專利名稱：：一種抗除草劑基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及一種基因和利用這種基因產(chǎn)生能夠抗至少一種除草劑的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物以及利用這種基因產(chǎn)生能夠被至少一種除草劑選擇性殺滅的轉(zhuǎn)基因玉米的方法。
背景技術(shù)：
：雜草防治是農(nóng)作物種植中的一個(gè)重要問(wèn)題。利用除草劑殺滅雜草是一種比較簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的方法。但是除草劑常常不能選擇性地殺滅雜草，特別是殺滅和農(nóng)作物親緣關(guān)系比較近的雜草。因此除草劑的使用受到了很大的限制。而利用轉(zhuǎn)基因的方法發(fā)展抗除草劑農(nóng)作物可以解除這種限制，從而更好地利用除草劑來(lái)防治雜草。利用轉(zhuǎn)基因方法可以將抗除草劑基因?qū)朕r(nóng)作物，從而使該農(nóng)作物獲得高的抗除草劑能力，最終使除草劑能夠選擇性地殺滅雜草。例如，抗草甘瞵的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物目前已經(jīng)大規(guī)模推廣應(yīng)用(Padgetteetal.1996"Newweedcontrolopportunities:DevelopmentofsoybeanswithaRoundUPReady.)。但是針對(duì)另外一些廣泛使用的高效除草劑，如磺酰脲類除草劑，目前還沒(méi)有通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法獲得的高抗性轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。'因此發(fā)展高抗磺酰脲類除草劑的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物可以更有效和更安全地防治農(nóng)作物中的雜草。細(xì)胞色素P450酶可能是許多除草劑的解毒酶(張山、李平、劉德立"細(xì)胞色素P450酶系與除草劑代謝"中國(guó)生物工程雜志2004年第24巻第10期)。細(xì)胞色素P450酶是一類利用NADPH所傳遞的電子去催化分子氧活化的血紅素蛋白，在植物體內(nèi)介導(dǎo)一序列的氧化反應(yīng)，其功能涉及木質(zhì)素、甾醇、類萜、生物堿、脂肪酸和許多起植保素功效的次生物質(zhì)的合成代謝，以及天然和人工合成的許多外源抗生素如除草劑等成分的降解和脫毒代謝。研究表明，細(xì)胞色素P450酶是一個(gè)超級(jí)基因家族，植物中己命名的P450基因已超過(guò)1000個(gè)，例如水稻中就可能有528個(gè)P450基因。應(yīng)用傳統(tǒng)的反向遺傳學(xué)手段包括EMS誘變、T-DNA和轉(zhuǎn)座子插入等和基因過(guò)量表達(dá)技術(shù)、基因芯片技術(shù)及反義RNA或RNAi抑制技術(shù)來(lái)研究這類基因的生物學(xué)功能，往往因不同基因間大量錯(cuò)綜復(fù)雜的同源序列的存在、單個(gè)基因表達(dá)豐度的偏低和基因表達(dá)產(chǎn)物在抽提液中的不穩(wěn)定性而受阻。以至到目前為止，被確切驗(yàn)證其生物學(xué)功能的植物P450基因總共不到40個(gè)。因此發(fā)現(xiàn)和利用抗除草劑的細(xì)胞色素P450酶基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。另一方面，利用轉(zhuǎn)基因玉米作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物蛋白質(zhì)、工業(yè)用酶等也正在被廣泛研究和幵發(fā)。防止作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物蛋白質(zhì)、工業(yè)酶和其他可能對(duì)人和動(dòng)物有不良作用的轉(zhuǎn)基因玉米混入糧食和飼料用玉米是非常重要的。例如，大部分常規(guī)玉米和轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)煙磺隆有比較高的抗性。如果在轉(zhuǎn)基玉米中在表達(dá)目的基因的同時(shí)抑制抗煙磺隆基因的表達(dá)，則由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因玉米就對(duì)煙磺隆敏感。這樣獲得的轉(zhuǎn)基因玉米就可以被煙磺隆選擇性地殺滅，從而在需要時(shí)可以控制這些轉(zhuǎn)基因玉米的意外傳播、防止它們混入到食用玉米之中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種抗除草劑基因，利用該基因能獲得對(duì)磺酰脲類除草劑有很高抗性的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物，還能獲得可利用磺酰脲類除草劑選擇性殺滅的轉(zhuǎn)基因玉米的方法。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種抗除草劑基因，該基因的核苷酸序列為SEQIDNO:l或者與SEQIDNO:1有90%以上的相同性。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNO:2或者與SEQIDNO:2有卯％以上的相同性。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種DNA質(zhì)粒，其含有上述基因并且與能夠在植物有功能的啟動(dòng)子連接。本發(fā)明還同時(shí)提供了另一種DNA質(zhì)粒，其含有上述基因或者基因片斷構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達(dá)框。本發(fā)明還同時(shí)提供了一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其包含上述核酸。本發(fā)明還同時(shí)提供了另一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，上述基因的表達(dá)被反義RNA、RNAi或者其他方法抑制。本發(fā)明還同時(shí)提供了上述抗除草劑基因的用途。作為本發(fā)明的抗除草劑基因的用途的改進(jìn)可用于制備對(duì)除草劑增加了抗性的轉(zhuǎn)基因植物，或者獲得利用除草劑選擇性殺滅轉(zhuǎn)基因玉米的方法。作為本發(fā)明的抗除草劑基因的用途的進(jìn)一步改進(jìn)上述除草劑為乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑、色素合成抑制類除草劑、原卟啉原氧化酶抑制劑類除草劑、光系統(tǒng)II抑制劑4類除草劑或合成生長(zhǎng)素類除草劑。乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑包括煙磺隆(Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(primisulfiiron)、噻磺隆(thifensulfuron)、氯磺隆(chlorsulfiiron)和咪草煙(imazethapyr)等等。色素合成抑制(pigmentsynthesis-inhibiting)類除草劑包括硝草酮mesotrione、tembotrione、topramezone禾口磺草酮(sulcotrione)等等。原卟啉原氧化酶抑制劑類除草劑(PPO-inhibitingclassofherbicides)包括三氟羧草醚(acifluorfen)、氟磺胺草醚(fomesafen)、乳氟未草靈(lactofen)、磺酰唑草酮(sulfentrazone)、唑草酮(carfentrazone)、氟烯草酸(flumiclorac)和速收(flumioxazin)等等。光系統(tǒng)II(PSII)抑偉!j齊!j類除草齊!j包括symmetricaltriazines、triazinones(asymmetricaltriazines)、取代脲類、脲嘧啶類(uracils)、嗪酮類(pyridazinones)、苯基-氨基甲酸酯類、丙烯腈類(nitriles)、苯并噻唑硫代乙酸甲酯類(benzothiadiazoles)和苯基鄰二氮雜苯類(phenylpyridazines)等等。本發(fā)明所提供的對(duì)植物進(jìn)行改造的方法是利用SEQIDNO:l所述的基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，再將轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞培育成相應(yīng)植株，從而使這些轉(zhuǎn)基因植物獲得抗至少為如上一種除草劑的能力。植物可選用水稻、玉米、棉花、小麥、大豆、草坪草、大麥或牧草。氨基酸序列相同性相當(dāng)高的蛋白質(zhì)一般具有相同的功能，因此與SEQIDNO:2所示氨基酸序列具有90%、95。/。以上相同性的基因都可以與SEQIDNO:2有相似的功能。氨基酸的相同性可以通過(guò)現(xiàn)有的方法計(jì)算，例如Karlin禾QAltschul,19卯，Pore.Natl.Acad.Sci.USA87:3364;Karlin和Altschul(1993)Proc.Nat.Acad.Sci.USA90:5873-5877.)。特別需要說(shuō)明的是相同性是基于同源部分的比較，而不包括人工或天然融合基因中的不同源的部分。抗除草劑蛋白質(zhì)(SEQIDNO:2)也可以用來(lái)人工引入一個(gè)或多個(gè)變異而獲得保持有抗除草劑能力的變異分子。例如利用低保真PCR的方法可以產(chǎn)生很多變異分子，而這些變異分子可以通過(guò)篩選獲得繼續(xù)保持有抗除草劑能力的變異分子。利用本發(fā)明的基因所編碼的蛋白質(zhì)序列，可以設(shè)計(jì)和人工合成密碼子優(yōu)化的有利于在植物中表達(dá)的核酸序列。例如根據(jù)Campbell禾[lGowri(1990)的報(bào)道(PlantPhysiol.92:1-11)。本發(fā)明的抗除草劑基因的核酸片斷可以進(jìn)一步構(gòu)建包含表達(dá)構(gòu)件的植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。這個(gè)表達(dá)構(gòu)件包括啟動(dòng)子、抗除草劑基因和終止子。植物轉(zhuǎn)化質(zhì)粒是已知的和成熟的技術(shù)。例如，PlantMol.Biol.25:989-994(1994)報(bào)道的載體(ACCESSIONAF234296)。表達(dá)構(gòu)件的構(gòu)建是已知的和成熟的技術(shù)。在轉(zhuǎn)化單子葉植物時(shí)啟動(dòng)子可以是禾本科植物的泛素(Ubiqutin)啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白(Actin)啟動(dòng)子、或者其他啟動(dòng)子(如CaMV的35S啟動(dòng)子)。而終止子可以是Nos終止子或者其他終止子。在轉(zhuǎn)化雙子葉植物時(shí)啟動(dòng)子可以是雙子葉植物的泛素啟動(dòng)子，或者其他啟動(dòng)子。這個(gè)抗除草劑基因表達(dá)構(gòu)件可以通過(guò)植物的轉(zhuǎn)化被整合到植物的基因組中，從而穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。植物轉(zhuǎn)化的技術(shù)和方法是已知和成熟的。表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)入植物的方法和步驟各種植物有所不同，同種植物不同的品種也可能有所不同。通?？梢酝ㄟ^(guò)農(nóng)桿菌(如Agrobacterium菌株LAB4404)或基因槍導(dǎo)入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈傷組織或原生質(zhì)體。通過(guò)上述方法獲得的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物株系可以用如上至少一種除草劑進(jìn)行測(cè)定，例如是煙磺隆(Nicosulfiiron)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、噻磺隆(thifensulfUron)、氯磺隆(chlorsulfUron)、咪草煙(imazethapyr)、苯達(dá)松(Bentazon)、tembotrione、石肖草酮(mesotrione)等?？剐缘臏y(cè)定可以通過(guò)直接噴灑除草劑而實(shí)現(xiàn)。提高了抗性的株系可以進(jìn)一步培育新的農(nóng)作物品種。本發(fā)明獲得的基因的另外一個(gè)用途是獲得可以用除草劑選擇性殺滅轉(zhuǎn)基因玉米的方法。本發(fā)明具體是通過(guò)這樣的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的提供一種玉米細(xì)胞色素P450基因，它的核苷酸序列是SEQIDNO:1。在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)目的基因的同時(shí)，利用反義RNA或者RNAi的方法抑制玉米中這種細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)，從而使轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)至少一種除草劑敏感。利用反義RNA或者RNAi的方法抑制基因表達(dá)的技術(shù)是已有的技術(shù)(Kusaba2004RNAInterferenceincropplants,CurrentOpinioninBiotechnology,.15:139-143)。進(jìn)一步，在本發(fā)明中，目的基因表達(dá)框與抑制P450基因(SEQIDNO:l)表達(dá)的RNA干擾框連接在同一個(gè)DNA導(dǎo)入片斷上，從而達(dá)到在轉(zhuǎn)基因玉米中目的基因的表達(dá)和除草劑的解毒酶基因的抑制緊密連鎖。特別是當(dāng)上述目的基因是一種抗草甘膦基因時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)草甘膦具有高抗性而對(duì)至少其他一種除草劑敏感。上述目的基因可以是抗蟲等抗逆基因、工業(yè)酶基因、藥物蛋白質(zhì)基因以及其他有價(jià)值基因；目的基因可以是一個(gè)、二個(gè)或者多個(gè)。6上述RNA干擾抑制表達(dá)框可以由二個(gè)部分組成一個(gè)是啟動(dòng)子，它可以是水稻或者玉米泛素啟動(dòng)子、或者水稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、或者是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子、或者是其他在未本科農(nóng)作物中有活性的啟動(dòng)子。另一個(gè)部分與啟動(dòng)子功能性相聯(lián)的是本發(fā)明的細(xì)胞色素P450基因(SEQIDNO:l)的反義RNA或者RNAi。產(chǎn)生反義RNA的DNA模板可以是全長(zhǎng)基因，或者僅僅是其中的一個(gè)或幾個(gè)片斷。產(chǎn)生RNA干擾的序列(RNAi)可以根據(jù)SEQIDNO:l設(shè)計(jì)。同時(shí)具有目的基因表達(dá)框和玉米抗除草劑P450基因抑制表達(dá)框的載體可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法穩(wěn)定導(dǎo)入玉米。這個(gè)方法包括基因槍方法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，這二種方法都是成熟的已知的方法。利用本發(fā)明的方法而獲得的轉(zhuǎn)基因玉米就能被至少一種除草劑選擇性地殺滅。因此必要時(shí)可以通過(guò)使用這種除草劑防止轉(zhuǎn)基因玉米的意外傳播，消滅混入非轉(zhuǎn)基因玉米中的轉(zhuǎn)基因玉米，從而保證了目的基因能夠被控制。特別當(dāng)轉(zhuǎn)基因玉米的目的基因是藥物蛋白質(zhì)基因、工業(yè)蛋白質(zhì)基因時(shí)，防止這些轉(zhuǎn)基因玉米的傳播對(duì)食品和飼料安全非常重要。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明可以大幅度簡(jiǎn)化農(nóng)作物的雜草防治方法，擴(kuò)大上述至少一種除草劑的應(yīng)用范圍。同時(shí)本發(fā)明可以用于發(fā)展可控性的轉(zhuǎn)基因玉米，從而降低轉(zhuǎn)基因玉米的食品和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。具體實(shí)施例方式本發(fā)明的以下實(shí)施例中所使用的分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法均為已知的技術(shù)。在Ausubel編寫的JohnWileyandSons公司出版的CurrentProtocolsinMolecularBiology,禾口J.Sambrook等編寫ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文獻(xiàn)均有詳細(xì)的說(shuō)明。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1、對(duì)煙磺隆玉米敏感的玉米品系統(tǒng)的選擇收集10種不同的玉米品種，在5-6葉期噴灑煙磺隆(克有效成分/畝)。其中一個(gè)品種N-SS是對(duì)煙磺隆敏感，一次噴灑有效成分5g/畝就達(dá)到100%殺滅。N-SS分別和其中的2個(gè)抗性品種D001和D002雜交的后代仍然是抗性。N-SS、D001和D002等均由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院提供(可通過(guò)購(gòu)買的方式獲得)。實(shí)施例2、對(duì)煙磺隆敏感玉米和抗煙磺隆玉米中P450基因的克隆和比較根據(jù)玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的序列，設(shè)計(jì)了5對(duì)PCR引物分別從抗性品系D001和敏感品系N-SS擴(kuò)增可能參與抗煙磺隆的5個(gè)P450基因。PCR的引物分別為基因1:Azm-l-F:GGATCCACCATGGATAAGGCCTACATCGCCGCCC;Azm-l-R:TCTAGATTCAGAGCCTCTTAAGAACACCACGC;基因2:Azm-2-F:GGATCCACCATGGATAAGGCCTACGTGGCCGTG;Azm2-6R:TCTAGATTCAGAGCTCCAGAAGAAGATGGCGC;基因3:Azm-3-F:AGATCTACCATGGATCTGGCGGCCTACATCGCCA;AZM-3-R:TCTAGATCATATCTTCTGAAGAACGTCATAC;基因4:Azm-4-F:GGATCCACCATGGACGACAAGTCCTGCTACGTGG;Azm-4-R:TCTAGATCAGAGCTGCTGAAGAACATGACGC;基因5:Azm-5-F:GGATCCAACAATGGATAAGGCCTATGTCGCCG;Azm-5隱R:GGTACCCGTTCGCCGAAGATTAAATTTGCTAAAGCAC。PCR擴(kuò)增的條件是95°C1分鐘，60°C1分鐘，72°C2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)的產(chǎn)物被克隆到T載體(上海生工)中，并且進(jìn)行全片斷的測(cè)序。比較分別來(lái)自抗性(D001)敏感(N-SS)的P450基因序列發(fā)現(xiàn)，只有基因5在抗性和敏感品種中存在明顯差別，而其他4個(gè)基因沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差別?；?在D001中的序列為SEQIDNo:3,其mRNA序列為SEQIDNo:1。在N-SS中基因5增加了一個(gè)近lkb的插入片斷，這樣就造成該基因失去功能。實(shí)施例3、玉米P450基因轉(zhuǎn)水稻的轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建為了進(jìn)一步證明實(shí)施例2從抗性品種D001中獲得的玉米P450基因的功能，這些基因的表達(dá)框被構(gòu)建在植物轉(zhuǎn)化載體中，然后轉(zhuǎn)入水稻中表達(dá)以研究它們的功能。表達(dá)框中控制玉米P450基因表達(dá)的啟動(dòng)子是玉米泛素(Ubiqutin-1)啟動(dòng)子。它是通過(guò)PCR從玉米基因組中擴(kuò)增獲得的，所用的引物是ZmUbiF(GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC,(下橫線是HindIII位點(diǎn))禾BZmUbiRBamHI位點(diǎn))。玉米P450基因及其終止子直接從基因組中通過(guò)PCR獲得(實(shí)施例2)。5個(gè)轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300Rice-G6-zml/2/3/4/5是利用載體pCAMB1300-G6而構(gòu)建的。pCAMB1300-G6是一個(gè)利用抗草甘膦基因作為選擇基因的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化T-DNA載體(LinC,FangJ,XuX,ZhaoT,ChengJ，etal.2008PLoSONE3(3):el818.)。這個(gè)載體用ffindlII和Kpnl酶切后，與玉米泛素(Ubiqutin)啟動(dòng)子(HindIII和BamHI雙酶切獲得)禾口實(shí)施例2獲得的玉米中P450基因1(BamHl和Kpnl雙酶切獲得)同時(shí)連接，得到轉(zhuǎn)化T-DNA載體pCAMB1300-G6-zml。利用同樣的方法分別獲得了表達(dá)其他4個(gè)P450基因的T-DNA載體pCAMB1300-G6-zm2/3/4/5。實(shí)施例4、表達(dá)玉米P450基因的轉(zhuǎn)基因水稻的獲得轉(zhuǎn)基因植物的獲得方法是采用現(xiàn)有技術(shù)(盧雄斌龔祖塤1998生命科學(xué)10:125-131;劉凡等，2003分子植物育種1:108-115)。選取成熟飽滿的常規(guī)水稻種子去殼，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織作為轉(zhuǎn)化材料。取含目的基因的農(nóng)桿菌劃板，挑單菌落接種準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌。將待轉(zhuǎn)化的愈傷組織放入適當(dāng)濃度的農(nóng)桿菌液中(含乙酰丁香酮)，讓農(nóng)桿菌結(jié)合到愈傷組織表面，然后把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)23天。用無(wú)菌水沖洗轉(zhuǎn)化后的愈傷，轉(zhuǎn)移到含l到4mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，篩選培養(yǎng)兩個(gè)月(中間繼代一次)。把篩選后，生長(zhǎng)活力良好的愈傷轉(zhuǎn)移到預(yù)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)20天左右，然后將預(yù)分化好的愈傷組織移到分化培養(yǎng)基，14小時(shí)光照分化發(fā)芽。2—3周后，把抗性再生植株轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上壯苗生根，最后將再生植株洗去瓊脂移植于溫室，作為鑒定材料。T-DNA的插入及其基因的表達(dá)可以通過(guò)PCR和western印跡分析檢測(cè)?；蚪MDNA可以根據(jù)現(xiàn)有的方法從轉(zhuǎn)化再生植株和非轉(zhuǎn)化禾本科農(nóng)作物中提取。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因水稻抗除草劑能力的測(cè)定獲得的轉(zhuǎn)化了pCAMB1300Rice-G6-zm1/2/3/4/5再生水稻植株和沒(méi)有轉(zhuǎn)化的水稻植株在溫室中培養(yǎng)溶液中單株培養(yǎng)。每個(gè)轉(zhuǎn)化株系的再生植株分為3個(gè)處理處理1:噴20mM草甘膦(一次性有效成分為250克/畝)；處理2:—次性噴0.2克/L煙磺隆(一次性有效成分5克/畝)；處理3:噴水。處理后的10天記錄轉(zhuǎn)化株系的成活率。結(jié)果如下(表1)c表l、轉(zhuǎn)基因水稻抗除草劑能力的測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實(shí)施例6、轉(zhuǎn)抑制玉米P450基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建用RNA干擾的方法可以抑制玉米的抗除草劑P450基因5在玉米中的表達(dá)，從而獲得對(duì)除草劑敏感的轉(zhuǎn)基因玉米。構(gòu)建玉米P450基因5的RNAi片斷是根據(jù)SEQIDNo:3設(shè)計(jì)的。首先，從玉米P450基因5通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增獲得2個(gè)片斷。一個(gè)片斷是P450-5-l，PCR引物分別為P450-5F1:5，TACGCTCGAGAGCGAGTTGACGCGGATCTCC和P450-5R1:5，CATGGGATCCACTCACCCCGCACAGCGCCATGA:另一片斷是P450-5-2,PCR弓|物分另lj為P450-5F1和P450-5R2:5，CATGAGATCTGTCTCCGTCCCGGCGCCAAAC。PCR擴(kuò)增的條件為PCR擴(kuò)增的條件是95°C1分鐘，62°C1分鐘，72°C1分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)?；蚱蜳450-5-l代表SEQIDNo:3的637bp到930bp;基因片段P450-5-2代表SEQIDNo:3的637bp到1092bp。P450-5-l和P450-5-2連接后可以形成反向?qū)ΨQ的序列。這二個(gè)片斷分別被克隆到T載體(上海生工)中。P450-5-l片斷是用Xhol和BamHI從T載體中酶切獲得；P450-5-2用Xhol和BglII從T載體中酶切獲得。然后，P450-5-l和P450-5-2被連接到預(yù)先用Xhol酶切除去抗潮霉素基因(hyg)的pCambia1300載體，獲得載體pCamM300-P450-5i。這個(gè)載體包含有一個(gè)CaMV的35S啟動(dòng)子控制下的能夠干擾10抗除草劑玉米P450基因5表達(dá)的抑制表達(dá)框。載體pCamM300-P450-5i進(jìn)一步用EcoRI和HindIII酶切，然后用含有抗草甘膦基因G6的DNA片斷連接(G6基因見(jiàn)Lietal.，PloSONE:e1818)，獲得載體pCAMB1300-G6-P450-5i。實(shí)施例7、轉(zhuǎn)抑制玉米P450基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因玉米的獲得取授粉后810天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小為1.0L5mm)。將含有T-DNA載體pCambl300-P450-5i.的農(nóng)桿菌與未成熟胚共培育共培養(yǎng)23天(22°C)。轉(zhuǎn)移未成熟胚到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含200mg/L的Timentiii殺農(nóng)桿菌)，28'C暗培養(yǎng)1014天。將所有的愈傷轉(zhuǎn)到帶有2mM草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28'C暗培養(yǎng)23周。轉(zhuǎn)移所有的組織到新鮮草甘膦的篩選培養(yǎng)基上，28'C暗培養(yǎng)23周。然后，轉(zhuǎn)移所有篩選后成活的胚性組織到再生培養(yǎng)基上，28'C暗培養(yǎng)1014天，每皿一個(gè)株系。轉(zhuǎn)移胚性組織到新鮮的再生培養(yǎng)基上，26'C光照培養(yǎng)1014天。轉(zhuǎn)移所有發(fā)育完全的植株到生根培養(yǎng)基上，26'C光照培養(yǎng)直到根發(fā)育完全，然后移植到溫室中單株培養(yǎng)，開(kāi)花后用生產(chǎn)品種D001授粉。實(shí)施例8、抑制玉米p450基因的轉(zhuǎn)基因玉米的選擇性殺滅獲得的轉(zhuǎn)化pCambl300-P450-5i玉米的Tl植株和常規(guī)(沒(méi)有轉(zhuǎn)化)玉米植株在溫室中單株培養(yǎng)。每個(gè)轉(zhuǎn)化系的植株分為3個(gè)處理處理l:噴10mM草甘膦(一次性有效成分為250克/畝)；處理2:噴0.2克/升的煙磺隆(一次性有效成分5克/畝)；處理3:噴水。處理后10天記錄植株的成活率，結(jié)果如表2所示。表2、轉(zhuǎn)化玉米植株在不同的除草劑下的成活率草甘膦煙磺隆水pCambl300-P450-5i轉(zhuǎn)化株系(14個(gè))100%14%100%非轉(zhuǎn)化植株0%100%100%最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。11序列表SEQIDNO1:1ATGGATAAGGCCTATGTCGCCGCCCTCTCC61GTGGGCCGCGCCGCCGCCGGCGGCGGCAAG121GCCATCCCGTTCCTCGGCCACCTCCACCTC皿CGCCTCGCGGAGCGCCACGGCCCGGTGTTC241GTCGTGTCCTCGCCGGAGTGCGCCAGGGCG301AACCGCCCGCGCTTCGAGTCCATGCGCCTC361TCCAGCTACGGGCCCTACTGGCGCACCCTC421GCGCACCGCGTCGCCTGCATGTCCCCCGTC481CGGATGGCTCGCCTAGCCGCGGGCGGCGCC541GAGCTCTCCCTCGGCGTGCTCATGGAGACC601GCTTGCGCCGCCGACACTGACGTGTCGCCC661GAGATCMGCCGTACCTCGGCACGGCCAAC721TTCGACGTGTTCGGCGTGAGGAACAAGCTC781CTGCGGCGGCTCATCGACGCAGAGCGCCGG841AAGAGCATGATCGCCGTGCTGCTCTCTTTG901ACCATGATCATGGCGCTTTTGAAGGACTTG961ACGACAGAATGGGCCATGTCGCTTCTTCTG1021GCAGAGATCGACGCGGTGGTGGGCAACTCC1081CGCCTCGGCTACCTGCACTGCGTCATCAAC1141CTGCTGCTGCCGCACGAGTCGGCGGCGGAC1201GGGACGCTGCTGATCGTGAACGCGTACGCC1261CCGGGCAGCTTCTTGCCGGAGCGGTTCGAG1321CCGTTCGGGATGGGGCGGCGCAAGTGCCCC1381CTGGTGCTTGCCACGCTGCTCCAGTGCTTC1441GACATGACGGAGAGCGGCGGGCTGACCATGGTCGCCTTCCTCTTCTTGGTCCACTACCTCGGGAGGAAGCGGCTGCCACCGAGCCCTCTGGTCAAGACGCCGTTCCACTCGGCGCTGGGCTCCCTGCGCATGGGGTGCCGCCGCGCGGTGTGCTTCACGGAGCACGACATGAGCTTCGCCGTGTCCTTCGACGGCGCCATGCTCTCGGTGCGCCGCGTCGCCGCCGTGCAGCTCCTCTCCATCTGCGCCGAGGTGCGCGCCATGGTGCGCGCGCGCGTCCAGCTCAGGCGGCGCCTGTTCATCGCGCGGACCAAGACCTCCCGCTCCGAGGAGGCGAGCGAGTTGACGCGGATCTCCGAACTGTGGGACTACCTGCCGTTCCTGCGGTGGATGGCCGCCGTGAGGTGGAGGGACGCGTTCAGGATGGACGGTGACGGCGACGGCGAGAAGCAGAAGTCGGAGCCGGAGCTGTACACGGATTTTGGCGCCGGGACGGAGACCACATCGGTCAGCCACCCGGAGGCTCTGAAGAAGGCACAGCGCCGCCTGATCACCGCCGACGACGTGCCCGAGACCCTGCGCATGTACCCGGCCGCTCCGTGCAAGGTCGGCGGCTACGACGTGCCCCGCATCCACAGGGACCCCGCGGTGTGGGAGGACGACGGCAAGGCCGAGGGGCGGCTGCTGATGGGCGAGACGCTCGCGCTGCGGACCGTCGGGGACTGGGACACGGTTGATGGAGCTGAGGTTCCCCGGGCCGTCCCGTTGGAGGCCATGTGC1501AAGCCTCGTGCAGCTATGTGCGATGTTCTT1561GTTCTCGCTCTATAGGTGAAAGTTTCATAT1621GTCTGCGCTGAACTAAGTACATTATCATCT1681TATGTAAACAACTAGTACTCAATTAGTACT1741TTTAATCTTCGGCGAACGAGAAATTTGCTACGGGAGCTCTAATATTCTGGCACATCCTAGGTAGTTTCGTAGAAGTATGCATGTCTGATGAGTACAAAATATCGTACATATACCCGCATAAGTCGTTGTTTCCCAGCGTGCTTTAGCAAATSEQIDNO2:1MetAspLysAlaTyrValAlaAlaLeuSerValAlaPheLeuPheLeuValHisTyrLeu21ValGlyArgAlaAlaAlaGlyGlyGlyLysGlyArgLysArgLeuProProSerProLeu41AlalieProPhe!LeuGlyHisLeuHisLeuValLysThrProPheHisSerAlalieuGly61ArgLeuAlaGluArgHisGlyProValPheSerLeuArgMetGlyCysArgArgAlaVal81ValValSerSerProGluCysAlaArgAlaCysPheThrGluHisAspMetSerPheAla101AsnArgProArgPheGluSerMetArgLeuValSerPheAspGlyAlaMetLeuSerVal121SerSerTyrGlyProTyrTrpArgThrLeuArgArgValAlaAlaValGinLeuLeuSer141AlaHisArgValAlaCysMetSerProVallieCysAlaGluValArgAlaMetValArg161ArgMetAlaArgLeuAlaAlaGlyGlyAlaAlaArgValGinLeuArgArgArgLeuPhe181GluLeuSerLeuGlyValLeuMetGluThrlieAlaArgThrLysThrSerArgSerGlu201AlaCysAlaAlaAspThrAspValSerProGluAlaSerGluLeuThrArglieSerGlu221GlulieMetProTyrLeuGlyThrAlaAsnLeuTrpAspTyrLeuProPheLeuArgTrp241PheAspValPheGlyValArgAsnLysLeuMetAlaAlaValArgTrpArgAspAlaPhe261LeuArgArgLeulieAspAlaGluArgArgArgMetAspGlyAspGlyAspGlyGluLys281LysSerMetlieAlaValLeuLeuSerLeuGinLysSerGluProGluLeuTyrThrAsp301ThrMetlieMetAlaLeuLeuLysAspLeuPheGlyAlaGlyThrGluThrThrSerVal321ThrThrGluTrpAlaMetSerLeuLeuLeuSerHisProGluAlaLeuLysLysAlaGin341AlaGlulieAspAlaValValGlyAsnSerArgArgLeulieThrAlaAspAspValPro361ArgLeuGlyTyrLeuHisCysVallieAsnGluThrLeuArgMetTyrProAlaAlaPro381LeuLeuLeuProHisGluSerAlaAlaAspCysLysValGlyGlyTyrAspValProArg401GlyThrLeuLeulieValAsnAlaTyrAlalieHisArgAspProAlaValTrpGluAsp421ProGlySerPheLeuProGluArgPheGluAspGlyLysAlaGluGlyArgLeuLeuMet441ProPheGlyMetGlyArgArgLysCysProGlyGluThrLeuAlaLeuArgThrValGly461LeuVal!LeuAla481AspMetThrGlu501LysProArgAlaThr:Leu!LeuGinCysSerGlyGlyLeuThrAlaMetCysAspValPheAspTrpAspThrMetProArgAlaValLeuArgGlu!Leu*★*ValAspGlyAlaGluValProLeuGluAlaMetCysSEQIDNO3:ATGGATAAGGCCTATGTCGCCGCCCTCTCCGTCGCCTTCCTCTTCTTGGTCCACTACCTC611211812413013614214815416016617217818419019611021108111411201126113211381GTGGGCCGCGGCCATCCCGTCGCCTCGCGGGTCGTGTCCTAACCGCCCGCTCCAGCTACGGCGCACCGCGCGGATGGCTCGAGCTCTCCCGCTTGCGCCGGAGATCATGCTTCGACGTGTCTGCGGCGGCAAGAGCATGAACCATGATCATTTGCTAATATGATAAAATGCGGGACGGAGGGAGGCTCTGGATCACCGCCGCGCATGTACCGGCGGCTACGGACCCCGCGCCGCCGCCGGTCCTCGGCCAAGCGCCACGGCGCCGGAGTGGCTTCGAGTCGGCCCTACTGTCGCCTGCATGCCTAGCCGCTCGGCGTGCTCCGACACTGACGTACCTCGGTCGGCGTGAGTCATCGACGCTCGCCGTGCTTGGCGCTGTGAGGGAACATATGTGTCGTTTACCACATCGGAAGAAGGCACGACGACGTGCCCGGCCGCTCGACGTGCCCCGTGTGGGAGGCGGCGGCAAGCCTCCACCTCCCCGGTGTTCCGCCAGGGCGCATGCGCCTCGCGCACCCTCGTCCCCCGTCGGGCGGCGCCCATGGAGACCCGTGTCGCCCCACGGCCAACGAACAAGCTCAGAGCGCCGGGCTCTCTTTGCGGGGTGAGTTTCTATGATGTCTTCTTTTTTCACGACAGAAGGCAGAGATCCCGCCTCGGCGCTGCTGCTGCGGGACGCTACCCGGGCAGGGGAGGAAGCGTCAAGACGCTCCCTGCGCATGCTTCACGGGTGTCCTTCGCGCCGCGTCGATCTGCGCCGGCGCGCGTCCATCGCGCGGAGAGGCGAGCGCTGTGGGACTATGGCCGCCGAGGATGGACGCAGAAGTCGGGTTTCGGATACAAAAAAAAACCCCTGTGATATGGGCCATGCGACGCGGTGCTACCTGCACGCCGCACGAGGCTGATCGTGCTTCTTGCCGGGCTGCCACCCGTTCCACTCTGGGGTGCCGAGCACGACATACGGCGCCATCCGCCGTGCAAGGTGCGCGCAGCTCAGGCGCCAAGACCTCAGTTGACGCGACCTGCCGTTTGAGGTGGAGGTGACGGCGAAGCCGGAGCTGTACTTTCTTTCACTAAACGTTGAAGGACTTCGCTTCTTCGTGGGCAACTTGCGTCATCATCGGCGGCGGAACGCGTACGGAGCGGTTCGGAGCCCTCTGGGCGCTGGGCCCGCGCGGTGGAGCTTCGCCGCTCTCGGTGGCTCCTCTCCCATGGTGCGCGCGCCTGTTCCCGCTCCGAGGATCTCCGAACCTGCGGTGGGGACGCGTTCCGGCGAGAAGGTACACGGATTCGGGCAACGAAAGGAGTAGTGTTTGGCGCTGAGCCACCCCCCGCCGCCTACGAGACCCTACTGCAAGGTCCATCCACAGAGGACGGCAA1441GGCCGAGGGGCGGCTGCTGATGCCGTTCGGGATGGGGCGGCGCAAGTGCCCCGGCGAGAC1501GCTCGCGCTGCGGACCGTCGGGCTGGTGCTTGCCACGCTGCTCCAGTGCTTCGACTGGGA1561CACGGTTGATGGAGCTGAGGTTGACATGACGGAGAGCGGCGGGCTGACCATGCCCCGGGC1621CGTCCCGTTGGAGGCCATGTGCAAGCCTCGTGCAGCTATGTGCGATGTTCTTCGGGAGCT1681CTAATATTCTGGCACATCCTAGGTTCTCGCTCTATAGGTGAAAGTTTCATATGTAGTTTC1741GTAGAAGTATGCATGTCTGATGGTCTGCGCTGAACTAAGTACATTATCATCTAGTACAAA1801ATATCGTACATATACCCGCATATATGTAAACAACTAGTACTCAATTAGTACTAGTCGTTG1861TTTCCCAGCGTGCTTTAGCAAATTTAATCTTCGGCGAACGAGAAATTTGCTATTATGGAG1921ATCCTCACGTGTGGCTTCGACGTTTTAGAGGCGTAGGCAAGAGATTAGCTGATATAGAAA1981AGCAGGGAATAGGCCACTCGCTAAAACGAACAAGAACACTCTATTACTTGATGACCTCTT2041TGATTAAAATCATGGATACTCACGTCGTCT1權(quán)利要求1、一種抗除草劑基因，其特征是該基因的核苷酸序列為SEQIDNO1或者與SEQIDNO1有90％以上的相同性。2、如權(quán)利要求l所述抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)，其特征是所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNO:2或者與SEQIDNO:2有90%以上的相同性。3、一種DNA質(zhì)粒，其特征是含有權(quán)利要求l所述的基因并且與能夠在植物有功能的啟動(dòng)子連接。4、一種DNA質(zhì)粒，其特征是含有利用權(quán)利要求l所述的基因或者基因片斷構(gòu)建得到的反義RNA或RNAi的抑制表達(dá)框。5、一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其特征是包含權(quán)利要求l所述的核酸。6、一種轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其特征是權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)被反義RNA、RNAi或者其他方法抑制。7、如權(quán)利要求l所述抗除草劑基因的用途。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗除草劑基因的用途，其特征是制備對(duì)除草劑增加了抗性的轉(zhuǎn)基因植物。9、根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗除草劑基因的用途，其特征是獲得利用除草劑選擇性殺滅轉(zhuǎn)基因玉米的方法。10、根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的抗除草劑基因的用途，其特征是所述除草劑為乙酰乳酸合成酶抑制劑類除草劑、色素合成抑制類除草劑、原卟啉原氧化酶抑制劑類除草劑、光系統(tǒng)II抑制劑類除草劑或合成生長(zhǎng)素類除草劑。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種抗除草劑基因，該基因的核苷酸序列為SEQIDNO1或者與SEQIDNO1有90％以上的相同性。本發(fā)明還公開(kāi)了上述抗除草劑基因編碼的抗除草劑蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDNO2或者與SEQIDNO2有90％以上的相同性。本發(fā)明的基因可用于制備對(duì)除草劑增加了抗性的轉(zhuǎn)基因植物，或者獲得利用除草劑選擇性殺滅轉(zhuǎn)基因玉米的方法。文檔編號(hào)C12N15/53GK101451143SQ20081016413公開(kāi)日2009年6月10日申請(qǐng)日期2008年12月25日優(yōu)先權(quán)日2008年12月25日發(fā)明者徐曉麗,軍方,林朝陽(yáng),沈志成申請(qǐng)人:浙江大學(xué)