專利名稱：具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，確切地說是一種具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制備方法。
背景技術(shù)：
從天然產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新型先導(dǎo)化合物，是新藥創(chuàng)制的重要途徑。微生物是自然界中天然 產(chǎn)物的主要來源，植物內(nèi)生真菌作為其中的一個(gè)重要類群，是相對較新的研究領(lǐng)域。內(nèi)生 真菌產(chǎn)生的豐富多樣的具多種生物活性的次生代謝產(chǎn)物在現(xiàn)代醫(yī)藥和農(nóng)藥工業(yè)中具有重 要的應(yīng)用潛力，它們在抗菌、抗病毒、殺蟲、抗腫瘤、抗心血管疾病以及抗衰老等領(lǐng)域具
有廣闊的應(yīng)用前景。典型例子是產(chǎn)生紫杉醇的內(nèi)生真菌的發(fā)現(xiàn)(Stierle et al.， 1993)。另 一方面依靠植物內(nèi)生真菌也發(fā)現(xiàn)了許多新生物活性物質(zhì)，如從傳統(tǒng)藥用植物雷公藤分離到 的內(nèi)生真菌/ /7/> oc/ad/'e//a sp.可產(chǎn)生3種新松胞菌素(cytochalasin)，對多種人腫瘤細(xì)胞 有很強(qiáng)的抑制作用(Wagenaar et al, 2000);從青蒿莖干中分離的內(nèi)生真菌Co/tetofrv'c/wm sp.能產(chǎn)生多種對病原真菌和植物病原細(xì)菌有良好抑制作用的化合物，其MIC值一般在 25~50|jg/L (Lu et al" 2000)。
喹啉是一種重要的雜環(huán)化合物，廣泛用于醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥和化學(xué)助劑等領(lǐng)域。喹啉 衍生物大都具有生物活性，在醫(yī)藥工業(yè)中廣泛用作藥物的中間體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗真菌活性的喹啉衍生物及其制備方法，該 喹啉衍生物對立枯絲核菌和終極腐霉等均有較好的抗菌活性。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其結(jié)構(gòu)式本發(fā)明還同時(shí)提供了上述喹啉衍生物的制備方法，包括以下步驟
1) 、將保藏號(hào)為CGMCC 1330的矮棒曲霉菌株ZJUF0028接種在PDA培養(yǎng)基上，于 2(TC 25'C避光培養(yǎng)5天后，用直徑為5mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅；
2) 、將菌餅接種到內(nèi)裝PDB培養(yǎng)液的三角瓶中，24 25X:靜止避光培養(yǎng)21天；抽濾除
去菌絲體后的濾液即為發(fā)酵液；
3) 、發(fā)酵液依次經(jīng)乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸干得浸膏；將浸膏溶于乙酸乙酯經(jīng)硅膠柱層
析，以體積比為3: 100的氯仿和甲醇的混合物作為洗液，所得的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干，得喹 啉衍生物粗品。
作為本發(fā)明的喹啉衍生物的制備方法的改進(jìn)將喹啉衍生物粗品溶于甲醇中，用高效 液相色譜法分離純化，得喹啉衍生物。
本發(fā)明首先利用了從南方紅豆杉分離得到的內(nèi)生真菌矮棒曲霉(Aspergr/7/us c/ai/atoA 朋/'o;s Batista et al)菌株ZJUF0028)，該菌株ZJUF0028的保藏單位中國微生
物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日2005
年3月16日，保藏號(hào)CGMCC 1330，保藏名稱矮棒曲霉(Asperg/7/us c/avatonan/ctis)。 其屬于真菌界(Fungi )，子囊菌門(Ascomycota)，散囊菌綱Eurotiomycetes，散囊菌目 (Eurotiales)，發(fā)菌科(Trichocomaceae)， 曲霉屬(/Aspe/ig/7/us)。
采用本發(fā)明方法制備而得的具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其為
3-tert國butyl誦6隱hydroxy-1-methyl-4,4a,5,6-tetrahydroquinoline-2，7(1H，3H)-dione，其具有
抗真菌活性，特別是對立枯絲核菌和終極腐霉具有較好的抗菌活性。由于本發(fā)明的喹啉衍 生物是一種源自內(nèi)生真菌的新型的抗真菌化合物，因此本發(fā)明能為開發(fā)新的抗真菌藥物提 供研究基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、菌株的分離培養(yǎng)
在實(shí)驗(yàn)室中按下列條件分離培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的矮棒曲霉。
采集南方紅豆杉(raxus ma/re/)的樹皮及樹枝，將樹皮及樹枝在質(zhì)量濃度5%次氯 酸鈉表面消毒2min，無菌水漂洗后置于無菌濾紙上吸干水，用無菌刀片去除外皮層，并 將其切成1 cm左右大小組織片，將組織片移接在分別含100wm^氨芐青霉素和鏈霉 素的2%水瓊脂平板上，24'C培養(yǎng)。
待菌絲長出后，將菌絲頂端移接到PDA培養(yǎng)基上；連續(xù)重復(fù)上述的純化3次，獲得純培養(yǎng)。
將所得的菌株ZJUF0028進(jìn)行保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，保藏日2005年3月16日，保藏號(hào)CGMCC 1330。
實(shí)施例2、喹啉衍生物的制備方法，依次進(jìn)行以下步驟
1) 、將矮棒曲霉菌株ZJUF0028接種在PDA培養(yǎng)基上，于2CTC 25。C避光培養(yǎng)5 天后，用直徑為5mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅。PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄 糖20g，瓊脂20g，水1000mL。
2) 、將上述直徑為5mm的菌餅3粒接入到內(nèi)裝200 mL PDB培養(yǎng)基的1000 mL三 角瓶中，24'C 25'C靜止避光培養(yǎng)21天，抽濾，用0.22mi微孔濾膜過濾后所得的濾液
即為發(fā)酵液。PDB培養(yǎng)基為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，水1L;
3) 、發(fā)酵液用100mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，在有機(jī)相中加入有機(jī)相
5%~10%重量比的無水硫酸鈉干燥；然后用濾紙過濾后，在負(fù)壓0.08MPa、 60'C的條件 下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，以回收有機(jī)溶劑乙酸乙酯，得浸膏。
將1g浸膏溶于5mL的乙酸乙酯中，過硅膠柱(H60型，中國青島海洋化工集團(tuán))， 以體積比為3: 100的氯仿和甲醇的混合物作為洗液，將所得的洗脫液在負(fù)壓0.08MPa、 6CTC的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得喹啉衍生物粗品。
4) 、將50mg喹啉衍生物粗品溶于1mL的甲醇中，采用高效液相色譜法(HPLC)分 離純化，采用Waters色譜柱(Waters sunfire prep C18 5(am 10x250mm)、 Waters 二元高壓 梯度泵(1525 binary HPLC pump)，柱溫30。C，流速O. 8mL/min，檢測波長為270 nm。 先用體積濃度10c/。甲醇沖洗20min后，再用體積濃度85%甲醇沖洗色譜柱；收集洗脫液， 分析每管組分，合并峰面積歸一含量在95%以上的管子，濃縮至干，得到棕褐色粉末， 為3-tert-butyl-6-hydroxy-1-methyl-4，4a,5，6-tetrahydroquinoline-2,7(1H,3H)-dione，即為 喹啉衍生物。
經(jīng)核磁共振和紅外、質(zhì)譜測定，其結(jié)構(gòu)式為
<formula>formula see original document page 5</formula>EIMS確定分子量251.18;紅夕卜光譜(KBr):3340 3300, 1730 (C=0)， 3060 1645 789(環(huán)內(nèi)0=0)。熔點(diǎn)為49土0.5。C。
實(shí)施例3 、喹啉衍生物的抗菌活性測定
以實(shí)施例2所得的喹啉衍生物作為檢測對象。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):馬鈴薯200g,葡萄糖20g， 瓊脂20g,水1000ml。
抗真菌活性是以病原真菌立枯絲核菌(尺/7/zoctoA7/'a so/3A7/')、終極腐霉(Py的/wm w附mwm)、甜瓜球腔菌(/Wycosp/ ae廠e〃a me/on/s)、齊整小菌核(Sc/eraf/wm ra/fe//)、灰 葡萄孢(SofAyf/sc/Vierea)和尖孢鐮刀菌(Fwsar/u/ oxyspomm)為靶標(biāo)生物，采用生長 速率法測定喹啉衍生物對靶標(biāo)菌的抑制作用。將不同濃度的喹啉衍生物按一定量加入到預(yù) 先溶化的一定量的PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒入直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，制成分別含喹啉 衍生物的PDA培養(yǎng)基平板，同時(shí)用不含喹啉衍生物的PDA培養(yǎng)基作對照，各種濃度和對 照重復(fù)3次。用直徑5 mm的打孔器打出菌絲塊放在平板中央。在24。C培養(yǎng)至菌絲生長 接近培養(yǎng)皿邊緣時(shí)測定菌落直徑(mm)，每個(gè)菌落十字交叉測量2次，計(jì)算出每種處理菌 落平均直徑，按公式計(jì)算相對抑制率。采用劑量對數(shù)一抑制率機(jī)率值法計(jì)算求得半抑制濃 度(IC50)。
相對抑制率=(直徑對照組一直徑處理組)/ (直徑對艦一5) xioo%
測定結(jié)果表明，喹啉衍生物對立枯絲核菌、終極腐霉、甜瓜球腔菌、齊整小菌核、灰 葡萄孢、尖孢鐮刀菌的IC50分別為6.8、 21.5、 48.8、 83.4、 113.7和134.4Mg/mL。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其特征是其結(jié)構(gòu)式為
2、 如權(quán)利要求l所述具有抗真菌活性的喹啉衍生物的制備方法，其特征是包括以下步驟1) 、將保藏號(hào)為CGMCC 1330的矮棒曲霉菌株ZJUF0028接種在PDA培養(yǎng)基上，于20'C 25。C避光培養(yǎng)5天后，用直徑為5mm的打孔器切取菌落邊緣菌餅；2) 、將菌餅接種到內(nèi)裝PDB培養(yǎng)液的三角瓶中，24 25。C靜止避光培養(yǎng)21天；抽濾除去 菌絲體后的濾液即為發(fā)酵液；3) 、發(fā)酵液依次經(jīng)乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸干得浸膏；將浸膏溶于乙酸乙酯經(jīng)硅膠柱層析， 以體積比為3: 100的氯仿和甲醇的混合物作為洗液，所得的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干，得喹啉衍生 物粗品。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述具有抗真菌活性的喹啉衍生物的制備方法，其特征是將喹啉衍 生物粗品溶于甲醇中，用高效液相色譜法分離純化，得喹啉衍生物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有抗真菌活性的喹啉衍生物，其結(jié)構(gòu)式為右式。本發(fā)明還同時(shí)公開了該喹啉衍生物的制備方法，包括以下步驟1)將保藏號(hào)為CGMCC 1330的矮棒曲霉菌株ZJUF0028接種在PDA培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)；2)將所得的菌餅接種到內(nèi)裝PDB培養(yǎng)液的三角瓶中，避光培養(yǎng)；3)所得的發(fā)酵液依次經(jīng)乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸干、硅膠柱層析等處理后，得喹啉衍生物粗品。本發(fā)明的喹啉衍生物對立枯絲核菌和終極腐霉等均有較好的抗菌活性。
文檔編號(hào)C12P17/02GK101412695SQ20081016258
公開日2009年4月22日 申請日期2008年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者林福呈, 王立君, 章初龍, 陳紹瑗 申請人:浙江大學(xué);寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院