(yīng)泳道5的電泳條帶顯示2個峰,圖17b顯示峰下面積 67.16/32.84:圖18a可見對應(yīng)泳道4顯示3個峰,圖18b顯示峰下面積 26.94/33.95/39.11。
四、聯(lián)合D21S1440、 D21S11和PentaD3個STR基因座 719例樣本中染色體核型分析正常的652例,17例樣本出現(xiàn)3條帶,為假陽 性;67例DS樣本均得到診斷,53例樣本出現(xiàn)3條帶,14例樣本出現(xiàn)2條帶/峰, 0.7〉峰下面積比值>1.4。
擴增D21S1440、 D21S11和Penta D STR基因座診斷DS的靈敏度為 100%(67/67),特異度為97.39%(635/652)。
16序列表
<110>天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
<120> —種快速診斷唐氏綜合征的方法
<160〉 6
<210〉 1 <211>24 <212>DNA <213〉人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(24)
<400> 1
gagtttgaaa ataaagtgtt ctgc 24
<210〉2 <211>20 <212〉DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(20)
<400> 2
ccccacccct tttagtttta 20
<210> 3 <211>8 <212> DNA <213>人工序列
<220〉
<221> gene
<222〉 (1)…(18)
<400> 3
gtgagtcaat tccccaag 18
17<210> 4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(22)
<400> 4
gttgtattag tcaatgttct cc 22
<210>5 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(19)
<400> 5
gaaggtcgaa gctgaagtg 19
<210〉6 <211>25 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)…(25)
<400> 6
cttgtgtcca gattaaagaa ttctt 25
18
權(quán)利要求
1、一種快速診斷唐氏綜合征的方法,其特征在于所述方法包括(1)用常規(guī)方法采集樣本,于-20℃保存?zhèn)溆?;所述樣本是羊水樣本、絨毛樣本或外周血樣本;(2)提取樣本中的DNA,其中外周血樣本采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提??;羊水樣本或絨毛樣本采用鹽析法進(jìn)行DNA提??;(3)選擇與合成引物,其中a.D21S1440引物序列f-FAM-GAGTTTGAAAATAAAGTGTTCTGC;r-CCCCACCCCTTTTAGTTTTA;擴增產(chǎn)物為157~175bp;b.D21S11引物序列f-FAM-GTGAGTCAATTCCCCAAG;r-GTTGTATTAGTCAATGTTCTCC;擴增產(chǎn)物為172~260bp;c.Penta D引物序列f-FAM-GAAGGTCGAAGCTGAAGTG;r-CTTGTGTCCAGATTAAAGAATTCTT;擴增產(chǎn)物為398bp~433bp;(4)PCR擴增以提取的基因組DNA為模板,在9600PCR儀上進(jìn)行擴增;反應(yīng)體系為25μL~50μL,其中模板0.2~0.4μL其終濃度0.6ng,dNTPs 0.5μL~1.0μL其終濃度0.2mmol/L,Taq酶0.5μL~1.0μL其終濃度0.04U/μL,10×PCR buffer 2.5μL~5.0μL其終濃度1×PCR buffer,引物f-FAM 0.03μL~0.06μL其終濃度0.12μmol/L,引物r 0.03μL~0.06μL其終濃度0.12μmol/L,最后補充ddH2O至25μL~50μL;(5)PCR擴增產(chǎn)物的檢測采用ABI PRISM 377測序電泳、GeneScan 3.1軟件及核酸/蛋白凝膠圖像分析管理系統(tǒng)分析擴增產(chǎn)物,對電泳條帶進(jìn)行峰面積定量檢測。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于所述PCR擴增條件如下-預(yù)變性93 'C~95 °C 2 min;變性93 °C~95 °C 30 s,退火58 °C~62 °C 30 s, 延伸72 °C 1 min共32個循環(huán);延伸72 °C 5 min后60 'C保溫30 min, 4'C保存。
3、 一種權(quán)利要求l所述的快速診斷唐氏綜合征的方法,用以聯(lián)合應(yīng)用診斷唐 氏綜合征。
全文摘要
本發(fā)明是一種擴增D21S1440、D21S11和PentaD STR基因座診斷唐氏綜合征的方法。該方法是擴增21號染色體D21S1440、D21S11和PentaD STR基因座,測序膠檢測擴增產(chǎn)物,通過對擴增產(chǎn)物條帶及面積的分析達(dá)到診斷唐氏綜合征的目的。本發(fā)明的方法與染色體核型分析相比具有以下優(yōu)點快速;靈敏度、特異度高;取材少;可以對大批量樣本同時進(jìn)行診斷,結(jié)果分析省時省力等。應(yīng)用QF-PCR擴增STR基因座方法快速、精確度高、自動進(jìn)樣和結(jié)果數(shù)據(jù)化等優(yōu)勢,是大規(guī)模產(chǎn)前診斷唐氏綜合征的理想工具。
文檔編號C12Q1/68GK101492730SQ20081015292
公開日2009年7月29日 申請日期2008年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月11日 公開號200810152923.發(fā)明者史云芳, 璐 孫, 岳天孚, 穎 張, 張秀玲, 巖 李, 李曉洲, 侃 王 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院