專利名稱：：一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法。
背景技術(shù)：
：阿維菌素(Avermectins)是1976年美國Merck公司從日本北里研究所提供的一株放線菌新種一-阿維鏈霉菌(Str印tomycesavermitilis，簡稱S.avermitilis)發(fā)酵中獲得一簇結(jié)構(gòu)相似的新型化合物。它是一類新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其分子由一個(gè)16元內(nèi)酯環(huán)與兩個(gè)齊墩果糖糖苷配基構(gòu)成。天然阿維菌素有八種組分，主要是在C5、C22-C23和C26等三個(gè)位置存在結(jié)構(gòu)差異。八種組分中以Bla的殺蟲活性最高，其它異構(gòu)體殺蟲活性較低且毒性較高。在通常情況下，菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中Ala、A2a、Bla和B2a組分之和的比例在80%以上，而Alb、A2b、Blb和B2b組分之和的比例在20。/。以下。該簇結(jié)構(gòu)相似的化合物被統(tǒng)稱為阿維菌素或稱阿弗菌素。阿維菌素對(duì)家畜的腸內(nèi)寄生蟲具有極其有效的驅(qū)蟲活性，并具有作用機(jī)制獨(dú)特、有效劑量低、安全性高等特點(diǎn)，是一種有著良好市場應(yīng)用前景的生物農(nóng)藥；同時(shí)阿維菌素也是高效的殺蟲、殺螨劑，其衍生物也可用于治療人類由于螨蟲或線蟲引起的疾病?，F(xiàn)有，對(duì)阿維鏈霉菌的培養(yǎng)主要采用菌絲接種培養(yǎng)和挖塊接種培養(yǎng)，這兩種接種方式接種量很難控制，發(fā)酵結(jié)果不穩(wěn)定，效價(jià)增幅不明顯。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明通過采用全孢子接種，設(shè)計(jì)提供一種生產(chǎn)阿維菌素的方法。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于包括以下工藝步驟(1)將阿維鏈霉菌接種至斜面培養(yǎng)基，在溫度27-29"C下，培養(yǎng)7-9天；(2)取上述的阿維鏈霉菌孢子斜面，用無菌水振蕩洗滌斜面制備成孢子懸浮液；(3)計(jì)算孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，然后用移液管吸取孢子懸浮液至種子培養(yǎng)搖瓶中的種子培養(yǎng)基中，使每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為4X107-6X107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為30-50ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶；(4)將步驟(3)的孢子懸浮液進(jìn)行搖床培養(yǎng)，在溫度27-29'C下，轉(zhuǎn)速為200-300r/mim的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)40-48小時(shí)，得到全孢子液；(5)取上述的全孢子液，按培養(yǎng)基體積3%-7%的接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵搖瓶裝量為20-40ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，在溫度27-29。C下和濕度40%-50%下，轉(zhuǎn)速為200-300r/mim的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)240-260小時(shí)，得到含有阿維菌素的發(fā)酵液。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基組分重量百分比為酵母膏O.1%、麥芽糖O.1%、胰蛋白胨0.2%、葡萄糖0.4%、瓊脂粉2%，余量為蒸餾水，并使pH值調(diào)至7.2。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基含有玉米淀粉30g/L、玉米漿5g/L、酵母膏15g/L、KH2P044g/L、MgSO4*7H200.2g/L，并調(diào)pH為7.0-7.2。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生餅粉5g/L、KH2P040.5g/L，并調(diào)pH為7.0-7.2。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(3)中用采用血球記數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為4X107-5X1()7個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為30-40ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(3)中每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為5X107-6X1()7個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為40-50ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(4)中搖床培養(yǎng)條件為溫度為27-28°C，搖床轉(zhuǎn)速為230-270r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為42-46小時(shí)。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(4)中搖床培養(yǎng)條件為溫度為28-29°C，搖床轉(zhuǎn)速為240-260r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為43-45小時(shí)。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(5)中搖床培養(yǎng)條件為種子搖瓶裝量為25-35ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，接種量為3%_5%，溫度為27-28。C，搖床轉(zhuǎn)速為230-270r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為245-255小時(shí)。所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(5)中搖床培養(yǎng)條件為種子搖瓶裝量為28-32ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，接種量為5-7%，溫度為28-29。C，搖床轉(zhuǎn)速為240-260r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為247-253小時(shí)。本發(fā)明通過對(duì)阿維鏈霉菌通過純化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，最后得到阿維菌素，此方法設(shè)計(jì)合理，簡單易行。通過確定孢子的接種量和孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的時(shí)機(jī)，確定了最優(yōu)條件，本發(fā)明與挖塊接種和菌絲接種相比，孢子接種方式不僅在接種量上易控制，發(fā)酵結(jié)果較穩(wěn)定，效價(jià)增幅上比挖塊接種及菌絲接種有優(yōu)勢，最大的效價(jià)達(dá)到4600ug/ml以上。采用全孢子接種方式，連續(xù)進(jìn)行5批搖瓶發(fā)酵，并以常規(guī)的挖塊接種和菌絲接種培養(yǎng)作為對(duì)照。每批實(shí)驗(yàn)采用6個(gè)發(fā)酵搖瓶，260h放瓶測效價(jià)并計(jì)算平均值，孢子接種阿維菌素的最終效價(jià)遠(yuǎn)高于挖塊接種和菌絲接種，其5批實(shí)驗(yàn)平均效價(jià)均處于4600ug/ml以上，批次實(shí)驗(yàn)之間效價(jià)結(jié)果較為穩(wěn)定，這是因?yàn)槎咦咏臃N可以保持一個(gè)較為穩(wěn)定的接種量，同時(shí)又由于孢子接種時(shí)孢子分散性好、懸浮液較為均勻，所以批實(shí)驗(yàn)重復(fù)性相對(duì)較好。而挖塊接種和菌絲接種方式的效價(jià)較低，5批均低于4000txg/ml，而且批次實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不好，效價(jià)變化幅度比較大。圖1孢子接種與挖塊接種的阿維菌素效價(jià)增幅趨勢；圖2采用不同接種方式的發(fā)酵過程中總糖的變化趨勢；圖3采用不同接種方式的發(fā)酵過程中還原糖的變化趨勢；圖4采用不同接種方式的發(fā)酵過程中氨基氮的變化趨勢；圖5采用不同接種方式的發(fā)酵過程中pH的變化趨勢；圖6采用不同接種方式的發(fā)酵過程中效價(jià)變化趨勢。具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用的阿維鏈霉菌(Str印tomycesavermitilis)，由浙江升華拜克生物股份有限公司提供。配置培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基酵母膏O.1%、麥芽糖O.1%、胰蛋白胨0.2%、葡萄糖0.4%、瓊脂粉2%、余量為蒸餾水，并使pH值調(diào)至7.2。種子培養(yǎng)基玉米淀粉30g、玉米漿5g、酵母膏15g、KH2P044g、MgS04'7H200.2g和蒸餾水1000ml,并調(diào)PH為7.0-7.2。發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉120g、酵母粉15g、豆粕粉5g、花生餅粉5g、KH2P(X0.5g和蒸餾水1000ml，并i周pH為7.0-7.2。并調(diào)PH為7.0-7.2。實(shí)施例(1)將阿維鏈霉菌接種至斜面培養(yǎng)基，在溫度28。C下，培養(yǎng)8天；(2)取上述的阿維鏈霉菌孢子斜面，用無菌水振蕩洗滌斜面制備成孢子懸浮液；(3)采用血球記數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，然后用移液管吸取孢子懸浮液至種子培養(yǎng)搖瓶中的種子培養(yǎng)基中，使每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為5X107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為40ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶；(4)將步驟(3)的孢子懸浮液進(jìn)行搖床培養(yǎng)，在溫度28。C下，轉(zhuǎn)速為250r/mim的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)46小時(shí)，得到全孢子液；(5)取上述的全孢子液，按培養(yǎng)基體積5%的接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵搖瓶裝量為30ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，在溫度28。C下和濕度45%下，轉(zhuǎn)速為250r/mim的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)250小時(shí)，得到含有阿維菌素的發(fā)酵液。大量試驗(yàn)表明，步驟(1)中采用溫度27。C、28.5°C、29°C，培養(yǎng)7、9天；步驟(3)中采用每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為4X107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為30ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶，或每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為6X107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為50ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶，或接種量4.5X1()7個(gè)/ml，步驟(4)中采用溫度27°C，轉(zhuǎn)速300r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為40小時(shí)，或溫度29°C，轉(zhuǎn)速200r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)，或溫度28.5。C，轉(zhuǎn)速230r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為45小時(shí)，步驟(5)采用接種量3%，6%，7%，發(fā)酵種瓶裝量為20ml/250ml、40ml/250ml，溫度為27°C、27.5。C、29°C，轉(zhuǎn)速為200r/mim、230r/mim、270r/mim，時(shí)間為240小時(shí)、245小時(shí)、255小時(shí)、260小時(shí)，其他條件均與實(shí)施例相同，最后也能達(dá)到與實(shí)施例相同的技術(shù)效果。一阿維菌素效價(jià)測定阿維菌素含量測定采用HPLC，HP1100色譜系統(tǒng)。色譜柱HypersilODSC-18，5um，250咖X4.Omm;流動(dòng)相CH30H/H2O90/10;流速1.0mL/min;柱溫25°C;檢測波長246nm。分析方法取發(fā)酵液2.5mL，取發(fā)酵液2.5rnl，加入甲醇定容至50ml，充分振蕩超聲20min，過0.22m濾膜，濾液用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確吸取20UL樣品濾液注入色譜儀，根據(jù)積分面積，利用外標(biāo)法計(jì)算出發(fā)酵效價(jià)(發(fā)酵效價(jià)僅指BIa的濃度)。二孢子接種量的確定及其對(duì)效價(jià)的影響選取一支成熟豐滿的阿維鏈霉菌孢子斜面制備孢子懸浮液，采用一定量的孢子懸浮液接種培養(yǎng)，并與挖塊接種對(duì)照比較差異。如圖1顯示，在發(fā)酵前期與挖塊接種對(duì)比，孢子接種(sporeinoculation)的起步效價(jià)低，在48h時(shí)效價(jià)單位為0，且效價(jià)增幅較慢，但在中后期孢子接種效價(jià)增幅高于對(duì)照的挖塊接種(ck)，且效價(jià)在200h左右己超過挖塊接種，說明孢子接種的后勁較大。這可能跟孢子本身的優(yōu)勢有關(guān)，孢子一般是單核的，發(fā)酵過程中易保持純種和不退化，同時(shí)孢子后勁可能較大。推測可能還與兩種接種方式的不同接種量有關(guān)，接種量影響了菌體的生長速度和菌絲形態(tài)，菌絲形態(tài)在發(fā)酵中是一極其重要的參數(shù)，從而導(dǎo)致斜面孢子接種量的多少直接影響菌體的整個(gè)生長與發(fā)酵過程。孢子接種簡單的量化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明不同的接種量對(duì)孢子接種的優(yōu)勢有一定的影響，當(dāng)每ml種子培養(yǎng)基的孢子接種數(shù)量處于4X107和6X107個(gè)范圍內(nèi)，效價(jià)變化幅度不大，但是隨著孢子接種量高于107或低于107效價(jià)下降的趨勢較為明顯，最適孢子接種量處于4X107ml和6X107個(gè)/ml左右。因孢子接種可以保持一個(gè)較穩(wěn)定的接種量，而挖塊接種的接種量比較難以控制，從而也導(dǎo)致挖塊接種的批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)不穩(wěn)定，孢子接種由于孢子分散性好、懸浮液較為均勻?qū)е屡鷥?nèi)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性比較好。同時(shí)孢子接種的好壞與斜面孢子生長的好壞密切相關(guān)，因此孢子接種必需要首先保證孢子培養(yǎng)比較穩(wěn)定，采用的孢子應(yīng)是生長成熟豐滿的略呈灰色凸起的阿維鏈霉菌孢子。表l:不同接種量對(duì)阿維菌素效價(jià)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>三孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)機(jī)的確定孢子接種方法因孢子要經(jīng)過吸水膨脹、萌發(fā)到生長成菌絲過程，采用全孢子接種需要確定其接種到培養(yǎng)基中的時(shí)機(jī)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，斜面孢子、培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件等因素的不同均可能導(dǎo)致移種時(shí)間的差異，當(dāng)每ml種子培養(yǎng)基的孢子接種量處于4乂107禾卩6X107個(gè)范圍內(nèi)時(shí)，移種至發(fā)酵培養(yǎng)基中時(shí)間大約為36h一48h左右，此時(shí)，孢子基本已萌發(fā)，但菌絲還未出現(xiàn)。此時(shí)接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的孢子即為全孢子接種。四不同接種方式的阿維鏈霉菌種子生長過程的差異為挖掘孢子接種的優(yōu)勢存在的內(nèi)因，進(jìn)一步比較了幾種不同接種方式(孢子接禾中(sporeinoculation)、挖塊接禾中(CK)、菌絲接禾中(myceliainoculation)的阿維鏈霉菌發(fā)酵生長與發(fā)酵的差異，具體比較了阿維鏈霉菌生長與發(fā)酵過程中的營養(yǎng)消耗、過程pH變化、效價(jià)增長以及菌絲形態(tài)的差異。1.不同接種方式的阿維鏈霉菌種子生長過程的差異對(duì)種瓶中26h時(shí)不同接種方式的菌絲形態(tài)差異比較，可以得到挖塊接種的搖瓶種子生長較快，油鏡下觀察孢子接種與菌絲接種26h時(shí)在視野范圍內(nèi)均只有少量菌絲，而挖塊接種已有大量菌絲繁殖。這是因?yàn)橥趬K接種的菌塊中含有孢子和菌絲，生長較快；孢子接種由于孢子要經(jīng)過吸水膨脹、發(fā)芽到生長成菌絲的過程，菌絲接成網(wǎng)狀到成團(tuán)時(shí)間明顯晚于挖塊接種；菌絲接種挖的菌絲屬于水洗后的不帶孢子的菌落，接種量相對(duì)較少，少量的菌絲要繁殖成大量菌絲并接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的過程晚于挖塊接種，但早于孢子接種。移種的時(shí)間大概為挖塊接種41h、菌絲接種44h、孢子接種48h。從pH的變化狀況來看，三種接種方式對(duì)pH的整個(gè)變化趨勢并無影響。一般來說，阿維素產(chǎn)生菌的種子培養(yǎng)前期PH是穩(wěn)定的，到10h左右開始上升，再下降再上升再緩慢下降，最佳的移種時(shí)機(jī)可能是第二次上升的最高點(diǎn)，一般此時(shí)大概處于種子的對(duì)數(shù)生長期，此時(shí)pH值為6.7-6.8。因?yàn)榻臃N量，消毒過程的操作，培養(yǎng)條件的影響出現(xiàn)該轉(zhuǎn)折點(diǎn)的時(shí)刻稍有偏差?；旧先N不同的接種方式的種子生長過程中PH的變化都是遵行這種先升后降再升再緩慢下降的過程。但是具體的變化范圍有所區(qū)別，挖塊接種PH變化的峰值最高，變化的幅度最大，菌絲接種的pH變化的峰值最抵，變化幅度最小，孢子接種界于兩者之間，這可能與整個(gè)種子生長過程中的底物代謝有關(guān)。2.接種方式對(duì)阿維鏈霉菌發(fā)酵過程的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同接種方式的阿維鏈霉菌發(fā)酵過程中的營養(yǎng)消耗、過程pH變化以及菌絲形態(tài)均有差異。如圖2所示，在120h前，菌絲接種的總糖消耗速率最快，孢子接種的消耗速率最慢，144h后發(fā)酵過程中挖塊接種與菌絲接種的糖耗速率相當(dāng)，孢子接種的糖耗速率最快；如圖3所示，挖塊接種在前中期(200h前)還原糖濃度一直處于上升時(shí)期，峰值最高，孢子接種在前期上升，中期(100h后)的早期開始緩慢下降，中間有一短暫的平穩(wěn)期，菌絲接種在前期還原糖濃度上升最慢，峰值與孢子接種相當(dāng)，但上升期比孢子接種長。如圖4表明在前期氨基氮的消耗速率挖塊接種稍快于孢子接種，但在165h左右，挖塊接種與菌絲接種的氨基氮濃度已開始回升，此時(shí)孢子接種的氨基氮濃度仍處于下降期，216h后孢子接種方式的氨基氮也開始回升。如圖5所示pH變化趨勢基本相同，但變化幅度各有差異，孢子接種不僅在早早期PH回升速度較快，在后面的pH的穩(wěn)步下降過程中的下降速度也比其它兩種接種方式要快，這與菌體的碳氮源消耗與代謝有關(guān)。在220h小時(shí)左右，pH均大幅度開始回升，菌絲接種的PH回升最快，推測菌絲接種方式在后期最先開始自溶。挖塊接種因延遲期較短，菌體生長很快，總糖和氨基氮前中期消耗速率均比孢子接種快，發(fā)酵周期較短；而用孢子接種時(shí)，延遲期相對(duì)較長，生長達(dá)到高峰時(shí)間推遲，總糖和氨基氮開始消耗較慢，但孢子接種后勁大，中后期總糖消耗速率最快，糖的利用率也相對(duì)要更高，如圖6表明采用孢子接種方式阿維菌素的最終效價(jià)比對(duì)照挖塊接種提高了10%以上，比菌絲接種提高了20%以上。菌絲接種在生長快慢上介于挖塊接種與菌絲接種之間，效價(jià)增長最慢，糖的利用率最低，到發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)效價(jià)最低。因此與挖塊接種和菌絲接種相比，孢子接種方式不僅在接種量上易控制，發(fā)酵結(jié)果較穩(wěn)定，效價(jià)增幅上比挖塊接種及菌絲接種有優(yōu)勢。權(quán)利要求1.一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于包括以下工藝步驟(1)將阿維鏈霉菌接種至斜面培養(yǎng)基，在溫度27-29℃下，培養(yǎng)7-9天；(2)取上述的阿維鏈霉菌孢子斜面，用無菌水振蕩洗滌斜面制備成孢子懸浮液；(3)計(jì)算孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，然后用移液管吸取孢子懸浮液至種子培養(yǎng)搖瓶中的種子培養(yǎng)基中，使每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為4×107-6×107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為30-50ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶；(4)將步驟(3)的孢子懸浮液進(jìn)行搖床培養(yǎng)，在溫度27-29℃下，轉(zhuǎn)速為200-300r/mim的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)40-48小時(shí)，得到全孢子液；(5)取上述的全孢子液，按培養(yǎng)基體積3％-7％的接種量，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，發(fā)酵搖瓶裝量為20-40ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，在溫度27-29℃下和濕度40％-50％下，轉(zhuǎn)速為200-300r/mim的旋轉(zhuǎn)式搖床上培養(yǎng)240-260小時(shí)，得到含有阿維菌素的發(fā)酵液。2.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于所述的斜面培養(yǎng)基組分重量百分比為酵母膏O.1%、麥芽糖0.1%、胰蛋白胨0.2%、葡萄糖0.4%、瓊脂粉2%，余量為蒸餾水，并使pH值調(diào)至7.2。3.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于種子培養(yǎng)基含有玉米淀粉30g/L、玉米漿5g/L、酵母膏15g/L、KH2P044g/L、MgS047H200.2g/L，并i周pH為7.0-7.2。4.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基含有玉米淀粉120g/L、酵母粉15g/L、豆粕粉5g/L、花生餅粉5g/L、KH2P040.5g/L，并調(diào)pH為7.0-7.2。5.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(3)中用采用血球記數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液中孢子的數(shù)量，每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為4X107-5X107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為30-40ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶。6.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(3)中每毫升種子培養(yǎng)基的孢子接種量為5X107-6X107個(gè)，種子培養(yǎng)搖瓶裝量為40-50ml種子培養(yǎng)基/250ml搖瓶。7.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(4)中搖床培養(yǎng)條件為溫度為27-28°C，搖床轉(zhuǎn)速為230-270r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為42-46小時(shí)。8.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(4)中搖床培養(yǎng)條件為溫度為28-29°C，搖床轉(zhuǎn)速為240-260r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為43-45小時(shí)。9.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(5)中搖床培養(yǎng)條件為種子搖瓶裝量為25-35ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，接種量為3%-5%，溫度為27-28"C，搖床轉(zhuǎn)速為230_270r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為245-255小時(shí)。10.如權(quán)利要求1所述的一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，其特征在于步驟(5)中搖床培養(yǎng)條件為種子搖瓶裝量為28-32ml發(fā)酵培養(yǎng)基/250ml搖瓶，接種量為5%-7%，溫度為28-29°C，搖床轉(zhuǎn)速為240-260r/mim，培養(yǎng)時(shí)間為247-253小時(shí)。全文摘要一種采用全孢子接種工藝生產(chǎn)阿維菌素的方法，屬于微生物發(fā)酵
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。其工藝步驟包括阿維鏈霉菌的斜面培養(yǎng)；制成孢子懸浮液；確定接種量；進(jìn)行種子搖瓶培養(yǎng)；最后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到含有阿維菌素的發(fā)酵液。本發(fā)明通過對(duì)阿維鏈霉菌通過純化培養(yǎng)、種子培養(yǎng)和發(fā)酵培養(yǎng)，最后得到阿維菌素，此方法設(shè)計(jì)合理，簡單易行。通過確定孢子的接種量和孢子接種到發(fā)酵培養(yǎng)基的時(shí)機(jī)，確定了最優(yōu)條件，本發(fā)明與挖塊接種和菌絲接種相比，孢子接種方式不僅在接種量上易控制，發(fā)酵結(jié)果較穩(wěn)定，效價(jià)增幅上比挖塊接種及菌絲接種有優(yōu)勢，最大的效價(jià)達(dá)到4600μg/ml以上。文檔編號(hào)C12R1/465GK101429536SQ20081016305公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年12月15日優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日發(fā)明者炬儲(chǔ),儲(chǔ)消和,姚小員,莊英萍,張嗣良,梁劍光,王永紅申請(qǐng)人:浙江升華拜克生物股份有限公司