專利名稱：：一種別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種新型熒光蛋白質(zhì)的制備方法。
背景技術(shù)：
：藻膽蛋白主要存在于原核的藍藻、真核的紅藻、隱藻和甲藻(Pyrr叩hyta)中。根據(jù)吸收光譜的不同，可將藻膽蛋白分為4大類即藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)，藻紅藍蛋白(phycoerythrocyanin，PEC),藻藍蛋白(phycocyanin，PC)和別藻藍蛋白(也稱異藻藍蛋白，allophycocyanin，APC)。藻膽蛋白脫輔基蛋白含有a和p亞基。藻膽蛋白中的色基稱為藻膽素(phycobilin),藻膽素的A或D環(huán)，或A、D兩環(huán)同時與脫輔基蛋白的半胱氨酸殘基通過硫醚鍵共價連接。藻膽素與脫輔基蛋白共價結(jié)合形成特定的構(gòu)像，使得不同種類的藻膽蛋白呈現(xiàn)不同的光學特性。藻紅蛋白主要吸收約560nm的可見光，發(fā)射光約580nm的熒光；藻紅藍蛋白吸收約570nm的可見光，發(fā)射光約630nm的熒光；藻藍蛋白吸收約620nm的可見光，發(fā)射光約640nm的熒光；別藻藍蛋白吸收約650~660nm的可見光，發(fā)射光約660670nm的熒光。藻紅蛋白結(jié)合的色基為藻紅膽素(phycoerythrobi1in，簡稱PEB);藻紅藍蛋a亞基白結(jié)合的色基為藻紫膽素(phycoviolobilin，簡稱PVB),|3亞基結(jié)合的色基為藻膽膽素(phycocyanobi1in，簡稱PCB);藻藍蛋白和別藻藍蛋白結(jié)合的色基都是藻藍膽素PCB。藻膽蛋白具有提高人體免疫力，促進動物細胞再生的功能；可以抑制癌細胞生長，減輕腫瘤化療的副作用；同時也是一種無毒副作用的理想的光敏劑；藻膽蛋白作為一種天然色素，也可以應用于食品和化妝品中。由于有強烈的熒光特性，藻膽蛋白還可以制備成熒光探針，在免疫學、細胞生物學和分子生物學研究中有著廣泛的應用。藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)可用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域，目前使用的藻膽蛋白類熒光蛋白質(zhì)主要從藍藻和紅藻中提取(高純度藻膽蛋白的分離方法，CN1344723，2002.04.17;—種水華藍藻制備藻藍蛋白的方法，CN1563083，2005.01.12);基因工程合成別藻藍蛋白熒光蛋白質(zhì)的方法(一種制備別藻藍蛋白熒光蛋白質(zhì)的方法，200710029673.X，2007.8.9)需要構(gòu)建多個質(zhì)粒先后轉(zhuǎn)化,構(gòu)建過程較復雜，菌種不穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容為克服上述缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種熒光蛋白質(zhì)的制備方法。為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明釆用的技術(shù)方案為別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，包括以下步驟1)將別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和藻膽素生物合成酶基因(/fo;d和pc;M)克隆于同一表達載體中，得到脫輔基蛋白和色素合成酶共同的表達質(zhì)粒；2)將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌發(fā)酵生產(chǎn)別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，用常規(guī)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，一步純化得到相應的別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。藻膽素自催化色基與脫輔基蛋白的共價結(jié)合，合成別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。所述表達載體為pCDFDuet-l。別藻藍蛋白脫輔基蛋白基因是指與SynechocystisPCC6803或者Anabaenasp.PCC7120中別藻藍白蛋白a亞基的同源基因。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點1.不需要裂合酶基因，本發(fā)明利用自催化方式催化脫輔基蛋白和色基結(jié)合，生產(chǎn)的熒光蛋白具有和天然藻藍蛋白和別藻藍蛋白不同的熒光特性，其具有分子量較小，成分單一，易于交聯(lián)和進入細胞.帶有HIS6標簽，便于分離純化，純化方法簡單，一步完成.得到的的蛋白為均一單體，不是不同亞基和聚合體的混合物.最大激發(fā)光波長為647nm，處于天然藻藍蛋白和別藻藍蛋白之間。本發(fā)明將別藻藍蛋白或者藻藍蛋白脫輔基蛋白基因和藻膽素生物沒合成基因插入同一表達質(zhì)粒，表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，得到相應的工程菌，通過這種方法得到的基因工程菌生產(chǎn)熒光蛋白質(zhì)。2.不使用藻類為原料而是利用大腸桿菌生產(chǎn)新型熒光蛋白質(zhì)，大腸桿菌易于培養(yǎng)，生長快，可以大大縮短生產(chǎn)周期；與藻類相比，大腸桿菌細胞壁易于破碎，純化過程可以節(jié)約能源。3.本發(fā)明通過大腸桿菌誘導表達，目標蛋白含量高；含有His-tag標記，由于表達體系中沒有類似蛋白，通過離子螯合色譜一步純化便可獲得目的蛋白，且純度較高。同時可以規(guī)?；l(fā)酵，高效表達新型熒光蛋白質(zhì)，也便于對熒光蛋白進行分子設(shè)計，有利于制造其它類型的新型熒光蛋白質(zhì)材料。4.本發(fā)明簡化了質(zhì)粒構(gòu)建過程，構(gòu)建單一質(zhì)粒，菌種較穩(wěn)定，可以規(guī)模化發(fā)酵生產(chǎn)一種新型熒光蛋白質(zhì)，該蛋白的最大發(fā)射波長在天然藻藍蛋白和別藻藍蛋白之間；藻藍蛋白和別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)具有優(yōu)良的熒光性質(zhì)，為了發(fā)展新型熒光探針，可以分子設(shè)計和改造藻藍蛋白和別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì);本發(fā)明為藻藍蛋白和別藻藍蛋白類色素蛋白質(zhì)功能材料應用于食品、化妝品、醫(yī)藥和生物工程領(lǐng)域提供了一種簡單有效的新方法。圖1為本發(fā)明別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)l)。4圖2為本發(fā)明實施例1所得別藻蛋白類熒光蛋白1的熒光光譜。圖3本發(fā)明別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)2)。圖4為本發(fā)明實施例2所得別藻蛋白類熒光蛋白2的熒光光譜。圖5為本發(fā)明別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)3)。圖6為本發(fā)明實施例3別藻蛋白類熒光蛋白3的熒光光譜。圖7為別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)4)。圖8為本發(fā)明實施例4所得別藻蛋白類熒光蛋白4的熒光光譜。圖9別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(其中泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)5)。圖10為本發(fā)明實施例5別藻蛋白類熒光蛋白5的熒光光譜。圖11為別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)6)。圖12為本發(fā)明實施例6別藻蛋白類熒光蛋白6的熒光光譜。圖13為別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)和天然別藻藍蛋白的SDS-PAGE電泳圖(其中，泳道l:蛋白分子量marker;泳道2:天然別藻藍蛋白；泳道3:別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)7)。圖14為本發(fā)明實施例7別藻蛋白類熒光蛋白7的熒光光譜。具體實施例方式下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳述；實施例l:(1)從Genebank中可以查到，藻Synechocystissp.PCC6803的全序列已經(jīng)測定完成。Synechocystissp,PCC6803在Genebank中編號為BA000022，可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的Synechocystissp.PCC6803的apcA，hoxl，pcyA基因序歹'j，設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以Synechocystissp.PCC6803基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因。_<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>鐘)hoxl5'TGCATATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG3'Ndel30循環(huán)(94。C5分鐘，5'TTGATATCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG3'EcoRV94°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C1分鐘，72°C10分PcyA鐘)5'TTGATATCAATAAGGAGATATCACATGGCTCEcoRV30循環(huán)(94。C5分鐘，ACTGATTTAAGTTTGACC3'Xhol94°C1分鐘，55°C1分鐘，5'TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAG72。C1分鐘，72。C10分AC3'鐘)(2)將Sy腦hocystissp.PCC6803中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白apcA!基因克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l載體中，基因插入載體的步驟為把步驟l)經(jīng)過PCR擴增得到的apcAi基因片段進行電泳(120V，40分鐘)，回收apcAi的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體pCDFDuet-1用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcAiPCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuetTM-l;酶切后的apcA,PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l按為3ju1:1ju1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(4'C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuet-l-apcA1;把質(zhì)粒pCDFDuet-1-apcA,轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將步驟1)得到的克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuetTM-l-apcA,載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-l-apcA「hoxl-pcyA，這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白oc亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA:在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcAHiox1-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)過夜；取100W飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為().6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g，4°C)棄去上清，菌體沉淀用10(^L預冷的0.lmol/LCaCl2重懸，加入步驟2)所得質(zhì)粒，混勻后冰浴30min,42。C熱激90s,冰浴5min后加入40(mLLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上，倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。將上述工程菌接種于pH7.O的LB液體培養(yǎng)基中，37'C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入異丙基硫代-p-D-半乳糖苷(isoprophylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L，28。C培妹8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白l(參見圖l)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出10(mL轉(zhuǎn)接至5mL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分,表達8-10小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖2)，選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。由圖可知本發(fā)明別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)最大可見吸收為625nm，具有和天然藻膽蛋白相同的紫外吸收特性.其分子量為22KDa,為均一的單體，不同于天然別藻藍蛋白的聚合體和不同亞基的混合物；本發(fā)明別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)最大發(fā)射波長為647nm，不同于天然別藻藍蛋白的660nm。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白l的程序如下取保存的菌種10(^L無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進行，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37C,轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300-500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以0.16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25。C,然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L，降低轉(zhuǎn)速至150rpm，誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白1。實施例2:(1)從Genebank中可以查到，藻種Synechocystissp.PCC6803的全序列已經(jīng)測定完成。Anabaenasp.Synechocystissp.PCC6803在Genebank中編號為BA000022,可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的Synechocystissp.PCC6803的apcA，hoxl，pcyA基因序列，設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以Anabaenasp.PCC7120基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因。_引物序列限制性內(nèi)切PCR條件酶ApcA30循環(huán)(94。C5分鐘，5，GGATCCATGAGTATCGTTACCAAATC3'BamHI94°C1分鐘，50°C1分鐘，5，GAGCTCTTATGACATTGCACCAATTA3'Sacl72°C1分鐘，72°C10分鐘)hoxl5'TGCATATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG3'Nde130循環(huán)(94。C5分鐘，5'TTGATATCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG3'EcoRV94°C1分鐘，55°C1分鐘，72°C1分鐘，72°C10分PcyA鐘)5'TTGATATCAATAAGGAGATATCACATGGCTCEcoRV30循環(huán)(94。C5分鐘，ACTGATTTAAGTTTGACC3'Xhol94°C1分鐘，55°C1分鐘，5'TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAG72°C1分鐘，72°C10分AC3'鐘)(2)將Anabaenasp.PCC7120中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcA2克隆于Novagen公司的pCDFDuetTM-l載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的apcA2基因片段進行電泳(120V,40分鐘)，回收apcA2的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體pCDFDuet-l用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcA2PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l;酶切后的apcA2PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l按為3|il:l|il混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(4'C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuet-l-ApcA2;把質(zhì)粒pCDFDuet-l-apcA2轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuet-l-apcA2載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-1-apcA2-hoxl-pcyA,這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白cx亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA2在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA廠hoxl-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)過夜；取100W飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g,4。C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g,4°C)棄去上清，菌體沉淀用lO(mL預冷的O.lmol/LCaCl2重懸，加入步驟2所得質(zhì)粒，混勻后冰浴30min，42。C熱激90s，冰洛5min后加入40(mLLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上，倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。'將上述工程菌接種于pH7.O的LB液體培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L，28°C培養(yǎng)8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4),超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白2(參見圖3)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出10(mL轉(zhuǎn)接至5mL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分，表達8-10小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖4)，選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白2的程序如下取保存的菌種10(^L無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進行，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C,轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300-500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以0.16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25。C,然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L,降低轉(zhuǎn)速至150rpm,誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白2。實施例3:(1)從Genebank中可以查到，藻種SynechocysUssp.PCC6803的全序歹寸已經(jīng)測定完成。Anabaenasp.SynechocysUssp.PCC6803在Genebank中編號為BA000022，可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的SynechocysUssp.PCC6803的apcA，hoxl，pcyA基因序列，設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以未測序的色球藻目(Chroococcales)藻類基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因._<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>(2)將色球藻目(Chroococcales)藻類中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcA3克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的apcA3基因片段進行電泳(120V,40分鐘)，回收apcA3的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體pCDFDuet-l用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcA3PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuetTM-l;酶切后的apcA3PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-1按為3ju1:1n1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(4'C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-ApcA3;把質(zhì)粒pCDFDuet-1-apcA3轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuetTM-l-apcA2載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-1-apcA廠hoxl-pcyA，這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白a亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA3在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA3-hoxl-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)過夜；取10(mi飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g，4°C)棄去上清，菌體沉淀用100吣預冷的0.lmol/LCaCl2重懸，加入步驟2所得質(zhì)粒，混勻后冰洛30min，42。C熱激9Qs，冰洛5min后加入4GGl^LLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh,轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上,倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。將上述工程菌接種于pH7.O的LB液體培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0,加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophylthio-(3-D-galactoside,簡稱IPTG)至終濃度為l隨ol/L，28°C培養(yǎng)8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4),超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于N廣親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白3(參見圖5)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出10(mL轉(zhuǎn)接至5mL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分，表達8-l0小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖6),選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白3的程序如下取保存的菌種100化無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進^，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37。C,轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300—500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以0.16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25'C,然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L,降低轉(zhuǎn)速至150rpm,誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于N廣親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白3。實施例4:(1)從Genebank中可以查到，藻種Synechocystissp.PCC6803的全序歹寸已經(jīng)測定完成。Anabaenasp.Synechocystissp.PCC6803在Genebank中編號為BA000022,可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的Synechocystissp.PCC6803的apcA，hoxl,pcyA基因序歹'J,設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以未測序的寬球藻目(Pleurocapsales)藻類基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因。_<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(2)將寬球藻目(Pleurocapsales)藻類中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcA4克隆于Novagen公司的pCDFDuet-l載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的apcA4基因片段進行電泳(120伏，40分鐘)，回收apd的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體pCDFDuetTM-l用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcA4PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuetTM-l;酶切后的apcA4PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l按為3jul:lpl混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(4。C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuet-1-ApcA4;把質(zhì)粒pCDFDuet-l-apcA4轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆,SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuet-l-apcA4載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-l-apcA4-hoxl-pcyA，這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白oc亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA4在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA4-hoxl-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌抹BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)過夜；取100W飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD"0為0.6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g，4。C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(lOOOOg,4°C)棄去上清，菌體沉淀用lO(mL預冷的O.lmol/LCaCh重懸，加入步驟2所得質(zhì)粒，混勻后冰浴30min，42。C熱激90s，冰洛5min后加入40(mLLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh,轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上,倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。將上述工程菌接種于pH7.O的LB液體培養(yǎng)基中，3rC震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophylthio-(3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L，28°C培養(yǎng)8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪哇，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于N廣親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白4(參見圖7)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出100l44專接至5mL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37'C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分，表達8-10小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖8),選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白4的程序如下取保存的菌種10(mL無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進^，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C,轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300—500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以O(shè).16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25'C,然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L，降低轉(zhuǎn)速至150rpm，誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白4。實施例5:(1)從Genebank中可以査至iJ，藻種Synechocystissp.PCC6803的全序歹'J已經(jīng)測定完成。Anabaenasp.Synechocystissp.PCC6803在Genebank中編號為BA000022，可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的Synechocystissp.PCC6803的apcA,hoxl，pcyA基因序歹iJ,設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以未測序的管孢藻目(Chamaesiphonales)藻類基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>72°Cl分鐘，72°C10PcyA分鐘)5'TTGATATCAATAAGGAGATATCACATGGCTCEcoRV30循環(huán)(94°C5分鐘，94ACTGATTTAAGTTTGACC3'XhoI°Cl分鐘，50。Cl分鐘，5'TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAG72°Cl分鐘，72。C10AC3'__(2)將管孢藻目(Chaniaesiphonales)藻類中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcAs克隆于Novagen公司的pCDFDuetTM-l載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的apcAs基因片段進行電泳(120伏，40分鐘)，回收apcAs的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體pCDFDuetTM-l用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcA5PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l;酶切后的apcA5PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l按為3|ik1p1混合,在T4連接酶作用下連接一定時間(4'C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuet-l-ApcA5;把質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA5轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuet-l-apcAs載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-l-apcA廠hoxl-pcyA,這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白a亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA5在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA5-hoxl-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)過夜；取100W飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g，4°C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g，4°C)棄去上清，菌體沉淀用10(mL預冷的0.lmol/LCaCl2重懸，加入步驟2所得質(zhì)粒，混勻后冰洛30min,42。C熱激90s，冰洛5min后加入400nLLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh,轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上，倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。將上述工程菌接種于pH7.G的LB液體培養(yǎng)基中，37X:震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0,加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophylthio-P-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L,28°C培養(yǎng)8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Nr親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白5(參見圖9)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出100化轉(zhuǎn)接至5niL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37匸震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分，表達8-10小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖IO)，選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白5的程序如下取保存的菌種10(mL無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進！，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37'C，轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由30(T500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以0.16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25。C,然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L,降低轉(zhuǎn)速至150rpm,誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20raM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4),超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20raM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白實施例6:(1)從Genebank中可以查到，藻種Synechocystissp.PCC6803的全序列已經(jīng)測定完成。Anabaenasp.Synechocystissp.PCC6803在Genebank中編號為BA000022，可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的Synechocystissp.PCC6803的apcA，hoxl,pcyA基因序列，設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以未測序的念珠藻目(Nostocales)藻類基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因._引物序列限制性內(nèi)切PCR條件酶ApcA30循環(huán)(94。C5分鐘，5'GGATCCATGAGTATCGTTACCAAATC3'BamHI94°C1分鐘，46°C1分鐘，5'GAGCTCTTATGACATTGCACCAATTA3'Sacl72°C1分鐘，72°C10分鐘)hoxl5'TGCATATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG3，Ndel30循環(huán)(94。C5分鐘，5'TTGATATCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG3'EcoRV94°C1分鐘，50°C1分鐘，72°C1分鐘，72°C10分PcyA鐘)5'TTGATATCAATAAGGAGATATCACATGGCTCEcoRV30循環(huán)(94。C5分鐘，ACTGATTTAAGTTTGACC3'Xho194°C1分鐘，50°C1分鐘，5'TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAG72°C1分鐘，72°C10分AC3'__(2)將念珠藻目(Nostocales)藻類中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcA6克隆于Novagen公司的pCDFDuetTM-l載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的apcA6基因片段進行電泳(120伏，40分鐘)，回收apcA6的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體pCDFDuet-l用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcA6PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-1;酶切后的apcA6PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuetTM-1按為3|i1:1|a1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(4。C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-ApcA6;把質(zhì)粒pCDFDuet-1-apcA6轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuet-l-apcA6載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-l-apcA6-hoxl-pcyA，這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白cc亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA6在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA6-hoxl-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)過夜；取100W飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為().6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g，4。C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g，4°C)棄去上清，菌體沉淀用100吣預冷的0.lmol/LCaCh重懸，加入步驟2所得質(zhì)粒，混勻后冰浴30min，42。C熱激9Qs，冰洛5min后加入4Q(mLLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上，倒置于37匸培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。將上述工程菌接種于pH7.O的LB液體培養(yǎng)基中，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入異丙基硫代-P-D-半乳糖苷(isoprophylthio-P-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L，28。C培養(yǎng)8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4),超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白6(參見圖ll)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出100l44專接至5mL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37i:震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分，表達8-10小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖12)，選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白6的程序如下取保存的菌種10(^L無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進^，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37。C,轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300—500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以O(shè).16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25。C，然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L，降低轉(zhuǎn)速至150rpm,誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于Ni2+親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(2QmM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白6。實施例7:(1)從Genebank中可以查到，藻種Synechocystissp.PCC6803的全序列已經(jīng)測定完成。Anabaenasp.Synechocystissp.PCC6803在Genebank中編號為BA000022，可以從全序列中找到需要的基因。根據(jù)Genebank中查到的Synechocystissp.PCC6803的apcA,hoxl，pcyA基因序歹寸，設(shè)計引物(所用的引物和反應條件如下表)，以未測序的真枝藻目(SUgonemales)藻類基因組DNA為模板，PCR克隆對應的基因.引物序列限制性內(nèi)切酶PCR條件ApcA30循環(huán)(94。C5分鐘，5'GGATCCATGAGTATCGTTACCAAATC3'BamHI94°C1分鐘，46°C1分鐘，5'GAGCTCTTATGACATTGCACCAATTA3'Sacl72°C1分鐘，72°C10分鐘)hoxl5'TGCATATGAGTGTCAACTTAGCTTCCCAG3，Ndel30循環(huán)(94。C5分鐘，5'TTGATATCCTAGCCTTCGGAGGTGGCGAG3'EcoRV94°C1分鐘，50°C1分鐘，72°C1分鐘，72°C10分PcyA鐘)5'TTGATATCAATAAGGAGATATCACATGGCTCEcoRV30循環(huán)(94。C5分鐘，ACTGATTTAAGTTTGACC3'Xhol94°C1分鐘，50°C1分鐘，5'TGCTCGAGTTATTGGATAACATCAAATAAG72°C1分鐘，72°C10分<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>(2)將真枝藻目(Stigonemales)藻類中別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因apcA7克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1載體中，基因插入載體的步驟為把上一步經(jīng)過PCR擴增得到的apcA7基因片段進行電泳(120伏，40分鐘)，回收apcA7的PCR產(chǎn)物片段;所得片段用設(shè)計的限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI進行雙酶切，同時把載體PCDFDuet-l用同樣的限制性內(nèi)切酶進行酶切，分別回收酶切后apcA7PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuet-l;酶切后的apcA7PCR產(chǎn)物片段和酶切后的載體pCDFDuetTM-l按為3p1:1p1混合，在T4連接酶作用下連接一定時間(4。C下過夜)，即得到質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-ApcA7;把質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA7轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌，利用含有抗生素的平板篩選出圓形單菌落，挑取單克隆，SDS-PAGE電泳和測序驗證。將克隆的藻膽素生物合成酶基因(hoxl和pcyA)按上述程序依次連接于pCDFDuet-1-apcA7載體上，所得質(zhì)粒叫做pCDFDuet-l-apcA廠hoxl-pcyA，這樣在大腸桿菌中可同時表達別藻藍蛋白脫輔基蛋白oc亞基和兩個藻膽素生物合成酶基因H0X1和PcyA。即脫輔基蛋白基因apcA7在pCDFDuet中是在酶切位點BamHI和SacI之間，藻膽素生物合成酶基因在在酶切位點NdeI和XhoI之間，即脫輔基蛋白基因和藻膽素生物合成酶基因在同一個載體上。(3)將質(zhì)粒pCDFDuetTM-l-apcA7-hoxl-pcyA轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方式如下從新鮮涂布的平板上挑取大腸桿菌菌株BL21的單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)過夜；取10(mi飽和培養(yǎng)物，無菌轉(zhuǎn)接至5mlLB液體培養(yǎng)基，37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為().6左右，冰上放置10min;，離心5min(5000g，4。C)棄去上清，收集沉淀菌體；用lmllmol/LCaC12無菌溶液重懸菌體，離心30s(10000g，4°C)棄去上清，菌體沉淀用IOO吣預冷的O.lmol/LCaCl2重懸，加入步驟2所得質(zhì)粒，混勻后冰洛30min，42。C熱激90s，冰洛5min后加入40叫LLB液體培養(yǎng)基，37。C低速震蕩培養(yǎng)lh，轉(zhuǎn)速梯度增加至正常，涂布菌液在含有相應抗生素的LB固體平板上,倒置于37。C培養(yǎng)箱至形成可見的單克隆菌斑。挑取單克隆，經(jīng)測序驗證即得到大腸桿菌工程菌。將上述工程菌接種于pH7.O的LB液體培養(yǎng)基中，WC震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0，加入異丙基硫代-(3-D-半乳糖苷(isoprophylthio-|3-D-galactoside，簡稱IPTG)至終濃度為lmmol/L，28。C培養(yǎng)8-10小時，即得別藻蛋白類新型熒光蛋白l;離心收集菌體細胞，加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)，超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于N廣親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液UOmM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白7(參見圖13)。挑取20個菌落，分別接種于5ml含有相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)至飽和；分別從中取出100liL轉(zhuǎn)接至5mL含有相應抗生素的液體培養(yǎng)基中；37。C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.8-1.0,加入IPTG誘導表達，避光28。C120轉(zhuǎn)/分，表達8-IO小時。離心收集細胞，細胞加入緩沖液重懸；通過光譜儀測定熒光量(參見圖14)，選取熒光量較高的菌株保種，并用發(fā)酵罐大量表達。(4)5L發(fā)酵罐表達別藻蛋白類新型熒光蛋白7的程序如下取保存的菌種10(mL無菌接種于5ml液體LB培養(yǎng)基，37'C震蕩培養(yǎng)12小時，然后轉(zhuǎn)接于含200mL液體LB培養(yǎng)基的三角瓶，37。C震蕩培養(yǎng)6小時。工程菌的發(fā)酵在5L自動發(fā)酵罐中進行，體積比5%的接種量，誘導前培養(yǎng)溫度設(shè)為37t:，轉(zhuǎn)速隨發(fā)酵時間由300-500rpm遞增，溶氧、pH均自動控制；發(fā)酵開始4h后，菌體生長至對數(shù)期，原培養(yǎng)基中的碳源接近耗盡時，以O(shè).16g/(Lmin)葡萄糖的速率，設(shè)置ls/20s的脈沖進行補料。發(fā)酵開始約6.5h時，先將罐內(nèi)溫度緩慢降至25。C，然后加入誘導劑IPTG至終濃度lmmol/L，降低轉(zhuǎn)速至150rpm,誘導培養(yǎng)10h以上。加入結(jié)合緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4),超聲破碎細胞后，離心收集上清液，上樣于N廣親和色譜柱，用5倍柱體積的結(jié)合緩沖液沖洗色譜柱后，用洗脫緩沖液(20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉，500mM咪唑，pH7.4)洗脫，即可得到別藻蛋白類熒光蛋白7。權(quán)利要求1.一種別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征包括以下步驟1)將別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和藻膽素生物合成酶基因(Hox1和pcyA)克隆于同一表達載體中，得到脫輔基蛋白和色素合成酶共同的表達質(zhì)粒；2)將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌發(fā)酵生產(chǎn)別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，用常規(guī)方法純化蛋白質(zhì)，純化得到相應的別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。2.按權(quán)利要求1所述的別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于藻膽自催化色基與脫輔基蛋白的共價結(jié)合，合成別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。3.按權(quán)利要求1所述的別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法,其特征在于所述表達載體為pCDFDuet-1。4.按權(quán)利要求1所述的別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于別藻藍蛋白或者藻藍蛋白脫輔基蛋白基因是指與SynechocystisPCC6803或者Anabaenasp.PCC7120中別藻藍白蛋白或者藻藍蛋白相應亞基的基因同源基因。全文摘要本發(fā)明屬于生物技術(shù)中色素蛋白質(zhì)材料領(lǐng)域，具體涉及一種新型熒光蛋白質(zhì)的制備方法。具體為1)將別藻藍蛋白類脫輔基蛋白基因或其同源基因和藻膽素生物合成酶基因(Hox1和pcyA)克隆于同一表達載體中，得到脫輔基蛋白和色素合成酶共同的表達質(zhì)粒；2)將上述表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，得到相應的工程菌，應用此工程菌發(fā)酵生產(chǎn)別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)；發(fā)酵后，用常規(guī)蛋白質(zhì)純化技術(shù)，一步純化得到相應的別藻藍蛋白類熒光蛋白質(zhì)。本發(fā)明利用生物過程生產(chǎn)，是一種環(huán)境友好的生產(chǎn)方法；該蛋白具有不同于天然蛋白的熒光特性，實現(xiàn)了生物技術(shù)對天然蛋白的改造。文檔編號C12N15/70GK101440370SQ20081015778公開日2009年5月27日申請日期2008年10月17日優(yōu)先權(quán)日2008年10月17日發(fā)明者關(guān)翔宇,劉少芳,張偉杰,雨楊,松秦,陳華新申請人:中國科學院海洋研究所