專利名稱：利用rna干擾文庫(kù)篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，屬于生物醫(yī) 藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腫瘤治療的手段主要分為手術(shù)切除、化療、放療和其他方法。腫瘤化療，即用化學(xué)藥物 進(jìn)行腫瘤的治療。近年來(lái)在腫瘤治療中發(fā)展最快的是化療，它己成為當(dāng)今臨床治療腫瘤的最 重要手段之一，屬于腫瘤的全身治療方法。隨著化學(xué)藥物種類的逐漸增多，用藥方法的不斷 改進(jìn)，臨床經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，其療效日益提高，化療已從以前的姑息性治療向根治性治療階 段過(guò)渡。
化療的原理是利用通過(guò)化學(xué)方法合成或從其他物質(zhì)中提取出來(lái)的藥物作用在細(xì)胞生長(zhǎng)繁 殖的不同環(huán)節(jié)上，抑制或殺滅腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到治療的目的?；熜Ч麤Q定于腫瘤細(xì)胞對(duì) 化療藥物的敏感性。這一敏感性是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性和敏感性的綜合，并決定于 腫瘤細(xì)胞的耐藥基因和敏感基因。
腫瘤細(xì)胞的耐藥性限制了腫瘤化療的使用和療效，因而人們?cè)噲D通過(guò)確定腫瘤耐藥基因， 并據(jù)此選擇化療藥物、制定化療方案，從而改善化療的效果。多年來(lái)，利用各種基因過(guò)表達(dá) 手段，人們找到了一些藥物耐受基因，如多藥耐藥基因蛋白、肺耐藥相關(guān)蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶 II、谷光甘肽S轉(zhuǎn)移酶等。遺憾的是，由于腫瘤細(xì)胞的耐藥性表現(xiàn)為多藥耐藥，即指腫瘤細(xì) 胞接觸一種化療藥物后產(chǎn)生針對(duì)這種藥物，和對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制相同和不同的化療 藥物亦產(chǎn)生耐受的現(xiàn)象。這樣一來(lái)，即使找到了腫瘤的耐藥基因，確定了腫瘤的多藥耐藥性 也很難找到有效的化療方案，達(dá)到改善化療的目的，使得多年來(lái)腫瘤的治療沒有大的改觀。
在這種情況下，我們?cè)噲D從腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性著手改善腫瘤化療的效果。不過(guò)，篩 選藥物敏感性需要通過(guò)降低藥物敏感基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。由于沒有可靠的降低表達(dá)手段，長(zhǎng)期 以來(lái)只確定了有限的藥物敏感基因，使得對(duì)藥物敏感基因的研究、開發(fā)、利用無(wú)法進(jìn)行，腫 瘤化療的效果受到了極大的限制。
最近，美國(guó)科學(xué)家安德魯 法爾和克雷格 梅洛1998年發(fā)現(xiàn)了 RNA干擾機(jī)制，2006年他 們倆分享了諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 一項(xiàng)全新的技術(shù)在提出后短短幾年就得到諾貝爾獎(jiǎng)的肯定，足見RNA干擾在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的開創(chuàng)性意義和極大的應(yīng)用前景。這一可以使得基因在體降低
表達(dá)的機(jī)制，也為尋找藥物敏感基因提供了條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤化 療藥物敏感基因的方法。它從腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性著手，利用RNA干擾文庫(kù)使得人類基因 組的各種基因分別在個(gè)體細(xì)胞任意地降低表達(dá)，在藥物敏感基因降低表達(dá)的細(xì)胞，藥物的敏 感性降低，受化療藥物處理后更容易存活下來(lái)，通過(guò)克隆可以確定存活細(xì)胞內(nèi)的藥物敏感基 因。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)完成的，該方法是利用降低基因表達(dá)的RNA干擾 文庫(kù)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感基因表達(dá)進(jìn)行降低。使得它們的藥物敏感性減弱，而藥物耐受 性升高，從而在高濃度藥物處理?xiàng)l件下存活下來(lái)，并形成細(xì)胞克隆，通過(guò)基因克隆找到并篩 選到藥物敏感基因。
本發(fā)明從存活下來(lái)的細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA， PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA片 段，用TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段，挑選克隆，純化DNA，最后基因測(cè)序確定篩選基 因。
本發(fā)明在篩選基因后進(jìn)一步分析對(duì)藥物敏感性的影響，它們是
a. 利用RNA干擾降低基因表達(dá)作Loss-of function分析；
b. 利用過(guò)表達(dá)作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實(shí)驗(yàn)分析篩選基因影響藥物敏感性的機(jī)制。
本發(fā)明在篩選基因后，分析其在腫瘤中對(duì)藥物敏感性的影響等狀況，它們是
a. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中過(guò)表達(dá)；
b. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中低表達(dá)；
c. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中被修飾，如甲基化等。
本發(fā)明是通過(guò)利用人類基因組的RNA干擾文庫(kù)，結(jié)合藥物敏感基因的作用原理發(fā)明了一 種藥物敏感基因篩選的新技術(shù)，并率先進(jìn)行了肝癌細(xì)胞的藥物敏感基因篩選，世界上首次確 定了一批真正的藥物敏感基因。
本發(fā)明從基因組水平篩選腫瘤細(xì)胞藥物敏感基因，并用于
4(1) 指導(dǎo)腫瘤化療的藥物選擇當(dāng)針對(duì)某一藥物的敏感基因表達(dá)正常時(shí)，推薦選用該藥物； 當(dāng)針對(duì)某一藥物的敏感基因降低表達(dá)或發(fā)生突變時(shí)，避免選用該藥物。
(2) 開發(fā)應(yīng)用此類基因作為腫瘤的生物標(biāo)志，在診斷之前，用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和發(fā)病普查；在診 斷時(shí)，用于腫瘤的分類和定級(jí)；在診斷之后，用于評(píng)估治療效果和檢測(cè)復(fù)發(fā)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明從腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性著手，利用RNA干擾文庫(kù)使得人類基因組的各種基因分 別在個(gè)體細(xì)胞任意地降低表達(dá)，這樣，在藥物耐受基因降低表達(dá)的細(xì)胞，藥物的耐受性降低， 受化療藥物處理后更容易被殺死、清除，因而不能找到藥物耐受基因；相反，在藥物敏感基 因降低表達(dá)的細(xì)胞，藥物的敏感性降低，受化療藥物處理后更容易存活下來(lái)，通過(guò)克隆可以 確定存活細(xì)胞內(nèi)的藥物敏感基因。
本發(fā)明的主要構(gòu)思是由于存在多藥耐藥性，部分細(xì)胞可以在臨床使用高濃度的抗癌藥 物作用下存活下來(lái)。不過(guò)，當(dāng)藥物濃度升高到一定程度時(shí)，所有的細(xì)胞將被殺死。經(jīng)過(guò)RNA 干擾文庫(kù)處理后，由于一些細(xì)胞內(nèi)的藥物敏感基因表達(dá)被降低，使得它們的藥物敏感性減弱， 藥物耐受性升高，從而在高濃度藥物處理?xiàng)l件下存活下來(lái)，并形成細(xì)胞克隆。通過(guò)基因克隆 可找到藥物敏感基因。
本發(fā)明的主要特征是
A、 與過(guò)去從腫瘤藥物耐受性著手不同，反向從腫瘤藥物敏感性著手；
B、 與過(guò)去篩選藥物耐受基因不同，反向篩選藥物敏感基因；
C、 與過(guò)去利用過(guò)表達(dá)文庫(kù)不同，反向利用降低基因表達(dá)的RNA干擾文庫(kù)。 本發(fā)明采用的主要技術(shù)方案是
A、 表型篩選
a. 在低濃度時(shí)，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都存活下來(lái)，但RNA文庫(kù)處理細(xì)胞存活下來(lái)更多；
b. 在中等濃度時(shí)，對(duì)照和RNA文庫(kù)處理細(xì)胞都形成克隆，但RNA文庫(kù)處理細(xì)胞形成克隆更 多；
c. 在一定濃度時(shí)，只有RNA文庫(kù)處理細(xì)胞存活下來(lái)并形成克??；
d. 在更高濃度時(shí)，RNA文庫(kù)處理細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞都沒有細(xì)胞存活下來(lái)。
B、 候選基因鑒定
a.從存活下來(lái)的細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA;b. PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA片段；
c. TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段；
d. 挑選克隆，純化DNA;
e. 基因測(cè)序確定篩選基因。
C、 分析篩選基因?qū)λ幬锩舾行缘挠绊?br> a. 利用RNA干擾降低基因表達(dá)作Loss-of function分析；
b. 利用過(guò)表達(dá)作Gain-of-function分析；
c. 利用生化實(shí)驗(yàn)分析篩選基因影響藥物敏感性的機(jī)制。
D、 分析篩選基因在腫瘤中的狀況(對(duì)藥物敏感性的影響)
a. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中過(guò)表達(dá)；
b. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中低表達(dá)；
c. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中被修飾，如甲基化等。 實(shí)施例1
利用本發(fā)明技術(shù)，我們已經(jīng)進(jìn)行了肝癌細(xì)胞(H印G2， A謂:HB-8065)的阿霉素和順 鉑的敏感基因的篩選，并分別篩選到了肝癌細(xì)胞的31種阿霉素敏感基因和23種順鉑敏感基 因(另外申請(qǐng)產(chǎn)品專利)。以篩選肝癌細(xì)胞的阿霉素敏感基因?yàn)槔榻B
具體實(shí)施例方式
一、利用RNA干擾文庫(kù)DNA轉(zhuǎn)染菲尼克思(Phoenix)反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞 第一天準(zhǔn)備菲尼克思反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞
1、 轉(zhuǎn)染之前18-24小時(shí)，按3x10710厘米平板接種菲尼克思細(xì)胞到平板上；
2、 讓細(xì)胞貼壁10-24小時(shí)；
3、 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到2/3時(shí)， 一個(gè)10厘米平板大約有5xl()6細(xì)胞。這時(shí)的包裝細(xì)胞最容易轉(zhuǎn)染 并產(chǎn)生最高滴度的病毒37°C;
*培養(yǎng)基DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。 第二天轉(zhuǎn)染
1、 準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)染用的DNA并溶解在HEPES溶液中；
2、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，在平板中加入25微摩氯喹(氯喹的儲(chǔ)藏濃度為50毫摩)；
*氯喹通過(guò)中和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)微泡內(nèi)的pH而抑制溶酶體內(nèi)的DNA酶；3、 在一個(gè)15毫升的試管內(nèi)，加入(以10厘米平板為例、室溫條件)
20微克文庫(kù)DNA和20微克輔助質(zhì)粒DNA; 62.5微升2摩爾的氯化鈣(手指輕彈混勻)； 加無(wú)菌雙蒸水至500微升總體積。
4、 快速加入500微升2倍的HEPES緩沖液，然后利用全自動(dòng)移液槍激烈吹氣泡5-15秒；
5、 轉(zhuǎn)染之前大約5分鐘，給包裝細(xì)胞換已預(yù)熱至、含終濃度25微摩氯喹的培養(yǎng)液9毫升；
6、 20分鐘之后，將HEPES/DNA混合液逐滴、快速加入平板。 注意
*在顯微鏡下觀察，應(yīng)該看到一些大小均一、分布均勻的細(xì)小黑色顆粒； *將平板放入37"C孵箱，前后左右輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)平板使DNA/CaP04顆粒均勻分布； * HEPES購(gòu)于Sigma (商品目錄號(hào):H-7006) *氯化鈣購(gòu)于Mallinkrodt (商品目錄號(hào)H-4160)
*由于pH非常重要，可分別配制pH 6.95、 pH 7.00、 pH 7. 05的緩沖液進(jìn)行測(cè)試； *使用之前將所有的試劑復(fù)蘇到室溫。 第三天轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，換液、準(zhǔn)備好感染細(xì)胞
1、 轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，給包裝細(xì)胞換預(yù)熱至37°C的培養(yǎng)液10毫升(不要讓氯喹在培養(yǎng)液中影響 細(xì)胞超過(guò)24小時(shí))；
2、 將感染靶細(xì)胞分盤，細(xì)胞密度為2x10710厘米平板，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血清，1% 青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。
第四天轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清感染靶細(xì)胞
1、 用移液槍從轉(zhuǎn)染后的包裝細(xì)胞中吸取上清并置于15毫升的試管內(nèi)，1500轉(zhuǎn)/分鐘離心5 分鐘以除去細(xì)胞碎片；
2、 用0.45微米濾膜過(guò)濾；
3、 從耙細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)吸除2毫升培養(yǎng)液；
4、 在靶細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入5微升polybrene(polybrene的1000倍儲(chǔ)藏濃度為5毫克/毫升)， 混勻；
5、 在靶細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)加入2毫升含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，置于32-37。C，輕輕混勻；6、每隔4-6小時(shí)進(jìn)行重復(fù)感染。 第五天吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清
感染后24小時(shí)吸除含反轉(zhuǎn)錄病毒的上清，加入新鮮的培養(yǎng)基DMEM, 10%胎牛血清，1%青 -鏈霉素，1%谷氨酰胺。并加入5微升puromycin (puromycin的1000倍儲(chǔ)藏濃度為5毫克/ 毫升)篩選24小時(shí)。
二、 處理(表型篩選)
第六天感染后48小時(shí)(puromycin作用24小時(shí))，靶細(xì)胞可用于各種處理，進(jìn)行表型篩選。
1、 將感染靶細(xì)胞分盤，培養(yǎng)液為DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺。
2、 分盤后12小時(shí)，以不同濃度加入不同藥物處理。
三、 挑細(xì)胞克隆
2周后，存活細(xì)胞形成了細(xì)胞克隆
1、 吸除細(xì)胞上清，加入無(wú)菌PBS洗一遍并吸除PBS;
2、 用消毒無(wú)菌的槍頭挑取單個(gè)細(xì)胞克隆，置于含100微升1毫摩EDTA/0. 25%胰酶的48孔平 板內(nèi)；
3、 37。C消化5分鐘；
4、 加入200微升培養(yǎng)基(DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺，200微克/毫升 puromycin)反復(fù)吹打；
5、 24小時(shí)后，換新鮮培養(yǎng)基(DMEM， 10%胎牛血清，1%青-鏈霉素，1%谷氨酰胺，200微克/ 毫升puromycin);
6、 將增殖細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)到體積大的平板上生長(zhǎng)；
7、 待細(xì)胞擴(kuò)增到足夠時(shí)，冷凍保存細(xì)胞克?。煌瑫r(shí)收集細(xì)胞用于提取基因組DNA。
四、 基因鑒定
1、 利用Roche生產(chǎn)的High Pure PCR Template Preparation試劑盒(商品目錄號(hào) 11796828001)從收集的細(xì)胞中提取基因組DNA;
2、 以基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增插入細(xì)胞基因組DNA的RNA干擾文庫(kù)特異片段 (1)擴(kuò)增引物
RNAi clone 1: 5， -gag ggc eta ttt ccc atg at_3， (20bp)RNAi clone 2: 5， _gta ata cga etc act ata ggg cct ctt egg卿tea get tc-3， (41bp)
(2) PCR反應(yīng)體系
H20 13. 0 |xl
10xPCR Buffer 2. 5 pi
25mM MgCl2 2. 0 pi
2. 5mM dNTP 2. 0 pi
10nM primer F2. 0 pi
lO(iM Primer R 2. 0 |xl
Taq 0.5 pi
Template 1. 0 pi
Total 25.0 pi
(3) PCR反應(yīng)條件
1. 940C 3:00
2. 94。C 0:15
3. 60°C 0:45
4. 720C 2:00
5. Go to 2 35X
6. 72。C 4:00
7. 4QC forever
(4) PCR反應(yīng)結(jié)果在0.8%瓊脂糖凝膠水平電泳，觀察一0.6 kb條帶。
3、 利用Invitrogen Life Technologies生產(chǎn)的T0P0 TA克隆試劑盒(商品目錄號(hào) K4600-01)將PCR擴(kuò)增的插入細(xì)胞基因組DNA的RNA干擾文庫(kù)特異片段克??；
4、 挑選得到的克隆，置于含2毫升青霉素抗性的LB內(nèi)，37T振蕩培養(yǎng)16小時(shí)；
用Sigma-Aldrich生產(chǎn)的GeneElutePlasmidMinipr印試劑盒(商品目錄號(hào):PLN350)提取 質(zhì)粒；
5、 將質(zhì)粒送測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序引物為反向M13;
6、 利用公用的NCBI Blast程序(http:〃blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)確定基 因；對(duì)候選基因作生物信息學(xué)分析，了解基因的基本情況及其已知的功能。
931種阿霉素敏感基因被鑒定出來(lái)，在此僅給出其中三種基因?yàn)槔?
(1) CDK10: shRNA片段為 ATCAGCTCCACGATGTTCGGATGACGCAGGTTGGCTTGCGTTATCCGGACATCGTGGAGTTGA;
(2) GP5: shRNA片段為 CTCCAGAAACACCACCTTATCCAGCAACGCCAACGCTGCTGGATAAGATGGTGCTCCTGGAG;
(3) INTS12: shRNA片段為 GATGTTGCCAGACCAGTCAAACCCACAGGTTGGCTTGTGGGTTTGATTGGTCTGGTAATATC。
其中CDK10已在最近被證實(shí)與乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫西芬的敏感性相關(guān)(Iorns et al. 2008. Identification of CDK10 as an important determinant of resistance to endocrine therapy for breast cancer. Cancer Cell, 13(2): 83-85 )。 五、藥物敏感基因?qū)λ幬锩舾行缘蔫b定
1、 分別構(gòu)建藥物敏感基因的基于反轉(zhuǎn)錄病毒載體的RNA干擾和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒；
2、 利用RNA文庫(kù)同樣的技術(shù)和步驟分別建立穩(wěn)定RNA干擾和過(guò)表達(dá)細(xì)胞；
3、 檢測(cè)各細(xì)胞的藥物敏感性-(1)半抑制率(IC50)檢測(cè)
a. 將肝癌細(xì)胞按畫個(gè)/100微升/孔接種到96孔板上，37°C， 5%C02， 24小時(shí)，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺；
b. 置換帶有0、 5、 10、 15、 20、 30納摩阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)三天，設(shè)置三復(fù)孔；
c. 置換50微升/孔帶有MTT (3毫克/毫升)、不含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，37°C， 5%C02培 養(yǎng)4小時(shí)；
d. 吸除培養(yǎng)液，按50微升/孔加入二甲基亞砜(DMS0)，搖床搖動(dòng)10分鐘；
e. 利用分光光度計(jì)讀取波長(zhǎng)570納米的吸光度；
f. 記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；
g. 以阿霉素的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，然后得到50%抑制率時(shí)候的藥品濃度， 就是IC50 (抑制率=1-加藥組0D值/對(duì)照組0D值)。
注意事項(xiàng)
a. 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度；
b. 避免血清干擾 一般選小于10%的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液；
c. 設(shè)空白對(duì)照與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后 比色以空白調(diào)零；
d. 保持MTT實(shí)驗(yàn)吸光度值最后要在0-0. 7之間這一線性關(guān)系范圍。
(2) 相對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)速度檢測(cè)
a. 將肝癌細(xì)胞按1000個(gè)/100微升/孔接種到96孔板上，37°C， 5%C02， 24小時(shí)，培養(yǎng)液DMEM， 10%胎牛血清，1%青_鏈霉素，1%谷氨酰胺；
b. 置換帶有0、 5、 10、 15、 20、 30納摩阿霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng)7天，設(shè)置三復(fù)孔；
c. 利用細(xì)胞計(jì)數(shù)器每天計(jì)數(shù)細(xì)胞的總數(shù)；
d. 計(jì)算處理組對(duì)未處理組的細(xì)胞數(shù)的百分比。比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差別。
(3) 細(xì)胞克隆形成檢測(cè)
a. 將1.2X低熔點(diǎn)瓊脂糖與2X細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0. 6%的底層瓊脂，6孔 板中每個(gè)孔1.2ml溫室凝固；
b. 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，胰酶消化后吹散成單個(gè)細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為10000個(gè)/ml;
c. 將0.6%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2X細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合，制備0.3%的上層瓊脂， 按100/lml上層瓊脂和lOOjil單細(xì)胞懸液/孔(1000個(gè)/孔)，混勻，室溫凝固；
d. 置于37。C, 5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 — 3周；
e. 計(jì)數(shù)含50個(gè)細(xì)胞以上的克隆，計(jì)算細(xì)胞克隆形成率。
六、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
1、 各種實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器；
2、 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific, Inc.,美國(guó))；
3、 超凈工作臺(tái)(Forma Scientific, Inc.,美國(guó));
4、 分光光度計(jì)(BIO-TEK INSTRUMENTS, Inc.,美國(guó))；
5、 Zl-顆粒計(jì)數(shù)器(BECKMAN COULTER,美國(guó))；
6、 倒置顯微鏡(尼康，日本)；
7、 PCR儀(Bio-Rad,美國(guó))。
權(quán)利要求
1、一種利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，該方法是利用降低基因表達(dá)的RNA干擾文庫(kù)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感基因表達(dá)進(jìn)行降低。使得它們的藥物敏感性減弱，而藥物耐受性升高，從而在高濃度藥物處理?xiàng)l件下存活下來(lái)，并形成細(xì)胞克隆，通過(guò)基因克隆找到并篩選藥物敏感基因。
2、 所述的從存活下來(lái)的細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA， PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA 片段，用TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段，挑選克隆，純化DNA，最后基因測(cè)序確定篩選 基因。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，其特征 在于在篩選基因后進(jìn)一步分析對(duì)藥物敏感性的影響，它們是a. 利用RNA干擾降低基因表達(dá)作Loss-of function分析；b. 利用過(guò)表達(dá)作Gain-of-function分析；c. 利用生化實(shí)驗(yàn)分析篩選基因影響藥物敏感性的機(jī)制。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，其特征 在于在篩選基因后，分析它們?cè)谀[瘤中對(duì)藥物敏感性的影響等狀況，它們是a. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中過(guò)表達(dá)；b. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中低表達(dá)；c. 檢測(cè)篩選基因是否在腫瘤中被修飾，如甲基化等。
全文摘要
一種利用RNA干擾文庫(kù)篩選腫瘤化療藥物敏感基因的方法，該方法是利用降低基因表達(dá)的RNA干擾文庫(kù)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物敏感基因表達(dá)進(jìn)行降低。使得它們的藥物敏感性減弱，而藥物耐受性升高，從而在高濃度藥物處理?xiàng)l件下存活下來(lái)，并形成細(xì)胞克隆，通過(guò)基因克隆找到并篩選藥物敏感基因；本發(fā)明從存活下來(lái)的細(xì)胞內(nèi)提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增從RNA干擾文庫(kù)中插入的DNA片段，用TA克隆法克隆PCR擴(kuò)增的DNA片段，挑選克隆，純化DNA，最后基因測(cè)序確定篩選基因；本發(fā)明率先進(jìn)行了肝癌細(xì)胞的藥物敏感基因篩選，世界上首次確定了一批真正的藥物敏感基因，并用于(1)指導(dǎo)腫瘤化療的藥物選擇當(dāng)針對(duì)某一藥物的敏感基因表達(dá)正常時(shí)，推薦選用該藥物；當(dāng)針對(duì)某一藥物的敏感基因降低表達(dá)或發(fā)生突變時(shí)，避免選用該藥物，(2)開發(fā)應(yīng)用此類基因作為腫瘤的生物標(biāo)志，在診斷之前，用于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和發(fā)病普查；在診斷時(shí)，用于腫瘤的分類和定級(jí)；在診斷之后，用于評(píng)估治療效果和檢測(cè)復(fù)發(fā)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101429544SQ20081016340
公開日2009年5月13日 申請(qǐng)日期2008年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月18日
發(fā)明者黃行許 申請(qǐng)人:黃行許