專利名稱：中間偃麥草抗白粉病基因的染色體定位及分子標(biāo)記研究的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本研究是在獲得了中間偃麥草與小麥的雜種，并對(duì)其雜交后代的細(xì)胞遺傳學(xué)特
點(diǎn)、性狀特點(diǎn)、小孢子發(fā)生過程等進(jìn)行了研究的基礎(chǔ)上，將中間偃麥草中這個(gè)未知的抗白粉 病基因進(jìn)行染色體定位及初步的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行精細(xì)定位、精細(xì)標(biāo)記、聚 合、克隆等工作做前期準(zhǔn)備工作，并為小麥抗病育種工作挖掘新的種質(zhì)資源，屬于作物遺傳 育種學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
小麥屬于禾本科(Poaceae)小麥族(Triticeae)小麥屬。小麥族除包括小麥、大 麥、黑麥等重要糧食作物外，還包括一些優(yōu)良的牧草如中間偃麥草、鵝觀草、披堿草、冰草、 賴草等，小麥的近緣植物泛指小麥族中除小麥屬以外的其他屬(表l)。小麥族內(nèi)約有300 余個(gè)種，染色體基數(shù)均為7，含有20余種染色體組，不同種的倍性從二倍體至十二倍體不 等，其中約77%為多年生，其余為一年生(D. R. Deway，1987 ;董玉琛，2001 ;何瑞鋒，1993 ;金 善寶，1990)。這些近緣種都具有和小麥雜交的潛力，因此用于小麥遺傳改良的基因資源是 十分豐富的。 中 間 偃 麥 草 [Elytigia intermedium (Host) Nevski ， Thinopyrum intermedium(Host)Barkworth and Dewey或Agropyron intermedium(Host)Beauv. 2n = 6x = 42]又名天藍(lán)冰草，是禾本科小麥族(Triticeae)中的多年生野生草本植物。中間偃 麥草是小麥的三級(jí)基因源，耐寒、耐旱、多花多實(shí)、抗倒、優(yōu)質(zhì)，高抗小麥的黃矮病，對(duì)小麥三 銹免疫，是小麥的重要抗源。 中間偃麥草原產(chǎn)于東歐，是一個(gè)異源六倍體，染色體數(shù)目2n = 42。天然分布于高 加索、中亞的東南部草原地帶，因其適應(yīng)性強(qiáng)，現(xiàn)已在世界很多國(guó)家都有分布。中間偃麥草 是一種強(qiáng)冬性、長(zhǎng)日照、多年生的草本植物。在原產(chǎn)區(qū)，株高一般100-140cm，穗長(zhǎng)20-30cm， 每穗20-30個(gè)小穗，每小穗3-6個(gè)小花。在山東泰安一般6月上旬開花，穗長(zhǎng)一般30-50cm， 株高高者可達(dá)150cm以上；異花傳粉，結(jié)實(shí)率低，主要是以無性繁殖為主；種子細(xì)小，千粒重 4-6g。它根系發(fā)達(dá)，具有匍甸地下莖，再生能力強(qiáng)?？购詮?qiáng)，在-40oC條件下可安全越冬。 耐旱，在年降雨量350mm的地區(qū)可良好生長(zhǎng)。耐鹽堿，可在中輕度鹽化土壤上生長(zhǎng)。由于 它生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，再生性好，適應(yīng)性廣，莖葉繁茂，而且含有較高的粗蛋白、粗纖維、粗脂肪等多 種化學(xué)成分，因此是牧區(qū)的一種優(yōu)良牧草。另外它對(duì)小麥的葉銹、條銹、桿銹、白粉等病害免 疫，對(duì)黑穗病、葉枯病和根腐病、條紋花葉病等高抗，并且是大麥黃矮病的良好抗源，又能與 小麥雜交，因此它已成為小麥遺傳改良中具有重要利用價(jià)值的寶貴遺傳資源。

發(fā)明內(nèi)容
本研究的目的是在獲得了中間偃麥草與小麥的雜種，并對(duì)其雜交后代的細(xì)胞遺傳 學(xué)特點(diǎn)、性狀特點(diǎn)、小孢子發(fā)生過程等進(jìn)行了研究的基礎(chǔ)上，將中間偃麥草中這個(gè)未知的抗 白粉病基因進(jìn)行染色體定位及初步的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行精細(xì)定位、精細(xì)標(biāo)記、聚合、克隆等工作做前期準(zhǔn)備工作，并為小麥抗病育種工作挖掘新的種質(zhì)資源。
中間偃麥草抗白粉病基因的染色體定位及分子標(biāo)記研究
1.材料與方法
1. 1材料 本研究利用的中間偃麥草原引自中國(guó)科學(xué)院西北植物研究所，由李振聲先生提供；長(zhǎng)穗偃麥草和假鵝觀草引自中國(guó)農(nóng)科院品資所，中國(guó)春一二倍體長(zhǎng)穗偃麥草成套雙體異附加系1E， 2E， 3E， 4E， 5E， 6E， 7E，由中國(guó)農(nóng)科院品資所提供，八倍體小偃麥山農(nóng)TE263及雙體異附加系山農(nóng)Linel5是本實(shí)驗(yàn)室利用中間偃麥草與煙農(nóng)15雜交、回交，分別從BC^及BC^中選出；小麥品種煙農(nóng)15、中國(guó)春和輝縣紅由國(guó)家小麥改良中心(泰安)分中心保存；白粉病15號(hào)菌種由中國(guó)農(nóng)科院植保所提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。
1. 2白粉病抗性接種及鑒定 用當(dāng)前小麥白粉菌的優(yōu)勢(shì)小種NO. 15號(hào)小種對(duì)抗、感親本、所有的F2單株進(jìn)行兩次接種，一次在三葉期，一次在開花后灌漿期(CI匪TY)，在感病對(duì)照充分發(fā)病的條件下，調(diào)查抗、感分離情況，每隔2-3天重復(fù)調(diào)查一次，病級(jí)鑒定按盛寶欽等提出的反應(yīng)型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。 1.3基因組DNA的提取 DNA的提取采用Devos(1992)的酚-氯仿提取法，稍有改動(dòng)，適于1. 5ml離心管提取。 (1)取新鮮葉片0. 2-0. 3克，在液氮冷凍下迅速研磨成粉末，分裝于1. 5ml離心管中，加入預(yù)熱的"S"緩沖液600 iil混勻，65t:水浴1-2小時(shí)，水浴過程中輕搖數(shù)次，充分混勻。 (2)加入等體積的酚_氯仿(V/V =1:1)，混勻后(不停輕輕搖動(dòng)10-15分鐘)，12000rpm離心10分鐘；將上清液移入另一離心管中加入等體積的氯仿，混勻后12000rpm離心IO分鐘。 (3)將上清液移入另一離心管中，加入0.6體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置10分鐘，勾出DNA沉淀用75%的乙醇浸洗2-3次，于離心管中室溫干燥。 (4)將干燥后的DNA溶于500 ii 1 1 X TE (pH7. 0)，分別加入3-5 ii 1 RNAase (10mg/ml)，37t:水浴保溫1小時(shí)。 (5)加入等體積的酚_氯仿，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液移入另一離心管中，加入等體積的氯仿，混勻后12000rpm離心10分鐘。 (6)取上清液加入1/10體積的3M的醋酸鈉混勻，加入2倍體積的冷無水乙醇，混勻后低溫靜置10分鐘(最好-20 -40°C )，挑出DNA沉淀，用75%乙醇浸洗2_3次，待DNA干燥后加入50 ill X TE (pH7. 0)。 1. 4BSA(Bulked Segregate Analysis)分池 按Michelmore等(1991)提出的分離群體集群分析法(BSA法)，建立抗病基因池和感病基因池，對(duì)在雙親間表現(xiàn)多態(tài)性的引物進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。 抗病池和感病池將F2群體的單株分別提取總基因組DNA，隨機(jī)選取10個(gè)抗病單株將其DNA等量混合，隨機(jī)選取10個(gè)感病單株將其DNA等量混合，分別建立抗病池和感病池。
4
1. 5RAPD-PCR分析 1. 5. 1引物來源及引物的稀釋 用于擴(kuò)增的350個(gè)十堿基隨機(jī)引物中，230個(gè)(S1-S230)購(gòu)自上海生物工程公司
(Sangon) ， 120個(gè)(0PA1_20、 0PE1_20、 0PF1.國(guó)生物工程公司。S系列引物為0. 20D/管
-20、 0PHl-20、 0PT1-20和0PV1-20)購(gòu)自北京鼎
每管加入200ia超純水稀釋。
1. 5. 2PCR反應(yīng)體系
10XPCR Buffer2. 5ii 1
Mg2+ (25mM)2ii 1
d證(2. 5mM)1. 5ii 1
TaqE(5U/ii 1)0. 25ii 1
Primer pair(5 u M)1 ii 1
DNA(30ng/ii 1)2ii 1
ddH2015. 75 ii 1
總體積(Total)附10XPCR Buffer
25 ii 1Tris(pH8.KC1MgCl2
3)
lOOmM500mM15mM
1. 5. 3PCR反應(yīng)程序
PCR反應(yīng)在Thermal Cycler 9600PCR上進(jìn)行。先進(jìn)行一次預(yù)擴(kuò)增94°C 3分鐘、36 °C 1分鐘、72 °C 2分鐘，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)94°C 15秒、36 °C 30秒、72 °C 1分鐘，最后72t:延伸4分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后4t:保存待檢測(cè)。
1.5. 4擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量溴酚蘭(產(chǎn)物/溴酚蘭4V/1V)，混勻，用1. 4%瓊脂糖凝膠電泳分離(電泳電壓5V/cm)，凝膠經(jīng)EB染色后用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。
1.6所用試劑的配制
(1) 1MTris-HCl(pH8. 0)
800ml H20中加入121. lgTris，用HC1調(diào)pH值至8. 0，定容至1L，滅菌，備用。
(2) 0. 5MEDTA (pH8. 0)
800mlH20中加186. lgNa2EDTA_2H20，用NaOH調(diào)pH值至8. 0，定容至1L，滅菌，備
用。
菌，備用
1L，滅菌
(3) 3MNaAc (pH5. 2)
600ml H20中加408. 24gNaAc_3H20，溶解后，用冰醋酸調(diào)pH值至5. 2，定容至1L，滅
(4) 100 XTE (pH8. 0)
800ml 1120中加121. lg Tris，37.23g Na2EDTA_2H20，用HC1調(diào)pH值至8. 0，定容至備用。
(5) RNA酶的配制
將固體RNA酶溶于O. OlMNaAc，使酶濃度為10mg/ml，加熱至IO(TC處理15至20分鐘，慢慢冷卻至室溫，加入0. 1體積1M Tris-Hcl (pH7. 4)，分裝后保存于-2(TC冰箱。
(6)EB的配制 lOOmg溴化乙錠溶解于10ml H20中，于棕色瓶中避光保存。
(7) 50 X TAE (pH8. 0)800mlH20中加242. 2g Tris，82.03g NaAc，37.23g Na2EDTA-2H20，用冰醋酸調(diào)pH值至8.0，定容至1L保存。使用時(shí)需稀釋成1XTAE。
(8) 5 X TBETris27g，硼酸13. 75g，0. 5M EDTA 10ml，定容至500ml，備用。
(9)緩沖液"S"的配制 100ml 1M Tris-HCl(pH8.0) 20ml5N NaCl 100ml 0.5M EDTA(pH8.0) 100ml 20% SDS 定容至1000ml。 1. 7數(shù)據(jù)分析 根據(jù)最大似然法計(jì)算重組率(莫惠棟，1984)，并按Kosambi (1944)系數(shù)將重組率
轉(zhuǎn)化為CentiMorgan(cM)。 抗白粉病基因的分子標(biāo)記分析結(jié)果 2.結(jié)果與分析 2. 1RAPD分析結(jié)果 提取山農(nóng)Linel5、中間偃麥草和煙農(nóng)15的總基因組DNA，進(jìn)行RAPD分析，在120個(gè)供試的RAPD引物中，共篩選到59個(gè)在中間偃麥草和煙農(nóng)15兩親本間有差異的引物，其中1個(gè)特異引物S170(5' -ACAACG CGAG-3')能在山農(nóng)Linel5和中間偃麥草中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出1條約1200bp的特異帶(圖l，箭頭所示)，而煙農(nóng)15缺少此帶。因此S170-1200可作為山農(nóng)Linel5所附加的中間偃麥草染色體的特異RAPD標(biāo)記，同時(shí)也在DNA分子水平上進(jìn)一步證明山農(nóng)Linel5中含有中間偃麥草的遺傳物質(zhì)。
2. 2SSR分析結(jié)果 為初步明確山農(nóng)Linel5所附加的中間偃麥草染色體的同源群歸屬，對(duì)其進(jìn)行了SSR分析，在192對(duì)供試的SSR引物中，共篩選到63對(duì)在親本中間偃麥草和煙農(nóng)15間有差異的引物，其中引物Xgdm68-5D(Pl :5' -GCC TGA CCA CTC CCA TAA AA-3' ;P2 :5' -TCGGAAGGG GGA CTA TAC AA-3')在中間偃麥草和煙農(nóng)15中均能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出1條約110 150bp左右的特異帶，但二者片段大小不同，在山農(nóng)Linel5則能中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出雙親的特異帶型(圖2)，因此引物Xgdm68-5D可用于鑒定雙體異附加系山農(nóng)Linel5。
3.討論 中間偃麥草E組染色中攜帶有抗白粉病基因 從目前已發(fā)現(xiàn)和定名的小麥抗白粉病基因的來源來看，尚沒有來自中間偃麥草的。利用普通小麥與中間偃麥草雜交已選育了中！、中2、中3、中4、中5(孫善澄，1981)和TAF46(Larkin， 1996)等部分雙二倍體及一些異附加系，但這些材料均未發(fā)現(xiàn)抗白粉病的報(bào)道。我們經(jīng)過多年的鑒定發(fā)現(xiàn)中間偃麥草對(duì)白粉病表現(xiàn)兔疫，因而推斷這些已育成的八倍體小偃麥或異附加系可能未將來自中間偃麥草的染色體全部轉(zhuǎn)移到普通小麥的遺傳背景中，其中可能包含攜帶抗白粉病基因的染色體。本研究從感病品種煙農(nóng)15與中間偃麥草的雜交后代中選育了對(duì)白粉病表現(xiàn)免疫的八倍體小偃麥和雙體異附加系，并利用它們進(jìn)而獲得了一些新材料。選育的抗白粉病八倍體小偃麥和雙體異附加系，通過利用一套(21個(gè))白粉病毒性生理小種及30個(gè)鑒別寄主進(jìn)行抗病基因的推導(dǎo)鑒定表明，其抗譜與已發(fā)現(xiàn)的抗白粉病基因不同，進(jìn)一步說明中間偃麥草及選育的八倍體小偃麥和雙體異附加系中含有新的抗白粉病基因。通過我們的研究已將中間偃麥草的抗白粉病基因?qū)肫胀ㄐ←湹倪z傳背景中。 4.結(jié)論 利用一套7個(gè)中國(guó)春-二倍體長(zhǎng)穗偃麥草雙體異附加系(1E-7E)與抗白粉病雙體異附加系山農(nóng)Linel5分別雜交獲得&代，對(duì)巳代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I染色體構(gòu)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，只有在1EX山農(nóng)Linel5的巳代花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中期I觀察到2n = 2211的染色體構(gòu)型，初步推測(cè)山農(nóng)Line15中的中間偃麥草染色體可能屬于Ee基因組中的第一部分同源群。


圖1引物S170的RAPD結(jié)果(A、中間偃麥草，B、煙農(nóng)15，M、Maker， 1-6、山農(nóng)linel5不同單株，箭頭所示為特異帶) 圖2引物Xgdm68-5D的SSR結(jié)果(A、中間偃麥草，B、煙農(nóng)15， M、 Maker, 1-6、山農(nóng)linel5不同單株)
具體實(shí)施方式
1. 1材料 本研究利用的中間偃麥草原引自中國(guó)科學(xué)院西北植物研究所，由李振聲先生提供；長(zhǎng)穗偃麥草和假鵝觀草引自中國(guó)農(nóng)科院品資所，中國(guó)春_ 二倍體長(zhǎng)穗偃麥草成套雙體異附加系1E， 2E， 3E， 4E， 5E， 6E， 7E，由中國(guó)農(nóng)科院品資所提供，八倍體小偃麥山農(nóng)TE263及雙體異附加系山農(nóng)Linel5是本實(shí)驗(yàn)室利用中間偃麥草與煙農(nóng)15雜交、回交，分別從BC^及BC^中選出；小麥品種煙農(nóng)15、中國(guó)春和輝縣紅由國(guó)家小麥改良中心(泰安)分中心保存；白粉病15號(hào)菌種由中國(guó)農(nóng)科院植保所提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。
1. 2白粉病抗性接種及鑒定 用當(dāng)前小麥白粉菌的優(yōu)勢(shì)小種NO. 15號(hào)小種對(duì)抗、感親本、所有的F2單株進(jìn)行兩次接種，一次在三葉期，一次在開花后灌漿期(CI匪TY)，在感病對(duì)照充分發(fā)病的條件下，調(diào)查抗、感分離情況，每隔2-3天重復(fù)調(diào)查一次，病級(jí)鑒定按盛寶欽等提出的反應(yīng)型分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。 1. 3基因組DNA的提取 DNA的提取采用Devos(1992)的酚-氯仿提取法，稍有改動(dòng)，適于1. 5ml離心管提取。 (1)取新鮮葉片0. 2-0. 3克，在液氮冷凍下迅速研磨成粉末，分裝于1. 5ml離心管中，加入預(yù)熱的"S"緩沖液600 iil混勻，65t:水浴1-2小時(shí)，水浴過程中輕搖數(shù)次，充分混勻。 (2)加入等體積的酚_氯仿(V/V =1 : 1)，混勻后(不停輕輕搖動(dòng)10-15分鐘)，12000rpm離心10分鐘；將上清液移入另一離心管中加入等體積的氯仿，混勻后12000rpm離心10分鐘。 (3)將上清液移入另一離心管中，加入0.6體積的異丙醇，輕輕混勻，靜置10分鐘，勾出DNA沉淀用75%的乙醇浸洗2-3次，于離心管中室溫干燥。 (4)將干燥后的DNA溶于500 ii 1 1 X TE (pH7. 0)，分別加入3-5 ii 1 RNAase (10mg/ml)，37t:水浴保溫1小時(shí)。 (5)加入等體積的酚_氯仿，混勻后12000rpm離心10分鐘，上清液移入另一離心管中，加入等體積的氯仿，混勻后12000rpm離心10分鐘。 (6)取上清液加入1/10體積的3M的醋酸鈉混勻，加入2倍體積的冷無水乙醇，混勻后低溫靜置10分鐘(最好-20 -40°C )，挑出DNA沉淀，用75%乙醇浸洗2_3次，待DNA干燥后加入50 ill X TE (pH7. 0)。 1. 4BSA(Bulked Segregate Analysis)分池 按Michelmore等(1991)提出的分離群體集群分析法(BSA法)，建立抗病基因池和感病基因池，對(duì)在雙親間表現(xiàn)多態(tài)性的引物進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。 抗病池和感病池將F2群體的單株分別提取總基因組DNA，隨機(jī)選取10個(gè)抗病單株將其DNA等量混合，隨機(jī)選取10個(gè)感病單株將其DNA等量混合，分別建立抗病池和感病池。 1. 5RAPD-PCR分析 1. 5. 1引物來源及引物的稀釋 用于擴(kuò)增的350個(gè)十堿基隨機(jī)引物中，230個(gè)(S1-S230)購(gòu)自上海生物工程公司
(Sangon) ， 120個(gè)(0PA1_20、 0PE1_20、 0PF1_20、 0PH1_20、 0PT1-20和0PV1-20)購(gòu)自北京鼎
國(guó)生物工程公司。S系列引物為0. 20D/管，每管加入200 超純水稀釋。 1. 5. 2PCR反應(yīng)體系 10XPCR Buffer 2. 5 ii 1Mg2+(25mM) 2 ii 1 dNTP(2.5mM) 1.5iU TaqE(5U/iU) 0. 25 ii 1 Primer pair (5 li M) 1 li 1DNA(30ng/ii 1)2 ii 1 ddH20 15. 75 ill _ 總體積(Total) 25 ill 附10XPCR Buffer Tris(pH8.3) lOOmM
KC1 500mM MgCl2 15mM 1.5. 3PCR反應(yīng)程序 PCR反應(yīng)在Thermal Cycler 9600PCR上進(jìn)行。先進(jìn)行一次預(yù)擴(kuò)增94°C 3分鐘、36°C 1分鐘、72。C 2分鐘，然后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)94。C 15秒、36。C 30秒、72。C 1分鐘，最后72t:延伸4分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后4t:保存待檢測(cè)。
1.5. 4擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量溴酚蘭(產(chǎn)物/溴酚蘭4V/1V)，混勻，用1. 4%瓊脂糖凝膠電泳分離(電泳電壓5V/cm)，凝膠經(jīng)EB染色后用Tanon Gis-2010型凝膠成像系統(tǒng)照相觀察。
1.6所用試劑的配制
(1)1MTris-HCl(pH8.0)800ml H20中加入121. lgTris，用HC1調(diào)pH值至8. O，定容至1L，滅菌，備用。
(2) 0. 5MEDTA (pH8. 0) 800mlH20中加186. lgNa2EDTA_2H20，用NaOH調(diào)pH值至8. 0，定容至1L，滅菌，備用。
(3) 3MNaAc (pH5. 2) 600ml H20中加408. 24gNaAc_3H20，溶解后，用冰醋酸調(diào)pH值至5. 2，定容至1L，滅菌，備用。 (4) 100XTE(pH8. 0)800ml H20中加121. lg Tris，37.23g Na2EDTA_2H20，用HC1調(diào)pH值至8. 0，定容至
1L，滅菌，備用。 (5)RNA酶的配制 將固體RNA酶溶于O. OlMNaAc，使酶濃度為10mg/ml，加熱至IO(TC處理15至20分鐘，慢慢冷卻至室溫，加入0. 1體積1M Tris-Hcl (pH7. 4)，分裝后保存于-2(TC冰箱。
(6)EB的配制 100mg溴化乙錠溶解于10ml H20中，于棕色瓶中避光保存。
(7) 50 X TAE (pH8. 0)800mlH20中加242. 2g Tris，82.03g NaAc，37.23g Na2EDTA-2H20，用冰醋酸調(diào)pH值至8.0，定容至1L保存。使用時(shí)需稀釋成1XTAE。
(8)5XTBETris27g，硼酸13. 75g，0. 5M EDTA 10ml，定容至500ml，備用。 (9)緩沖液"S"的配制 100ml 1M Tris-HCl (pH8. 0) 20ml5N NaCl 100ml 0.5M EDTA(pH8.0) 100ml 20% SDS 定容至1000ml。 1.7數(shù)據(jù)分析 根據(jù)最大似然法計(jì)算重組率(莫惠棟，1984)，并按Kosambi (1944)系數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化為CentiMorgan(cM)。
權(quán)利要求
在120個(gè)供試的RAPD引物中，共篩選到59個(gè)在中間偃麥草和煙農(nóng)15兩親本間有差異的引物，其中1個(gè)特異引物S170(5′-ACA ACG CGA G-3′)能在山農(nóng)Line15和中間偃麥草中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出1條約1200bp的特異帶，而煙農(nóng)15缺少此帶，因此S170-1200可作為山農(nóng)Line15所附加的中間偃麥草染色體的特異RAPD標(biāo)記，同時(shí)也在DNA分子水平上進(jìn)一步證明山農(nóng)Line15中含有中間偃麥草的遺傳物質(zhì)。
2. 為初步明確山農(nóng)Linel5所附加的中間偃麥草染色體的同源群歸屬，對(duì)其進(jìn)行了 SSR 分析，在192對(duì)供試的SSR引物中，共篩選到63對(duì)在親本中間偃麥草和煙農(nóng)15間有差異的 引物，其中引物Xgdm68-5D(P1 :5' -GCC TGA CCA CTC CCA TAA AA-3' ;P2 :5' -TCGGAA GGG GGA CTA TAC AA_3')在中間偃麥草和煙農(nóng)15中均能穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出1條約110 150bp左右的特異帶，但二者片段大小不同，在山農(nóng)Linel5則能中穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增出雙親的特 異帶型，因此引物Xgdm68-5D可用于鑒定雙體異附加系山農(nóng)Linel5。
全文摘要
本發(fā)明的目的是在獲得了中間偃麥草與小麥的雜種，并對(duì)其雜交后代的細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)、性狀特點(diǎn)、小孢子發(fā)生過程等進(jìn)行了研究的基礎(chǔ)上，將中間偃麥草中這個(gè)未知的抗白粉病基因進(jìn)行染色體定位及初步的分子標(biāo)記，為進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行精細(xì)定位、精細(xì)標(biāo)記、聚合、克隆等工作做前期準(zhǔn)備工作，并為小麥抗病育種工作挖掘新的種質(zhì)資源。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101760513SQ200810160298
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日
發(fā)明者李祥 申請(qǐng)人:李祥