專利名稱：一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法
一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉醇真菌 的方法。
背景技術(shù)：
紫杉醇(paclitaxel,商品名Taxol)是一種復(fù)雜的天然的抗癌藥物，屬于二萜 生物堿，其基本結(jié)構(gòu)由漿果赤霉素III (baccatinIII)和連接其13位碳上一苯丙氨酸衍生物構(gòu) 成。
工業(yè)生產(chǎn)紫杉醇的早期策略，是采用從紅豆杉樹木原料中直接提取的方法，由于紫杉醇 含量極低，水溶解性差，生產(chǎn)l公斤紫杉醇， 一般需要7000公斤、相當(dāng)于2000-2500棵紅豆 杉樹木的原料，這給紅豆杉資源帶來嚴(yán)重威脅，造成生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞。
化學(xué)法全合成紫杉醇，已于1994年在實(shí)驗(yàn)室里取得了成功。伹是，紫杉醇手性基團(tuán)較多， 合成路線復(fù)雜，成本高、產(chǎn)率低，至今無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。
Christen首次利用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)紫杉醇后，研究吸引了眾多的實(shí)驗(yàn)室跟進(jìn)， 這方面的研究也取得了一定的進(jìn)展。但是這項(xiàng)技術(shù)同樣存在一些問題，如培養(yǎng)細(xì)胞的褐化問 題，雖有該技術(shù)進(jìn)入生物反應(yīng)器放大階段的試驗(yàn)，但未見實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道，短期內(nèi)成功應(yīng)用 的可能性較小。
國際制藥公司當(dāng)前較普遍采用的生產(chǎn)技術(shù)則是生化半合成法。半合成法雖然提高了紫杉 醇產(chǎn)量，但與直接提取紫杉醇的辦法并無本質(zhì)上區(qū)別，仍然需要消耗大量紅豆杉樹木。
由于紫杉醇的市場供應(yīng)受制于原料來源和制備技術(shù)兩方面的制約，使得藥價(jià)昂貴。為此，
制藥界和學(xué)術(shù)界一直在尋找新的更好的原料及方法，來代替現(xiàn)有的生產(chǎn)技術(shù)，以提高紫杉醇 的產(chǎn)量、滿足臨床需求。過去十余年中取得的最有意義的進(jìn)展，是發(fā)現(xiàn)了與紅豆杉等裸子木 本植物共生的一些真菌產(chǎn)生紫杉醇，并且其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性與紅豆杉所產(chǎn)紫杉醇完全相 同。
1993年，Stierle等從太平洋紅豆杉的韌皮部分離到l株內(nèi)共生真菌-安德烈紫杉菌 (roxomyce so"^ea"fle)，經(jīng)培養(yǎng)，采用質(zhì)譜、色譜(TLC/HPLC)和放射性化學(xué)標(biāo)記等方法，發(fā) 現(xiàn)該菌的發(fā)酵液中存在紫杉醇，盡管產(chǎn)量較低，每升發(fā)酵液僅含紫杉醇24-50ng。同時(shí)還證實(shí)， 這些真菌產(chǎn)生的紫杉醇與紅豆杉中紫杉醇結(jié)構(gòu)和性質(zhì)完全一樣。隨后，許多人分離到不同的 產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)共生真菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國內(nèi)外己報(bào)道的產(chǎn)生紫杉醇真菌種類已超過三十種，這些
真菌絕大多數(shù)是子囊菌或半知菌，而且都是內(nèi)共生真菌。但目前這些真菌發(fā)酵產(chǎn)物中紫杉醇 的含量很低，不能達(dá)到工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的水平，因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)地不能滿足市場的需求。解決這一問題的關(guān)鍵方法就是篩選得到紫杉醇的高產(chǎn)菌株。但目前常用的篩選方法是使 用有機(jī)溶劑如甲醇等抽提微生物的發(fā)酵樣品，再利用TLC和HPLC等進(jìn)行檢測，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi) 力，而且需要大量有機(jī)溶劑和HPLC等設(shè)備。
Mu等人(1999)報(bào)道終端腐霉(/ yA&m M加mwm)對紫杉醇非常敏感，低濃度(ICs。0.1 pM) 紫杉醇處理，其生長被抑制，相比Hela細(xì)胞(IC5Q0.25 ^M)更敏感。分析終端腐霉的|3-微管 蛋白氨基酸序列表明終端腐霉的p-微管蛋白與動(dòng)物細(xì)胞的同源性非常高，終端腐霉也以同 樣的方式受到紫杉醇的抑制。因此利用終端腐霉作為測試菌是可行的，可以替代培養(yǎng)動(dòng)物細(xì) 胞來檢測紫杉醇的生物活性。

發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明目的在于提供一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉 醇真菌的方法。
本發(fā)明提供的一種對紫杉醇敏感的微生物，終端腐霉(i^^u'www/"m,)。 本發(fā)明所述微生物終端腐霉的P-微管蛋白(p-tubulin)基因編碼區(qū)序列長657bp,其核苷 酸序列如序列表所示。
本發(fā)明提供的一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)終端腐 霉，利用終端腐霉對紫杉醇的敏感，在平板上能形成抑菌圈的方法，檢測真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中 是否含有紫杉醇。其包括產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵粗提物的制備、紫杉醇粗提物溶劑的選擇，終端 腐霉的接種方式和抑菌圈形成的培養(yǎng)條件等。
所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，自然pH，固體補(bǔ)加20g 瓊脂粉。
所述終端腐霉的接種方式采用塊狀菌絲體(約O.lmmxO.lmm)的直接接種方式。 所述的培養(yǎng)可以在本領(lǐng)域的常規(guī)或已知的條件下進(jìn)行。所述的培養(yǎng)可以在需氧條件下，
其特征在于所述的培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)PH值為PDA培養(yǎng)基自然PH，培養(yǎng)時(shí)間為2—3天。
所述產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵粗提物的制備包括以下步驟(1)從所得培養(yǎng)液分離出發(fā)酵菌體 和發(fā)酵上清液；(2)用有機(jī)溶劑提取所得發(fā)酵菌體，與發(fā)酵上清液一起進(jìn)行濃縮。
為了從培養(yǎng)基分離出紫杉醇，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)或已知的用于從微生物的培養(yǎng)基中分 離代謝物的任何分離方法。所述第(1)步中，菌絲體可以通過離心或過濾從發(fā)酵液中分離出 來。
所述第(2)步中可將所得發(fā)酵菌體干燥粉碎后，再用有機(jī)溶劑提取，所述干燥可按照本 領(lǐng)域常規(guī)或已知的方法進(jìn)行，例如真空冷凍干燥法。所述從發(fā)酵菌體中提取紫杉醇用的第一有機(jī)溶劑可以是本領(lǐng)域常規(guī)或已知的溶劑，例如甲醇。所述濃縮方法可按照本領(lǐng)域常規(guī) 或己知的方法進(jìn)行，例如減壓濃縮。 所述紫杉醇粗提物溶劑為甲醇。
所述抑菌圈形成的培養(yǎng)條件包括將終端腐霉接種到PDA平板的中心位置上，在其周邊 均勻擺放適當(dāng)數(shù)目的牛津杯，培養(yǎng)過夜；分三次將真菌發(fā)酵粗體物加到牛津杯中，每16小時(shí) 加樣一次，每次加樣量是50pL; 25。C恒溫培養(yǎng)2-4天；觀察抑菌圈形成。
本發(fā)明提供一株能產(chǎn)紫杉醇的腐生真菌擬盤多毛孢戶esto/orio戸"/m'cro^ora NK-17(菌種 保藏號CGMCCNo.2694)作為測試菌。
采用本發(fā)明的檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法，可以快速篩選出高產(chǎn)紫杉醇真菌。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果
采用本發(fā)明提供的檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法，簡單、靈敏、快速，能高效地篩選得到紫 杉醇的高產(chǎn)菌株


圖1是產(chǎn)紫杉醇真菌NK-17發(fā)酵粗提物與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)樣品的生物活性的檢測。 A.為產(chǎn)紫杉醇真菌NK-17發(fā)酵粗提物;B.紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品；C.甲醇空白對照.。 本發(fā)明提供的能產(chǎn)紫杉醇的菌株是一株腐生真菌擬盤多毛孢，已于2008年10月8曰保 藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中 國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號CGMCC No. 2694，分類命名尸esto/orio戸^ m&roipora 。
具體實(shí)施方式
下面將通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，這些描述并不是對本發(fā)明內(nèi)容作進(jìn)一步的 限定。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)理解，對發(fā)明技術(shù)特征所作的等同替換、或相應(yīng)的改進(jìn)，仍屬于 本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
實(shí)施例l、產(chǎn)紫杉醇真菌的發(fā)酵培養(yǎng)
在固體PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)產(chǎn)紫杉醇真菌，在28'C培養(yǎng)15-30天之后，菌株產(chǎn)生豐富的 孢子。以塊狀菌絲體的接種方式將菌株的菌絲和孢子接種于裝有200ml液體PDA培養(yǎng)基的 500mL三角瓶中發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28。C，轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)時(shí)間一般為7—15天左右。 在液體培養(yǎng)過程中，由于產(chǎn)物紫杉醇在pH 4-8之間是穩(wěn)定的，因此需要在發(fā)酵過程中監(jiān)測pH，使其處于該范圍之內(nèi)。
實(shí)施例2、產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵產(chǎn)物前處理過程
將發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抽濾，使得菌絲同發(fā)酵液分離開來；將抽濾后所得菌絲冷凍干燥，液氮 研磨破碎細(xì)胞之后使用甲醇浸提l-2天；將浸出液與之前的發(fā)酵液混合后再次進(jìn)行抽濾，除去 沉淀物，并調(diào)節(jié)pH至7.0;使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對上步所得濾液濃縮后得到粗提產(chǎn)物。
實(shí)施例3、終端腐霉的接種、培養(yǎng)及抑菌圈的形成
將終端腐霉采用塊狀菌絲體(約0.1 mmxo.l mm)的接種方式接種到PDA平板的中心位 置上，在其周邊均勻擺放適當(dāng)數(shù)目的牛津杯，培養(yǎng)過夜；分三次將真菌發(fā)酵粗體物加到牛津杯 中，每16小時(shí)加樣一次，每次加樣量是50^L; 25。C恒溫培養(yǎng)2-4天，觀察抑菌圈形成。
將紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品和紫杉醇粗提物的溶劑一甲醇作為對照，操作完全一致，觀察抑菌圈的 形成。(結(jié)果見圖1) A為產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵粗提物;B為紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品(1.5mg/mL) ;C為甲 醇空白對照。由圖1可見，甲醇作為紫杉醇粗提物的溶劑不影響終端腐霉的生長。產(chǎn)紫杉醇 真菌的發(fā)酵粗提物和紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品都能抑制終端腐霉的生長，形成抑菌圈。序列表
<110>南開大學(xué)
〈120〉一順單鵬檢測產(chǎn)膨鶴菌的方法 <160〉 1
<210> 1
<211〉 657
<212> DNA
<213〉終端腐霉(，/鵬utowwm)
<220>
<221〉 gene
<222〉 (1)…(657)
<400〉 1
tgcccatcgccaaaggtgtcggataccgtcgtcgasccatacaatgccacgctttcggtc60
caccagttggtcgaaaacgccgatgaagtcatgtgtttggataacgaggctctctacgat120
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權(quán)利要求
1、一株對紫杉醇敏感的微生物，終端腐霉(Pythium ultimum)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物菌株，其特征是該菌株的卩-微管蛋白(P-tubulin) 基因編碼區(qū)序列長657bp，其核苷酸序列如序列表所示。
3、 一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法，其特征在于在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求 1所述微生物，利用權(quán)利要求1所述的微生物對紫杉醇的敏感性，在平板上能形成抑菌圈的 方法，檢測真菌的發(fā)酵產(chǎn)物中是否含有紫杉醇。其包括產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵粗提物的制備、紫 杉醇粗提物溶劑的選擇，終端腐霉的接種方式和抑菌圈形成的培養(yǎng)條件等。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴 薯180-220g，蔗糖20g，自然pH，固體補(bǔ)加20g瓊脂粉。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于權(quán)利要求1所述微生物的接種方式采用 塊狀菌絲體(約0.1mmx0.1mm)的直接接種方式。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的培養(yǎng)溫度為25-30°C，培養(yǎng)PH值 為PDA培養(yǎng)基自然PH，培養(yǎng)時(shí)間為2 — 3天。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵粗提物的制備包 括以下步驟(1)從所得培養(yǎng)液分離出發(fā)酵菌體和發(fā)酵上清液；(2)用有機(jī)溶劑提取所得發(fā) 酵菌體，與發(fā)酵上清液一起進(jìn)行濃縮。
8、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于紫杉醇粗提物溶劑為甲醇。
9、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在抑菌圈形成的培養(yǎng)條件包括將權(quán)利 要求1所述的微生物接種到PDA平板的中心位置上，在其周邊均勻擺放適當(dāng)數(shù)目的牛津杯， 培養(yǎng)過夜；分三次將真菌發(fā)酵粗體物加到牛津杯中，每16小時(shí)加樣一次，每次加樣量是50 叱；25°C恒溫培養(yǎng)2-4天；觀察抑菌圈形成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種簡單快速檢測產(chǎn)紫杉醇真菌的方法，即利用終端腐霉(Pythium ultimum)對紫杉醇的敏感性，在平板上能形成抑菌圈的方法。其包括產(chǎn)紫杉醇真菌發(fā)酵粗提物的制備、終端腐霉的接種方式、紫杉醇粗提物溶劑的選擇和抑菌圈形成培養(yǎng)條件等。本發(fā)明可以替代培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞來檢測紫杉醇的生物活性，可以快速篩選出高產(chǎn)紫杉醇真菌。該方法直觀快速，簡單經(jīng)濟(jì)。
文檔編號C12N1/14GK101475911SQ20081015365
公開日2009年7月8日 申請日期2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日 公開號200810153656.發(fā)明者冰 嚴(yán), 媛 徐, 朱旭東, 畢建男, 皎 潘, 元 紀(jì) 申請人:南開大學(xué)