專(zhuān)利名稱(chēng)：一種edrf基因片段及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和基因治療學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種治療(3地中海貧血的EDRF基因片段及其相關(guān)的表達(dá)載體和科研、臨床上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
地中海貧血是由于某種或某些蛋白鏈合成速率降低造成一些肽鏈缺乏、另一些肽鏈相對(duì)增多，出現(xiàn)肽鏈數(shù)量的不平衡，導(dǎo)致的溶血性貧血。其中P地中海貧血(簡(jiǎn)稱(chēng)卩地貧)，由于(3鏈合成減缺，a鏈相對(duì)過(guò)多，多余的a鏈形成a包涵體。在未分化成熟的紅細(xì)胞內(nèi)，a鏈包涵體可以使細(xì)胞膜受到損傷，其中很大一部分在骨髓內(nèi)被破壞。部分紅細(xì)胞雖然能成熟并釋放至外周血內(nèi)，但由于a鏈包涵體附著在紅細(xì)胞膜上，使紅細(xì)胞變的僵硬，這種紅細(xì)胞通過(guò)微循環(huán)使，易被撕裂，摘除包涵體，形成淚滴狀紅細(xì)胞，且這種紅細(xì)胞壽命短，易被破壞，產(chǎn)生貧血、鐵沉積、脾大等癥狀，嚴(yán)重危害著患者的身心健康。因此，減少a珠蛋白的沉積造成的危害，對(duì)紅細(xì)胞生理功能的恢復(fù)和疾病的治療具有重要作用。
紅系分化相關(guān)因子(EDRF)，又名a血紅蛋白穩(wěn)定蛋白，是一種在紅細(xì)胞系高表達(dá)的蛋白質(zhì)，與紅細(xì)胞系的發(fā)生密切相關(guān)。近年來(lái)研究進(jìn)一步證實(shí)，EDRF是a血紅蛋白分子伴侶，它能與a血紅蛋白結(jié)合，但不能與P珠蛋白或血紅蛋白四聚體結(jié)合。EDRF能維持a血紅蛋白的穩(wěn)定性，保持a血紅蛋白可溶性，減弱a珠蛋白沉積對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用?？梢?jiàn)EDRF能穩(wěn)定a血紅蛋白，減少過(guò)多a血紅蛋白造成的危害，當(dāng)EDRF與a血紅蛋白結(jié)合后，可使血紅素上的鐵離子與遠(yuǎn)端及近端的組氨酸結(jié)合，引起a血紅蛋白的a螺旋等結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變，這種結(jié)構(gòu)上的改變可有效地抑制活性的氧離子ROS的生成及血紅素與a珠蛋白的分離。上述過(guò)程是EDRF穩(wěn)定a血紅蛋白、保護(hù)細(xì)胞損傷作用的機(jī)理。在本發(fā)明之前，P地貧的治療主要有藥物治療，如羥基脲、丁酸等誘導(dǎo)胎兒
型血紅蛋白增多以取代P珠蛋白基因合成不足；骨髓移植療法(但缺乏有效的供體)；轉(zhuǎn)基因治療(如p-珠蛋白基因)；反義基因治療異常P鏈的方法等。但是上述的方法都有缺陷，不能達(dá)到滿(mǎn)意的治療效果。而本發(fā)明意在創(chuàng)立一種新的治療方法，應(yīng)用EDRF穩(wěn)定過(guò)多的oc珠蛋白肽鏈，降低其沉積，目的是減輕多余的a鏈形成a包涵體的危害，證明EDRF基因表達(dá)在紅細(xì)胞系和疾病治療中的價(jià)值，為地中海貧血的治療提供新的思路。應(yīng)用這一新的載體進(jìn)行P地貧治療的方法未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有治療方法中的不足，提供一種治療P地中海貧血的EDRF基因片段及其相關(guān)的表達(dá)載體。本發(fā)明的技術(shù)方案是(一)有效長(zhǎng)度EDRF啟動(dòng)子的篩選
1、 不同長(zhǎng)度EDRF啟動(dòng)子的克隆
設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子的序列，用以擴(kuò)增EDRF啟動(dòng)子。擴(kuò)增條件如下變性94'C45s、退火45s、延伸72'C60s，共32個(gè)循環(huán)。引物序列及退火溫度見(jiàn)表l，擴(kuò)增區(qū)域見(jiàn)圖l。 PCR產(chǎn)物用2c/。瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析結(jié)果。
2、 構(gòu)建不同的GFP載體分析啟動(dòng)子的作用效果
用上述不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，并構(gòu)建相應(yīng)的載體。首先，通過(guò)EcoR I和Not I兩酶切位點(diǎn)從pGEP-Nl載體(Invitrogen)上獲得GFP基因，并用同樣的酶切位點(diǎn)將GFP連接至pcDNA(3.1+)/ZEO (Invitrogen)載體上，構(gòu)建pcDNA-GFP載體。然后，將上述啟動(dòng)子經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆至pUCm-T載體上(Takara)，構(gòu)建pUCm-promoter載體。通過(guò)EcoR V和HindIII酶切pUCm-T載體獲得啟動(dòng)子，并應(yīng)用Nru I和HindIII酶切位點(diǎn)克隆至pcDNA-GFP載體上，最終獲得pcDNA-Pro-GFP載體。
3、 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
NIH3T3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM (GIBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)，小鼠的
4MEL細(xì)胞用含15。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，并用1.5。/。的DMSO (Sigma)誘導(dǎo)分化成熟。所有細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所，用37'C5。/。C02培養(yǎng)。4、 GFP的檢測(cè)和分析
熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收集細(xì)胞，用熒光顯微鏡(Leica,DMRXA2)觀(guān)察結(jié)果，其中NIH3T3細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化。
流式細(xì)胞儀分析(FACS):細(xì)胞收集后，用PBS洗2次，然后用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果(Becton Dichinson FACS caliber),通過(guò)GFP的表達(dá)反應(yīng)EDRF啟動(dòng)子的效率。
(二) pcDNA-EDRF表達(dá)載體的構(gòu)建及其治療作用
1、 用有效的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EDRF表達(dá)載體的構(gòu)建
通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的GFP表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后確定最有效的啟動(dòng)子長(zhǎng)度為372bp，由此為依據(jù)重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EDRF基因，引物序列為-
F4: 5，誦GGCCTTGTTATCTTTCTACCT國(guó)3，(與弓l物F3基本一致，畫(huà)112bp);R3: 5'畫(huà)TTCT TGTTTCTGCCACCC國(guó)3' (+1168bp)。
PCR反應(yīng)條件為變性94-C60s，退火54。C60s，延伸72°C90s;共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，并測(cè)序。'
將擴(kuò)增的EDRF基因及其啟動(dòng)子連接至pUCm-T (Takara)載體上，構(gòu)建了 pUCm- EDRF載體，然后，通過(guò)EcoRV和Bamffl酶切pUCm-EDRF載體獲得EDRF基因及其啟動(dòng)子，并應(yīng)用Nrul和BamHI酶切位點(diǎn)克隆至pcDNA(3.1+)/ZEO載體(Invitrogen)上，最終獲得pcDNA-EDRF表達(dá)載體。
2、 人EDRF在小鼠體內(nèi)的表達(dá)及pcDNA-EDRF載體對(duì)P地中海貧血小鼠的治療作用
為了研究EDRF基因的治療作用，處理小鼠后發(fā)現(xiàn)，該載體能在正常小鼠體內(nèi)有效的表達(dá)人的EDRF因子，而且該蛋白表達(dá)能改善|3654-地貧小鼠的貧血癥狀，本研究結(jié)果對(duì)卩654-地貧貧血的治療具有重要價(jià)值。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明篩選了有效的EDRF啟動(dòng)子，用有效的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EDRF表達(dá)，構(gòu)建有效的EDRF表達(dá)載體，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該載體能夠
5穩(wěn)定過(guò)多的a珠蛋白肽鏈，降低其沉積，減輕多余的a鏈形成ot包涵體的危害， 證明EDRF基因表達(dá)在紅細(xì)胞系和疾病治療中的價(jià)值，為地中海貧血的治療提 供了新的思路。
下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)地說(shuō)明。


圖h不同引物擴(kuò)增EDRF基因及啟動(dòng)子示意其中F1畫(huà)F4:正向引物；Rl-R3:反向引物；
CAC:外顯子l起始點(diǎn)；ATG:翻譯起始點(diǎn)； 圖2:不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)載體構(gòu)建示意圖3: pcDNA-EDRF構(gòu)建示意圖4:不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子及載體構(gòu)建鑒定其中A、 PCR擴(kuò)增不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子結(jié)果
M: 100bp marker標(biāo)記物；
泳道lanel-5:五個(gè)不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子
697bp, 496bp， 484p， 372bp， 283bp;
B、 一種pcDNA-Pro-GFP載體和pcDNA-EDRF載體酶切鑒定圖
泳道Lanel-2: pcDNA-Pro-GFP載體(啟動(dòng)子長(zhǎng)度為372bp);
Lanel: Not I酶切分析產(chǎn)物長(zhǎng)度為4800bp，1152bp;
Lane2: Nw I +^'^/111酶切分析產(chǎn)物長(zhǎng)度為4800bp， 772bp， 380bp;
泳道Lane3-4: pcDNA-EDRF載體；
Lane3: HzV^III酶切分析產(chǎn)物長(zhǎng)度為5410bp, 669bp;
Lane4: No/I酶切分析產(chǎn)物長(zhǎng)度為4800bp, 1280bp; 圖5:熒光顯微鏡觀(guān)測(cè)GFP在細(xì)胞中的表達(dá)(100X); 其中A: GFP在NIH3T3細(xì)胞中表達(dá)；
B: GFP在MEL細(xì)胞中表達(dá)；
I ,II,in，IV，V，VI:分別為GFP在對(duì)照組、496bp啟動(dòng)子組、283bp 啟動(dòng)子組、697bp啟動(dòng)子組、484bp啟動(dòng)子組、372bp啟動(dòng)子組；圖6:檢測(cè)人的EDRF基因在小鼠Md細(xì)胞中表達(dá)；
其中泳道Lanel、 3:用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處理Mel結(jié)果； Lane2、 4:用pcDNA-EDRF對(duì)照載體處理Mel結(jié)果；
圖7:人EDRF基因在小鼠體內(nèi)的表達(dá)分析(RT-PCR);
其中泳道Lanel:用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處理正常小鼠； Lane2:用pcDNA-EDRF載體處理正常小鼠； Lane3:用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處理P-地中海貧血小鼠； Lane4、 5:用pcDNA-EDRF載體處理p-地中海貧血小鼠；
圖8:用ELISA分析EDRF/AHSP的表達(dá)情況；
其中A:正常小鼠組
正常小鼠(healthymice， n=5):用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處
理正常小鼠；
Exp-l、 Exp-2、 Exp-3:三只用pcDNA-EDRF載體處理正常小鼠； B:P-地中海貧血小鼠組
正常小鼠(healthymice， n=5):用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處
理正常小鼠；
卩-地中海貧血小鼠(654- mice):用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處
理p-地中海貧血小鼠； Exp-l-654、 Exp-2-654、 Exp-3-654:三只用pcDNA-EDRF載體
處理P-地中海貧血小鼠； 圖9: P地中海貧血小鼠血液涂片分析血細(xì)胞形態(tài)的改變； 其中A: (3-地中海貧血小鼠用pcDNA-EDRF對(duì)照載體處理p-地中海貧
血小鼠；
B: (3-地中海貧血小鼠用pcDNA(3.1+)/ZEO對(duì)照載體處理P-地中
海貧血小鼠；
C:正常小鼠；
圖10: P地中海貧血小鼠治療后Hb和RBC的改變分析；其中A: Hb血紅蛋白的改變(『5);
B: RBC紅細(xì)胞數(shù)目的改變(n-5)。
具體實(shí)施例方式
以下以有效長(zhǎng)度EDRF啟動(dòng)子的篩選、pcDNA-EDRF表達(dá)載體的構(gòu)建及其 治療作用為例，為本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。這些實(shí)例是針對(duì)于本發(fā)明所作的說(shuō) 明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
本發(fā)明中，.以上所述和以下的實(shí)施例中，所使用的技術(shù)，包括基因測(cè)序、 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、載體構(gòu)建等分子生物學(xué)技術(shù)，以及細(xì)胞培養(yǎng)、檢 測(cè)技術(shù)等，除非特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)；所使用 的儀器設(shè)備、試劑、質(zhì)粒和載體、細(xì)胞系等，除非是本說(shuō)明書(shū)特別注明，均為 一般本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過(guò)公共途徑獲得的。
實(shí)施例l，有效長(zhǎng)度EDRF啟動(dòng)子的篩選
1、 不同長(zhǎng)度EDRF啟動(dòng)子的克隆
設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子的序列，從人基因組DNA克隆EDRF基因啟動(dòng)子， 引物序列見(jiàn)表l，具體擴(kuò)增的基因區(qū)域見(jiàn)圖1。擴(kuò)增條件如下變性94"C45s、 退火45s(具體退火溫度見(jiàn)表1)、延伸72°C60s，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析結(jié)果。
設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子的序列，用以擴(kuò)增EDRF啟動(dòng)子。擴(kuò)增條件如下 變性94"C45s、退火45s、延伸72"C60s，共32個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖 凝膠進(jìn)行電泳，分析結(jié)果，分別獲得了長(zhǎng)度為697bp、 496bp、 484bp、 372bp 和283bp的啟動(dòng)子，見(jiàn)圖4A。測(cè)序正確(上海博尚生物技術(shù)有限公司)，結(jié)果 正確(略)。
2、 構(gòu)建不同的GFP載體分析啟動(dòng)子的作用效果
用上述不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)GFP的表達(dá)，并構(gòu)建相應(yīng)的載體。首先， 通過(guò)EcoR I和Not I兩酶切位點(diǎn)從pGEP-Nl載體(Invitrogen)上獲得GFP基 因，并用同樣的酶切位點(diǎn)將GFP連接至pcDNA(3.1+)/ZEO (Invitrogen)載體 上，構(gòu)建pcDNA-GFP載體。然后，將上述啟動(dòng)子經(jīng)PCR擴(kuò)增后克隆至pUCm-T
8載體上(Takara)，構(gòu)建pUCm-promoter載體。通過(guò)EcoRV和HindIII酶切 pUCm-T載體獲得啟動(dòng)子，并應(yīng)用Nru I和HindIII酶切位點(diǎn)克隆至pcDNA-GFP 載體上，最終獲得pcDNA-Pro-GFP載體用于研究(圖2)。進(jìn)一步克隆了 pcDNA-Pro-GFP載體。通過(guò)兩組酶切(Nod , No/I+H/^/)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果 正確，見(jiàn)圖4B。
3、細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染及GFP的檢測(cè)和分析
NIH3T3細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM (GIBICO)培養(yǎng)基培養(yǎng)，小鼠的 MEL細(xì)胞用含15。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，并用1.5。/。的DMSO (Sigma)誘 導(dǎo)分化成熟。所有細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所，用37'C5。/。C02培養(yǎng)。
熒光檢測(cè)轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收集細(xì)胞，用熒光顯微鏡(Leica，DMRXA2)觀(guān)察 結(jié)果，其中NIH3T3細(xì)胞，用0.25%的胰酶消化。
流式細(xì)胞儀分析(FACS):細(xì)胞收集后，用PBS洗2次，然后用流式細(xì)胞 儀分析結(jié)果(Becton Dichinson FACS caliber)，通過(guò)GFP的表達(dá)反應(yīng)EDRF啟 動(dòng)子的效率。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)在NIH3T3細(xì)胞和Md細(xì)胞中，372bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子(EDRF基因的 -116~+256區(qū))驅(qū)動(dòng)GFP表達(dá)的效果最好，熒光強(qiáng)度最亮、陽(yáng)性細(xì)胞最多(圖5A, B)。 FACS進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在MEL細(xì)胞中，372bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子組，GFP細(xì)胞的 陽(yáng)性率(11.2±0.6)%明顯高于其他長(zhǎng)度啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)組；但在非紅細(xì)胞NIH3T3細(xì) 胞中，372bp長(zhǎng)的啟動(dòng)子組，GFP細(xì)胞的陽(yáng)性率MEL細(xì)胞中為(31.0士0.7。/。)，與其 他組相比差別不是很大，上述差別說(shuō)明該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)有一定的組織 特異性(表2)。
實(shí)施例2:: pcDNA-EDRF表達(dá)載體的構(gòu)建及其治療作用
1、用上述有效啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)EDRF的表達(dá)載體構(gòu)建
通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的GFP表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后確定最有效的啟動(dòng)子長(zhǎng)度 為372bp，由此為依據(jù)重新設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EDRF基因，引物序列為
F4: 5，國(guó)GGCCTTGTTATCTTTCTACCT國(guó)3，(與引物F3基本一致，-112bp); R3: 5 ，-TTCT TGTTTCTGCCACCC-3 '(+1168bp);
9PCR反應(yīng)條件為變性94。C60s,退火54。C60s，延伸72°C 90s;共30個(gè) 循環(huán)。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，并測(cè)序。
將擴(kuò)增的EDRF基因及其啟動(dòng)子連接至pUCm-T (Takara)載體上，構(gòu)建 了 pUCm- EDRF載體，然后，通過(guò)EcoRV和BamHI酶切pUCm-EDRF載體獲 得EDRF基因及其啟動(dòng)子，并應(yīng)用Nrul和BamHI酶切位點(diǎn)克隆至 pcDNA(3.1+)/ZEO載體(Invitrogen)上，最終獲得pcDNA-EDRF表達(dá)載體用 于研究(圖3)，用H/m/m和Notl兩種酶切鑒定，結(jié)果正確(圖4B)，測(cè)序結(jié)果 見(jiàn)序列表。
2、 檢測(cè)EDRF表達(dá)的方法
RT-PCR:總RNA的提取根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(Gentra公司，總RNA提取 試劑盒)，cDNA合成體系如下1.5嗎的總RNA、 4|ul dNTP(10mmol/L)、 0.5^il oligo-dT(0.5mg/ml)、 逆轉(zhuǎn)錄酶(RT, New England)、 DEPC H20至20W。于 70。C10min;冰上2min; 37°C lh合成cDNA。
EDRF基因擴(kuò)增引物為
正向5'畫(huà)CGCAGGATTGAAGGAGTTC-3，；
反向5，-GTGTCAGGGTAGAGTGGC-3，。
(3-actincDNAs引物(參照基因)為
正向5 ，-CTACAATGAGCTGCGTG TGGC畫(huà)3 ，；
反向5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC國(guó)3'。
反應(yīng)條件為變性94。C45s、退火57。C45s、延伸72°C45s,共28個(gè)循環(huán)。 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢觀(guān)"具體過(guò)程簡(jiǎn)述如下將MEL細(xì)胞和小 鼠的血細(xì)胞裂解，于包被抗鼠的酶標(biāo)板內(nèi)包被，然后分別加山羊抗人EDRF的 單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology), 二抗(兔抗山羊的IgG, Abeam)及 底物等。用酶標(biāo)儀(ELx800)于OD45。nm波長(zhǎng)檢測(cè)。
3、 人EDRF在小鼠體內(nèi)的表達(dá)
為了研究pcDNA-EDRF表達(dá)載體能否在小鼠體內(nèi)有效的表達(dá)，我們純化了 pcDNA-EDRF質(zhì)粒(方法見(jiàn)Promega Kit說(shuō)明)，首先我們?cè)诩?xì)胞水平驗(yàn)證了載體的表達(dá)效果，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)EDRF在小鼠的MEL中能高效的表達(dá)(圖6)。 接著對(duì)5只正常小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將30-35ug pcDNA-EDRF質(zhì)粒溶于800ul生理鹽液 中，尾靜脈注射小鼠，7天后檢測(cè)小鼠外周血，觀(guān)察基因表達(dá)的結(jié)果。RT-PCR 發(fā)現(xiàn)人的EDRF基因能在小鼠血液細(xì)胞中表達(dá)(圖7.1ane2) 。 ELISA分析發(fā)現(xiàn)， pcDNA-EDRF處理的小鼠體內(nèi)，EDRF表達(dá)量約4 mg/ml (圖8)。
4、 pcDNA-EDRF載體對(duì)p地中海貧血小鼠的治療作用
為了觀(guān)察pcDNA-EDRF載體對(duì)p地中海貧血的治療作用，我們又對(duì)5只p654-地貧小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，注射劑量和方法同上。其中P^-地貧小鼠購(gòu)自美國(guó)Jackson Laboratory(JAX)。該小鼠模型利用基因打耙技術(shù)，敲入人的致病基因(異常剪 接的P珠蛋白基因)，代替了小鼠的p珠蛋白基因。這種模型的雜合子小鼠細(xì)胞中 有一條編碼人的異常剪接(3珠蛋白肽鏈和一條編碼小鼠的P珠蛋白肽鏈基因，能 表達(dá)人的異常剪接I3珠蛋白肽鏈，表現(xiàn)出典型(3地貧病人的貧血癥狀，是一種很 好地研究(3地貧的模型工具。
當(dāng)J3^-地貧小鼠用pcDNA-EDRF載體處理后，血涂片分析發(fā)現(xiàn)，|3654-地貧小 鼠的靶形細(xì)胞和異性細(xì)胞總數(shù)明顯減低，從原來(lái)的50%降低為約38.4±2.3% (p<0.05，圖9);血紅蛋白的量，從原來(lái)的7.1士0.3 g/dL上升到7.93士0.2g/dL;由于 治療作用，機(jī)體代償造血，紅細(xì)胞數(shù)目RBC從原來(lái)的5.5xl()S/nl上升到6.4xl06/^ (圖IO)。而對(duì)照組|3654-地貧小鼠，用對(duì)照載體pcDNA(3.1+)/ZEO處理，異性細(xì)胞 和靶型細(xì)胞總數(shù)、血液學(xué)指標(biāo)沒(méi)有明顯的變化。這一治療效果，可能與EDRF 在|3654-地貧小鼠體內(nèi)表達(dá)有關(guān)系，證明了載體的治療作用。RT-PCR(圖7， lane 4,5) 和ELISA (圖8)檢測(cè)結(jié)果支持這一治療效果。表格-
表l:用引物擴(kuò)增不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子
引物擴(kuò)增長(zhǎng)度(bp)序列及退火溫度(Tm)F1-R1512F1: 5' -gtggcttatctgcaaaat-3';Rl:5 ， -tgagggtgcgtgaatctc-3 ，；
Tm(50。C)
F2陽(yáng)R1310F2: 5'陽(yáng)catttcgagcctggatac-3';Rl:5 ， -tgagggtgcgtgaatctc-3,;
Tm(54。C)
Fl-R2712F1: 5 ， -gtggcttatctgcaaaat-3 ，；R2:5 ， -aagggtagaatttacatatc-3';
Tm(50。C)
F2陽(yáng)R2504F2: 5'-catttcgagcctggata-3，；R2:5'-aagggtagaatttaeatatc隱3，；
Tm(52。C)
F3-R2378F3: 5，-ttttggccttgttatctt隱3，；R2:5 ， -aagggtagaatttacatatc-3 ，；
Tm(48。C)
表2:流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)
啟動(dòng)子啟動(dòng)子的長(zhǎng)度(bp)GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例(％)NIH3T3細(xì)胞Mel細(xì)胞
F1陽(yáng)R149620.1±1.04.3±0.5
F2-R128325.3±0.64.5±0.4
Fl-R269727.1±1.17.8±0.6
F2-R248427.2±0.98.5±0.4
F3-R237231.0±0.711.2±0.6
陰性Blank-對(duì)照—0.2±0.10.6±0.2
12SEQ ID NO: 1序列表一測(cè)序表
<〉plasmid <> (1500) 〈〉1
gcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttUgcgctgcttcgat60
cccatgggcggcgcctgcagaccaggtctggccttgttatctttctaccttc鄉(xiāng)g33gc120
ctctcccttcttctcctccctsgaatga cctatcaccctccttcaggacct卿tgc鄉(xiāng)180
gcgtttctatcttaggctgacacttgactccttgcctacatctatagcttggcacag卿240
gattcacgcaccctc犯gagtgtgggtgag3C￡Lt￡lt3C3gcctgttagacctg犯ggtga300
gcccaacctgggaa犯tcgtgacctcagagc鄉(xiāng)gcaggatgtga犯ggttttggaa鄉(xiāng)360
agatagccctgc鄉(xiāng)gc郷sgggattttt gggttgggggaaatacc420
ggaa^ca^tatgtaaattctacccttttctctacccaggcagatggctc480
ttctt犯ggccaataaggatctcatttccgC3ggElttg￡L6Lggagttcagcgttctgctga540
atcagcaggtg3gtcca3gctttccatttc犯鄉(xiāng)ELCtggcctggsgactggggggtgcc600
gggg鄉(xiāng)tgg3gga卿ggataattggagctggtgaagta3tggtgg3gttgatggaaac660
aacgsiga^c3tgC卿gg3g卿gttggtgctgtggcac720
tattctagtsttcccgaatcccattgctggiccacattctcccttgccaactgcctctccg780
CaBCCCCCC￡Lggtcttcaatgatcctctcgtctctgaaga卿catggtgactgtggtgg840
gaacttctacatcaactattacaggcagcaggtg3C3ggggagccccaag900
ggctctgcaggagcttcggc肌gagctg犯cactctggccaaccctttcc960
tggccaagtacagggacttcctgaagtctcatgagctcccgagtcacccaccgccctcct1020
cctagctcagggacccagcccctcctctctgaga犯ctctgaccttcatgtccttaggct1080
gtgctcctgccactctaccctgacacctcaataaagaccagtgctggttttgttggactt1140
cctggcttctctttcatggtctgtcctgacatgtggaggcactcggtccctttccttccg1200
ccctccttcttagatatgctcttggaagctt犯ttccttacagc卿ggttagcagcctt1260
gagtg￡LCC￡LCcgggcsgcgattctaaacta3￡L￡lC3ggCtg犯cgagggcc鄉(xiāng)犯ggcgg1320
gactag卿gagtgc卿gctgcaggggagggggtggcsg卿ctgg卿1380
tctggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgc1440
tcgagtctagagggcccgtttsaacccgctgatcagcctcgactgtgccttcta1500
權(quán)利要求
1、一種EDRF基因片段，其序列如SEQ ID NO1所示。
2、 一種EDRF基因片段的表達(dá)載體，其特征是，該表達(dá)載體具有權(quán)利要求1所述基因片段。
3、 一種EDRF基因片段在治療(3地中海貧血中的應(yīng)用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種EDRF基因片段在治療j3地中海貧血中的應(yīng)用，其特征是，應(yīng)用EDRF穩(wěn)定過(guò)多的oc珠蛋白肽鏈，降低其沉積，緩解(3地中海貧血癥狀。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種EDRF基因片段及其表達(dá)載體，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，該載體能夠穩(wěn)定過(guò)多的α珠蛋白肽鏈，降低其沉積，減輕多余的α鏈形成α包涵體的危害，緩解了β⁶⁵⁴-地貧小鼠的貧血癥狀，證明EDRF基因表達(dá)在紅細(xì)胞系和疾病治療中的價(jià)值，為地中海貧血的治療提供了新的思路。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101475936SQ20081015777
公開(kāi)日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日
發(fā)明者真 岳, 強(qiáng) 李, 李尊嶺, 李有杰, 飛 焦, 王萍玉, 謝書(shū)陽(yáng) 申請(qǐng)人:濱州醫(yī)學(xué)院