專利名稱：：通過(guò)使用閉合吸管玻璃化方法低溫貯藏人胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于玻璃化生物學(xué)細(xì)胞，特別是胚泡來(lái)源的干細(xì)胞(BS細(xì)胞)的改進(jìn)方法。所述方法對(duì)解凍后仍保持活性的細(xì)胞是非常溫和的。
背景技術(shù)：
：干細(xì)胞是具有自我更新和產(chǎn)生特化或分化細(xì)胞之獨(dú)特能力的細(xì)胞類型。盡管絕大部分體細(xì)胞，例如心臟細(xì)胞或皮膚細(xì)胞，負(fù)責(zé)行使特定功能，但干細(xì)胞在其接收到發(fā)育成特定細(xì)胞類型的信號(hào)之前功能未定。形成所述干細(xì)胞獨(dú)特性的是其增殖能力以及其發(fā)生分化的能力。多年來(lái)，研究人員致力于尋找使用干細(xì)胞替代受損或病變的細(xì)胞和組織的方法。目前，大部分研究集中于兩種類型的干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞來(lái)源于胚胎植入前的受精卵母細(xì)胞，即胚泡，而所述體細(xì)胞干細(xì)胞存在于成熟生物體中，例如骨髓、表皮和腸內(nèi)。根據(jù)許多歐洲和其它國(guó)家的國(guó)家法律，受精卵在植入子宮前即受精后10-14天并不被認(rèn)為是胚胎，因此當(dāng)如本發(fā)明應(yīng)用時(shí)，這類細(xì)胞在此處被稱為胚泡來(lái)源的干細(xì)胞或hBS細(xì)胞。多能性檢驗(yàn)已顯示盡管所述胚胎或胚泡來(lái)源的干細(xì)胞可產(chǎn)生生物體內(nèi)的所有細(xì)胞，包括生殖細(xì)胞，但體細(xì)胞千細(xì)胞具有更有限的衍生細(xì)胞類型集庫(kù)。1998年，研究人員第一次能從人受精卵母細(xì)胞中分離出胚胎干細(xì)胞并將其培養(yǎng)在培養(yǎng)基中，參見(jiàn)例如美國(guó)專利5843780和美國(guó)專利66200806。在干細(xì)胞
技術(shù)領(lǐng)域：
中越來(lái)越多的研究和進(jìn)展需要獲得適合于保存所述細(xì)胞和細(xì)胞系的方法。細(xì)胞可通過(guò)玻璃化或冷凍貯藏。由于細(xì)胞外冰的形成具有破壞作用，因此使用常規(guī)方法的低溫貯藏很難應(yīng)用于復(fù)雜和敏感的生物學(xué)材料。經(jīng)過(guò)玻璃化過(guò)程，含有所述細(xì)胞的樣品被快速冷卻至極低的溫度，水容物不結(jié)晶而形成的玻璃樣態(tài)。因此，玻璃化是在無(wú)冰晶形成的情況下快速冷凍液體介質(zhì)的方法。無(wú)定形玻璃在直接將例如含有細(xì)胞的吸管放入液氮中的快速冷凍過(guò)程中形成。所述玻璃保持液體的正常分布但以過(guò)冷卻的形式保存。所述玻璃避免了水晶并且所述細(xì)胞免受與冰晶形成相關(guān)的細(xì)胞損害。因此，將玻璃化定義為避免晶核形成和生長(zhǎng)的無(wú)定形玻璃樣態(tài)的固化。曾經(jīng)對(duì)人胚胎干細(xì)胞低溫貯藏進(jìn)行研究并且Reubinoff等人(HumanReproduction,2001,16，2187-2194)描述了通過(guò)使用開(kāi)口抽拉式吸管玻璃化方法進(jìn)行低溫貯藏這些細(xì)胞的方法。所述方法的缺點(diǎn)是其涉及到吸管的開(kāi)口端與液氮接觸，這可能會(huì)成為將要被玻璃化的生物材料的污染源。此外，由于抽拉吸管的大小，Reubinoff等人進(jìn)行玻璃化的體積約為ljd。用于避免與氮直接接觸的玻璃化方法已在Lopez-Bejar等人(Theriogenology，2002，58:1541-52)對(duì)兔胚胎和Chen等人(HumanReproduction,2001,16(11):2350-56)對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的應(yīng)用中得以描述。這些方法都使用了與已知的開(kāi)口抽拉吸管相同的抽拉方式并因此而擁有與Reubinoff等人使用的抽拉吸管具有相同大小的封閉抽拉吸管。因此，在這些方法中，各吸管中玻璃化的體積約都為1-2^1。慢速冷凍和快速解凍方法曾用來(lái)低溫貯藏細(xì)胞系。盡管這些方法適合用來(lái)低溫貯藏例如小鼠胚胎干細(xì)胞，但對(duì)于未分化的人胚胎干細(xì)胞的存活率似乎很低，而且絕大部分所述細(xì)胞分化或死亡。通常，用這種慢速冷凍方法玻璃化較大體積的細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致較低的恢復(fù)率(Reubinoff等人)。因此，仍就需要發(fā)展易于操作、涉及盡可能少的步驟而同時(shí)在所7化方法。特別地，需要發(fā)展用于細(xì)胞或細(xì)胞系(例如hBS或hBS細(xì)胞系)的較大體積玻璃化的有效方法。發(fā)明描述如上所述，有效的低溫貯藏方法是胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系產(chǎn)生和廣泛應(yīng)用、并在此之下建立人胚泡干細(xì)胞庫(kù)所必須的。有效的冷凍和解凍技術(shù)能夠有效地保存細(xì)胞和細(xì)胞系。為了一些目的，希望在每一根吸管中進(jìn)行大體積玻璃化。例如當(dāng)在給定的步驟(或應(yīng)用)中需要大量況。本發(fā)明涉及用于細(xì)胞玻璃化的方法，包括i)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第一種溶液(溶液A)中，ii)任選地在第一種溶液中溫育所述細(xì)胞，iii)將步驟i)或ii)中獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第二種溶液(溶液B)中，iv)任選地在第二種溶液中溫育所述細(xì)胞，v)將從步驟iii)或iv)中獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)具有允許可在其中包含至少20jil體積大小的閉合吸管，vi)封閉所述一個(gè)或多個(gè)閉合吸管，和vii)玻璃化一個(gè)或多個(gè)閉合吸管。上述方法的一個(gè)非常重要的特征是每一吸管中可被玻璃化的大體積。本發(fā)明涉及用于玻璃化閉合吸管中的細(xì)胞的方法，所述閉合吸管具有允許在其中容納從約20^1至約250^1，例如從約20^1至約225^1，從約25jil至約200^1，從約25nl至約175fil，從約25pl至約150ji1，從約30^1至約125^1，從約30^1至約100^1，從約35jil至約75^1，從約40^1至約50nl體積的大小。在本發(fā)明提供的實(shí)施例中使用的吸管長(zhǎng)度約為13cm，直徑約為2mm和約為O.lmm厚的非常薄的塑料管壁(閉合吸管，F(xiàn)rench迷你吸管，250^1，L，Aigle，IMVZA475。，133mm，SvenskMj61k)。然而，可以想象假設(shè)裝液氮的容器的大小允許液氮淹沒(méi)整個(gè)吸管的長(zhǎng)度，只要吸管的直徑和厚度幾乎與此處所使用的吸管一樣，那么使用更長(zhǎng)的吸管就可成功地玻璃化甚至更大的體積。另一個(gè)上述方法中非常重要的步驟是使用所謂的閉合吸管。在本上下文中，術(shù)語(yǔ)"閉合吸管"用來(lái)指在裝填位置具有能使例如在合適培養(yǎng)基中的生物學(xué)物質(zhì)(例如細(xì)胞或細(xì)胞系)裝入的開(kāi)口端的吸管，但在裝入后立即緊密封閉該末端以避免來(lái)自周?chē)幌胍募?xì)胞污染并且也避免不想要的來(lái)自細(xì)胞的周邊污染的風(fēng)險(xiǎn)。吸管兩端的氣密性封閉對(duì)防止樣品和環(huán)境的污染非常重要。來(lái)自CryoBioSystem稱為CBSSYMS的手工封閉單元是一種合適的系統(tǒng)。在所述吸管的一邊開(kāi)口而在另一邊裝有塞子是非常重要的。該塞子允許用注射器吸入空氣以使吸管充入液體，但一旦其與液體直接接觸則聚合化，在該端封閉毛細(xì)管。也可以使用封閉該端的其它合適方法。然后使用密封物(焊接、粘合等)封閉另一端。重要的是壁要薄并且直徑要小，以使吸管中的內(nèi)含物快速冷卻。吸管長(zhǎng)度并不是太關(guān)鍵，但為實(shí)際需要，其長(zhǎng)度最好是標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)度，以適合液氮灌中的標(biāo)準(zhǔn)支架。所述吸管由塑料制得，但也可由任何合適的材料包括玻璃(盡管其可能更容易斷裂)制得。重要的是所述材料要安全并且不吸收或釋放物質(zhì)，其是無(wú)孔、無(wú)毒和生物相容性的。在本發(fā)明應(yīng)用中，術(shù)語(yǔ)"低溫貯藏，，是指在極端低的溫度下保存生物學(xué)材料。在本發(fā)明上下文中所使用的術(shù)語(yǔ)"直接接觸，，或"直接暴露于，，是指如果生物學(xué)材料或所述材料所存在的培養(yǎng)基、溶液或材料的表面與冷凍材料接觸時(shí)，稱生物學(xué)材料"直接接觸"或"直接暴露"于例如冷凍材料。本發(fā)明上下文中所使用的術(shù)語(yǔ)"冷凍材料"，是指任何能夠造成生物學(xué)材料玻璃化的材料。因?yàn)闃悠凡恢苯优c冷凍材料接觸，理論上可使用任何足夠冷的冷凍介質(zhì)。合適的材料包括但不限于液態(tài)氣體例如液氮、液態(tài)丙烷、液氦、乙烷等。此處所使用的"生活力"是指在一段時(shí)間內(nèi)生物學(xué)材料能夠正常生9存、發(fā)育和增殖。根據(jù)本發(fā)明，將至少20fil體積的生物學(xué)材料(例如hBS細(xì)胞或hBS細(xì)胞系)置于閉合吸管中。然后將所述閉合吸管暴露于冷凍材料(合適地液氮)中。一旦暴露于冷凍材料，所述細(xì)胞開(kāi)始玻璃化，隨后可貯存一段時(shí)間并在以后的時(shí)期進(jìn)行解凍。解凍的生物學(xué)材料仍保留生活力。如上面所顯示，細(xì)胞與冷凍材料并沒(méi)有直接接觸或直接暴露。因此，避免了細(xì)胞(來(lái)自外源)污染以及細(xì)胞對(duì)環(huán)境的污染的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的生物學(xué)材料是活細(xì)胞或細(xì)胞系，特別是BS細(xì)胞、從BS細(xì)胞衍生的BS細(xì)胞或細(xì)胞。所述細(xì)胞可以處在任何發(fā)育階段。優(yōu)選地，所述細(xì)胞來(lái)源于動(dòng)物來(lái)源，包括哺乳動(dòng)物來(lái)源，包含但不限于人、非人靈長(zhǎng)類例如猴、實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物例如大鼠、小鼠和倉(cāng)鼠、農(nóng)業(yè)牲畜例如豬、羊、母牛、山羊和馬。在本發(fā)明具有特定目的的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是包括人BS細(xì)胞的人干細(xì)胞。用于根據(jù)本發(fā)明方法的合適細(xì)胞是BS細(xì)胞或BS細(xì)胞系，特別是hBS細(xì)胞或hBS細(xì)胞系。通過(guò)使用此處描述的方法可獲得所述細(xì)胞或細(xì)胞系o至少其中一種玻璃化溶液(第一種和第二種溶液)可含有一種或多種冷凍保護(hù)劑或冷凍保護(hù)劑混合物。當(dāng)然非毒性冷凍保護(hù)劑是優(yōu)選的。冷凍保護(hù)劑通過(guò)減少其它保留在非凍結(jié)水中的溶質(zhì)之摩爾比例協(xié)助將收縮減小到最低程度。其抑制水晶的形成，并因此降低水的凝固點(diǎn)。其也可以通過(guò)氫與束縛水結(jié)合防止蛋白變性。當(dāng)細(xì)胞冷卻時(shí)，溶劑水轉(zhuǎn)變成細(xì)胞外的冰，并且濃度不斷增加的細(xì)胞外非滲透電解質(zhì)或非電解質(zhì)會(huì)破壞細(xì)胞。當(dāng)用冷凍保護(hù)劑處理時(shí)，細(xì)胞不會(huì)在其達(dá)到低得多的溫度之前達(dá)到非處理細(xì)胞的鹽濃度。在如此低的溫度下化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行得十分緩慢并因此使得對(duì)細(xì)胞的破壞降到最低程度。通常最好使用冷凍保護(hù)劑組合因?yàn)椴煌N類之間可能存在不同。冷凍保護(hù)劑也可充當(dāng)滲透壓活性劑。合適的冷凍保護(hù)劑可選自1，2-亞乙基二醇、1，2-亞丙基二醇、二甲基亞砜、甘油、丙二醇、糖(包括蔗糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖)和甲基戊二醇。包含于第一種和/或第二種溶液中的單個(gè)試劑的濃度通常在5-50%v/v范圍內(nèi)，例如，從約5%到約40%v/v,例如從約5%到約25%v/v(第一種溶液)和從約5%到約30%v/v(第二種溶液)。通常，在第二種溶液中冷凍保護(hù)劑的總濃度(即按v/v、w/v或M計(jì)算)比在第一種溶液中要高。第一種和第二種溶液可包含一種或多種相同或不同的冷凍保護(hù)劑。第一種和第二種溶液中的一種或多種冷凍保護(hù)劑的濃度可以相同或不同，并且通常在第二種溶液中冷凍保護(hù)劑的總濃度高于第一種溶液中的濃度。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，所述冷凍保護(hù)劑是海藻糖。包含于第一種和/或第二種溶液中的海藻糖濃度通常在約0.02M至約lM的范圍內(nèi)，例如從約0.05M至約0.9M，從約0.1M至約0.8M，約0.2M至約0,7M，從約0.3M至約0，65M，從約0.4M至約0.6M,從約0.45M至約0.55M。通常，蔗糖用于類似的應(yīng)用中。海藻糖是種獨(dú)特的、天然產(chǎn)生的二糖，見(jiàn)于數(shù)百種植物和動(dòng)物中。海藻糖是重要的能量來(lái)源并且已顯示在冷凍期間是穩(wěn)定生物體的首要因素。已證明海藻糖可降低膜的相變溫度以使其甚至在干燥的條件下保持液晶狀態(tài)。不受限于任何理論，假設(shè)這樣防止了再水化過(guò)程中膜的滲漏，因而保存了細(xì)胞生活力。關(guān)于蛋白質(zhì)，已顯示海藻糖在細(xì)胞處于水合狀態(tài)時(shí)通過(guò)從所述蛋白質(zhì)表面將水逐出以抑制蛋白質(zhì)變性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述冷凍保護(hù)劑是蔗糖。第一種和/或第二種溶液所含的蔗糖濃度通常在從約0.02M至約1M的范圍內(nèi)，例如從約0.05M至約0.9M，從約0.1M至約0.8M,約0.2M至約0.7M，從約0.3M至約0.65M,從約0.4M至約0.6M，從約0.45M至約0.55M。而在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二種溶液中至少一種含有冷凍保護(hù)劑。第一和第二種溶液中至少一個(gè)可包含粘度調(diào)節(jié)劑。用于本文的合適的粘度調(diào)節(jié)劑可選自菲可(Ficoll)、珀可(Percoll)、透明質(zhì)酸、清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸、明膠和甘油。第一和第二種溶液可包含相同或不同的一種或多種粘度調(diào)節(jié)劑。在笫一和第二種溶液中的一種或多種粘度調(diào)節(jié)劑的濃度可相同或不同。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，所述粘度調(diào)節(jié)劑是菲可。第一和/或第二種溶液所包含的菲可濃度最高約為150mg/ml，例如最高約為100mg/ml，最高約為50mg/ml,最高約為25mg/ml，最高約為15mg/ml或最高約為10mg/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二種溶液中至少一種是水性溶液。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，包括上述方法中的步驟ii)。由于該步驟旨在促進(jìn)溶液平衡并確保冷凍保護(hù)劑充分?jǐn)U散，所以可能的時(shí)間長(zhǎng)度為10秒至20分鐘，但如果存在DMSO,不應(yīng)當(dāng)將細(xì)胞暴露于略有毒性的DMSO中太長(zhǎng)時(shí)間。通常在約37。C下進(jìn)行從5秒至約20分鐘之間的溫育，例如，從約10秒至約15分鐘，從約15秒至約10分鐘，從約20秒至約7.5分鐘，從約30秒至約5分鐘，從約40秒至約4分鐘，從約50秒至約3分鐘，從約30秒至約2分鐘，從約45秒至約1.5分鐘或l分鐘。在進(jìn)一步實(shí)施方案中，也包括了步驟iv)，并且通常在約37。C下進(jìn)行從5秒至約10分鐘之間的溫育，例如，從約10秒至約7.5分鐘，從約10秒至約5分鐘，從約15秒至約4分鐘，從約15秒至約3分鐘，從約15秒至約2分鐘，從約20秒至約1分鐘，從約5秒至約1分鐘，從約5秒至約30秒或從約10秒至約30秒。在特定的實(shí)施方案中，包括步驟iv)，并且在37。C下進(jìn)行溫育約30秒或更短時(shí)間。玻璃化方法對(duì)細(xì)胞非常有效并且溫和。通常，約50%或更多例如，約55°/?；蚋?，約60%或更多，約65%或更多，約70%或更多，約75%或更多，約80%或更多，約85%或更多，約90%或更多或約95%或更多的細(xì)胞在去玻璃化后和培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上后有生活力。此處描迷了合適的去玻璃化方法。在另一方面，本發(fā)明也涉及已經(jīng)歷本發(fā)明的方法的玻璃化的細(xì)12胞。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案中或另一方面，涉及去玻璃化的方法。去玻璃化包括viii)將一個(gè)或多個(gè)玻璃化的閉合吸管放入具有從約室溫至約40。C的環(huán)境中一段時(shí)間以使閉合吸管內(nèi)的內(nèi)容物解凍，ix)打開(kāi)一個(gè)或多個(gè)閉合吸管，x)使用第三種溶液(溶液C)使包含于一個(gè)或多個(gè)打開(kāi)的閉合吸管內(nèi)的細(xì)胞接受洗滌，xi)任選地將獲自步驟x)的經(jīng)洗滌的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第四種溶液(溶液D)中，和xii)任選地將細(xì)胞在第四種溶液中進(jìn)行溫育，xiii)任選地將來(lái)自xii)中第四種溶液中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移并接種在飼養(yǎng)細(xì)胞上，和xiv)任選地進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞。經(jīng)步驟x)后獲得的細(xì)胞即可用于任何想要的目的，并且可使用任何步驟以對(duì)細(xì)胞進(jìn)一步考察例如生活力。步驟viii)涉及細(xì)胞的解凍。此步驟僅僅是解凍吸管中的內(nèi)容物并且應(yīng)在對(duì)吸管的肉眼觀察中進(jìn)行，因此時(shí)間顯得并不重要。溫度不應(yīng)超過(guò)40。C但可在室溫至40°C之間。如果細(xì)胞在解凍后沒(méi)有快速地從水浴中上取出，當(dāng)解凍所述細(xì)胞時(shí)較高的溫度會(huì)誘發(fā)熱激作用。因此，作為強(qiáng)制步驟，所述方法也包括步驟xi),、xiii)和xiv);和進(jìn)一步包括步驟xii)。去玻璃化溶液可包含冷凍保護(hù)劑，例如具有滲透壓活性的冷凍保護(hù)劑(例如具有低毒性的滲透壓活性劑)，通常避免例如DMSO，并優(yōu)選地單獨(dú)地或組合地使用海藻糖和蔗糖。在該溶液中高濃度的二糖防止細(xì)胞破裂，否則細(xì)胞因突然與不含DMSO的溶液接觸會(huì)發(fā)生破裂。在細(xì)胞外所述二糖的存在可防止天然滲透壓起作用并給細(xì)胞足夠的時(shí)間排棄存在于細(xì)胞內(nèi)的DMSO(或類似物)，并緩慢地通過(guò)水置換之。因此，第三和/或第四種(如果相關(guān))溶液通常包含一種或多種冷凍保護(hù)劑。在特定的實(shí)施方案中，一種或多種冷凍保護(hù)劑選自甘油、海藻糖、蔗糖、1,2-亞乙基二醇、DMSO、丙二醇和/或其混合物，特別是甘油、海藻糖、蔗糖或其混合物適合使用。第三和/或第四種溶液中的冷凍保護(hù)劑濃度通常從約0.02M至1M例如從約0.05M至約0.9M，從約0.1M至約0.8M，從約0.1M至約0.7M，從約0.1M至約0.6M,從約0.15M至約0.5M，從約0.2M至約0.4M，并且如果相關(guān)，第三種溶液中冷凍保護(hù)劑的濃度高于第四種溶液中滲透活性試劑的濃度。通常如果相關(guān)，第三種溶液中冷凍保護(hù)劑的濃度高于第四種溶液中的冷凍保護(hù)劑濃度。下面給出了本發(fā)明方法的總述。將人胚泡來(lái)源的干(hBS)細(xì)胞集落切成小塊(0.1-0.4mmx0.1-0.4mm)。在40-50pl體積中高達(dá)20(優(yōu)選地約10個(gè))個(gè)細(xì)胞小塊可被冷凍在閉合吸管中。閉合吸管在一端具有塞子而在另一端開(kāi)口。在所述細(xì)胞小塊被吸入吸管內(nèi)以進(jìn)行冷凍后，用cryo-PBS封閉具有塞子(閥)的一端而在開(kāi)口的一端用粘結(jié)劑(焊接)和加熱封閉裝置(Demtek，A/S)進(jìn)行密封。在冷凍較大量的細(xì)胞前進(jìn)行一輪冷凍和解凍檢驗(yàn)。解凍后，將所述細(xì)胞小片接種在具有小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞(MEF)的培養(yǎng)皿上。將人BS細(xì)胞培養(yǎng)至一次傳代后進(jìn)行評(píng)估。所有提到的百分比都是v/v。下列描述對(duì)合適的方法、溶液、時(shí)間段等給出了說(shuō)明。但是，基于此處的總體描述和指南，本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明范圍內(nèi)可對(duì)不同的因素進(jìn)行改變。玻璃化方法一總述制劑于Cryo-PBS(獲自VitrolifeAB(Gothenburg,瑞典))的海藻糖構(gòu)成的母液。2.溶液A:在Cryo-PBS中制備100/0的1,2-亞乙基二醇并進(jìn)4亍無(wú)菌過(guò)濾。加入無(wú)菌DMSO至終濃度為10%。3.溶液B:在Cryo-PBS中制備含有0.3M海藻糖和20%1,2-亞乙基二醇的A溶液并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。加入無(wú)菌DMSO至終濃度為20%。4.將1ml溶液A和溶液B分別加入四孔板(Nunclon,VWRInternational)中兩個(gè)分開(kāi)的小孔中。將板置于37。C下。5.以使用滅菌的拉制的玻璃毛細(xì)管(WorldPrecisionInstruments)(或來(lái)自Swemed的干細(xì)胞切割工具)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行切割，方法是以進(jìn)行傳代的相同方法切割所選展示恰當(dāng)形態(tài)學(xué)的人胚泡來(lái)源的干細(xì)胞集落。來(lái)自Swemed的切割工具是具有25度傾角和200或300微米的腔，設(shè)計(jì)用來(lái)切割、操作和轉(zhuǎn)移hBS集落或部分hBS集落的無(wú)菌的鋒利的玻璃毛細(xì)管。其由SwemedLabInternationalAB，Bilidal，瑞典生產(chǎn)。6.用hBS編號(hào)來(lái)標(biāo)記吸管(閉合吸管，F(xiàn)renchmini-straws,工作體積為250ul，L，Aigle，IMVZA475，133mm，SvenskMjolk)的必需編號(hào)并用冷凍編號(hào)(即細(xì)胞系/日期/簽名)標(biāo)記可見(jiàn)管(visiotubes)。冷凍流程1.使用玻璃毛細(xì)管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur，VWRInternational)將要冷凍在吸管中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至溶液A中。2.將所述細(xì)胞在溶液A中溫育1分鐘。3.然后將所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一滴(25pl)溶液B中，并在25秒內(nèi)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一滴新鮮溶液B(25^1)中。4.將所述細(xì)胞在溶液B中溫育25秒(最長(zhǎng))。用于第3至第4步驟的優(yōu)選時(shí)間應(yīng)當(dāng)盡可能短。155.將lml的注射器(一次性使用的結(jié)核菌素注射器，CodanTriplusAB)連接到l-1.5cm硅氧烷管(已滅菌的)上，接著將硅樹(shù)脂管連接到吸管上具有綿塞的一端(封塞端)。硅氧烷管在吸管和注射器之間起著密封作用。首先，將約2-3cm體積的cryo-PBS吸入至吸管中。然后吸入約l-2cm的空氣(參見(jiàn)圖1)。6.在立體視顯微鏡下從溶液B中將2cm柱中的細(xì)胞吸入至吸管中。7.吸入l-2cm空氣，接著吸入0.5-lcmcryo-PBS(在該端充當(dāng)額外的塞子)。8.用注射器吸取吸管中的內(nèi)容物以使cryo-PBS與綿塞接觸從而使所述塞子膨脹。9.使用一對(duì)鑷子將注射器從吸管上取走，并接著用熱密封裝置對(duì)吸管進(jìn)行焊接封閉。10.將吸管放入可^L管(visiotube)中，然后再放入裝有液氮的罐中進(jìn)行長(zhǎng)期貯存。去玻璃化流程一總體流程制劑1.制備由0.2M溶于cryo-PBS的海藻糖構(gòu)成的母液。2.溶液C:將0.2M溶于cryo-PBS的海藻糖進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。3.溶液D:制備0.1M溶于cryo-PBS的海藻糖并進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。4.將lml溶液C、溶液D和hBS培養(yǎng)基(參見(jiàn)下面)分別放入4孔板(Nunclon，VWRInternational)的單個(gè)小孔中并將板置于37。C下溫育。[所述hBS培養(yǎng)基包含補(bǔ)充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基，所述成分各自的終濃度為青霉素100單位/ml，非必需氨基酸O.lmM,L-谷氨酰胺2mM，卩-石克基乙醇100jiM，人重組bFGF4ng/ml(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)?？焖?gòu)腄MSO中洗滌解凍的細(xì)胞是非常重要的，所述DMSO用于玻璃化溶液中。較少毒性的海藻糖的存在有助于從玻璃化溶液到用于接種細(xì)胞的培養(yǎng)基之相對(duì)緩慢的逐步改變。所述濃度也可按不同功效進(jìn)行改變(5-50%v/v,w/w或w/v)。也有可能使用其它具有低毒性的冷凍保護(hù)劑。解凍1.從含有液氮的貯存灌中取出含有玻璃化的人BS細(xì)胞的閉合吸管并置于含有液氮的小瓶中。2.將所述封閉的吸管在室溫下于空氣中放置10秒，然后放入40。C的水浴鍋中約2秒。用滅過(guò)菌的"通用抹布"(allduk)擦干吸管。3.使用滅過(guò)菌的剪刀將只有封塞物封閉的吸管的封塞端剪開(kāi)。使用一塊硅管作為封塞物將所述吸管連接到注射器上。然后將吸管在粘結(jié)(焊接)處剪開(kāi)。用注射器內(nèi)的空氣將hBS細(xì)胞推入溶液C中。要在相同小孔中洗滌的細(xì)胞量應(yīng)當(dāng)不超過(guò)單根吸管所含的量。4.將所述hBS細(xì)胞集落在溶液C中溫育1分鐘。通常從約1分鐘至約20分鐘。5.在立體顯微鏡下，使用玻璃毛細(xì)胞管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur,VWRInternational)將hBS細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移至溶液D中。6.將hBS細(xì)胞集落在溶液D中溫育5分鐘。通常從約5分鐘至約30分鐘。7.在立體顯微鏡下使用玻璃毛細(xì)胞管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur，VWRInternational)將hBS細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移至hBS培養(yǎng)基上。8.使用玻璃毛細(xì)胞管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur，VWRInternational)在數(shù)秒(>5秒)內(nèi)將所迷集落從hBS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移并接種在培養(yǎng)皿中小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞(MEF)上面。9.將所述培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中進(jìn)一步培養(yǎng)。圖表圖1:在玻璃化和去玻璃化后解凍恢復(fù)人BS細(xì)胞系SAOOl。圖2:在玻璃化和去玻璃化后解凍恢復(fù)人BS細(xì)胞系SA002。圖3:在玻璃化和去玻璃化后解凍恢復(fù)人BS細(xì)胞系SA034。圖4(A)-(C):在即將玻璃化前培養(yǎng)在小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上的人BS細(xì)胞系SAOOl的典型形態(tài)學(xué)。圖5(A)-(C):在去玻璃化后第一次傳代時(shí)培養(yǎng)在小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上的人BS細(xì)胞系SAOOl的典型形態(tài)學(xué)。圖6:在去玻璃化后第18代(A)、第23代(B)、第29代(C)和第35代(D)時(shí)培養(yǎng)在小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上的人BS細(xì)胞系SAOOl的典型形態(tài)學(xué)。圖7:(A)人BS細(xì)胞集落[pl9，(B)SSEA畫(huà)l[p31，(C)SSEA-3[p31，(D)SSEA畫(huà)4[p31，(E)TRA-l畫(huà)60[p31，(F)TRA誦l-81[p31，(G)Oct-4[p311，(H)ALP[p31。圖8:玻璃化后細(xì)胞系SAOOl的核型。圖9:去玻璃化的人BS細(xì)胞(SA001)在體外的分化，第29代。(A)卩-IH-微管蛋白，(B)結(jié)蛋白，(C)a-甲胎蛋白，(D)HNF-3(3。圖10:第19代人BS細(xì)胞(SA001)在體內(nèi)的分化。(A)內(nèi)胚層(分泌上皮)，(B)中胚層(軟骨)，(C)外胚層(神經(jīng)外胚層)。圖11:帶有制備用于冷凍的閉合吸管的注射器。本發(fā)明在下面的實(shí)施例中將得到進(jìn)一步說(shuō)明，所述實(shí)施例并不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例1:玻璃化hBS細(xì)胞制備溶液A和B(溶液A:無(wú)菌過(guò)濾的10%的1，2-亞乙基二醇、10%的DMSO的cryo-PBS溶液；溶液B:無(wú)菌過(guò)濾的0.3M的海藻糖、10%的1，2-亞乙基二醇、10%的DMSO的Cryo-PBS溶液)。18以與<吏用干細(xì)胞切割工具(SwemedLabsInternational,Billdal，Sweden)切割人胚泡來(lái)源的干細(xì)胞以進(jìn)行常規(guī)傳代的相同方法切割所選展示恰當(dāng)形態(tài)學(xué)的人胚泡來(lái)源的干細(xì)胞集落。所述細(xì)胞小塊大小應(yīng)當(dāng)為約0.1至0.4mmX0.1-0.4mm。首先將所述細(xì)胞小塊在預(yù)熱(37°C)的500^1溶液A中溫育1分鐘，然后轉(zhuǎn)移至25nl溶液B中并溫育30秒，然后再次轉(zhuǎn)移至新鮮的溶液B液滴中并溫育30秒。所述體積約是40-50^1。將約IO個(gè)細(xì)胞小塊吸入至制備用于玻璃化的吸管中，然后將吸管用粘合劑封閉。將吸管插入液氮中。實(shí)施例2解凍玻璃化的人BS細(xì)胞制備兩種溶液C和D(溶液C:無(wú)菌過(guò)濾的0.2M海藻糖的Cryo-PBS溶液；溶液D:無(wú)菌過(guò)濾的0.1M海藻糖的Cryo-PBS溶液)。將溶液C和D以及hBS培養(yǎng)基于37。C預(yù)熱。從液氮罐中取出含有玻璃化的hBS細(xì)胞(約IO個(gè)細(xì)胞小塊)的閉合吸管。將吸管在室溫下保持10秒，然后迅速地在40。C水浴鍋中(數(shù)秒內(nèi))解凍。使用一把滅過(guò)菌的剪刀將吸管的封塞端剪開(kāi)并使用注射器將內(nèi)容物從吸管推入至溶液C中。將所述hBS細(xì)胞在500pi溶液C中溫育1分鐘然后轉(zhuǎn)入500nl溶液D中并溫育5分鐘。在立體顯微鏡下將hBS細(xì)胞小塊在hBS培養(yǎng)基中快速洗滌，然后接種在培養(yǎng)皿中hBS培養(yǎng)基上的小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上面。接著將所述細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)(于37。C溫育)，對(duì)已建立的新集落的數(shù)目進(jìn)行計(jì)數(shù)并進(jìn)行傳代以檢驗(yàn)玻璃化后hBS細(xì)胞的生活力。經(jīng)歷該玻璃化和解凍步驟后恢復(fù)的有生活力的細(xì)胞通常在70-100%的范圍內(nèi)。實(shí)施例3使用閉合吸管玻璃化和解凍人BS細(xì)胞按照實(shí)施例1和2中描述的方法對(duì)人BS細(xì)胞(細(xì)胞系SA002,SA121和SA181)進(jìn)行玻璃化和解凍。在接種在培養(yǎng)皿中小鼠胚胎飼19養(yǎng)細(xì)胞上48小時(shí)后對(duì)hBS細(xì)胞集落進(jìn)行評(píng)估和計(jì)數(shù)。因?yàn)樽畛醪ＡЩ膆BS細(xì)胞小塊中的每一片都可產(chǎn)生一個(gè)集落，所以以有生活力的解凍后的集落(展示合適的hBS細(xì)胞形態(tài)學(xué)的)數(shù)目與最初玻璃化的hBS細(xì)胞小塊數(shù)目之間的比例來(lái)計(jì)算解凍恢復(fù)率。制備3根吸管并評(píng)估每個(gè)細(xì)胞系，并且將各單個(gè)吸管的結(jié)果顯示于下面，結(jié)果顯示恢復(fù)率在40%和100%之間。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例4閉合吸管和開(kāi)口抽拉式吸管之間的直接比較除了同時(shí)使用開(kāi)口抽拉式吸管作為閉合吸管對(duì)照外，其余均按照于實(shí)施例1和2中描述的方法對(duì)人BS細(xì)胞(細(xì)胞系A(chǔ)S034)進(jìn)行玻璃化和解凍。很明顯，在各開(kāi)口抽拉式吸管中只有約4個(gè)BS細(xì)胞小塊可被玻璃化。接種在培養(yǎng)皿中小鼠胚胎銅養(yǎng)細(xì)胞上面后48小時(shí)對(duì)hBS細(xì)胞集落進(jìn)行評(píng)估和計(jì)數(shù)。以有生活力的解凍后的集落(表現(xiàn)合適的hBS細(xì)胞形態(tài)學(xué)的)數(shù)目與最初玻璃化的hBS細(xì)胞小塊數(shù)目之間的比例來(lái)計(jì)算解凍恢復(fù)率。對(duì)每個(gè)細(xì)胞系都制備了三根吸管并進(jìn)行了評(píng)估，下面顯示各單個(gè)吸管的結(jié)果并且顯示從各閉合吸管獲得更多有生活力的(絕對(duì)數(shù)目)同時(shí)保持可接受的恢復(fù)率之細(xì)胞的成果。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實(shí)施例5在玻璃化培養(yǎng)基中使用海藻糖和蔗糖之間的比較按照實(shí)施例l和2中描述的方法，或者除了在玻璃化和去玻璃化培養(yǎng)基中的海藻糖用與所用海藻糖濃度相同的蔗糖替代外，其余均按照實(shí)施例1和2所描述的方法，玻璃化和解凍人BS細(xì)胞(細(xì)胞系SA121)。在接種到培養(yǎng)皿中小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上48小時(shí)后，對(duì)hBS細(xì)胞集落進(jìn)行評(píng)估和計(jì)數(shù)。以有生活力的解凍后的集落(表現(xiàn)合適的hBS細(xì)胞形態(tài)學(xué)的)數(shù)目與最初玻璃化的hBS細(xì)胞小塊數(shù)目之間的比例來(lái)計(jì)算解凍恢復(fù)率。對(duì)每個(gè)細(xì)胞系都制備了三根吸管并進(jìn)行了評(píng)估，下面顯示了各單個(gè)吸管的結(jié)果并且顯示在這種情況下在使用海藻糖和蔗糖之間似乎沒(méi)有顯著差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實(shí)施例6在玻璃化培養(yǎng)基中使用菲可進(jìn)行玻璃化和解凍人BS細(xì)胞除了在玻璃化培養(yǎng)基中使用菲可(0mg/ml、10mg/ml和100mg/ml)夕卜，其余均按照實(shí)施例1和2中描述的方法玻璃化和解凍人BS細(xì)胞(細(xì)胞系SA121)。在接種到培養(yǎng)皿中小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上48小時(shí)后，對(duì)hBS細(xì)胞集落進(jìn)行評(píng)估和計(jì)數(shù)。以有生活力的解凍后的集落(表現(xiàn)合適的hBS細(xì)胞形態(tài)學(xué)的)數(shù)目與最初玻璃化的hBS細(xì)胞小塊數(shù)目之間的比例來(lái)計(jì)算解凍恢復(fù)率。對(duì)每個(gè)細(xì)胞系都制備了三根吸管并進(jìn)行了評(píng)估，并且將各單根吸管的結(jié)果顯示于下面。閉合吸管人BS細(xì)胞系SA121菲可濃度0mg/ml10mg/ml100mg/ml解凍恢復(fù)5/57/106/109/96/103/106/103/10一實(shí)施例7在玻璃化培養(yǎng)基中使用不同濃度海藻糖之間的比較除了在第二種玻璃化溶液(溶液B)中使用兩種不同濃度(0.3M和0.5M)海藻糖外，其余均按照實(shí)施例l和2中描述的方法玻璃化和解凍人BS細(xì)胞(細(xì)胞系SA121)。當(dāng)溶液B中使用0.3M海藻糖時(shí)，溶液C含有0.2M海藻糖并且溶液D含有0.1M海藻糖。當(dāng)溶液B中使用0.5M海藻糖時(shí)，溶液C含有0.4M海藻糖并且溶液D含有0,2M海藻糖。在接種到培養(yǎng)皿中小鼠胚胎祠養(yǎng)細(xì)胞上48小時(shí)后，對(duì)hBS細(xì)胞集落進(jìn)行評(píng)估和計(jì)數(shù)。以可存活的解凍后的集落(表現(xiàn)合適的hBS細(xì)胞形態(tài)學(xué))數(shù)目與最初玻璃化的hBS細(xì)胞小塊數(shù)目之間的比例來(lái)計(jì)算解凍恢復(fù)率。進(jìn)行兩個(gè)分別的使用兩種不同人BS細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)。對(duì)每個(gè)細(xì)胞系都制備了三根吸管并進(jìn)行了評(píng)估，并且各單根吸管的結(jié)果如下顯示。所述結(jié)果顯示盡管觀察到的兩種海藻糖狀況表現(xiàn)都良好，但溶液B中0.5M的海藻糖似乎比溶液B中0.3M的海藻糖的表現(xiàn)更好。閉合吸管人BS細(xì)胞系SA121和SA002海藻糖0.3M0.5M解凍恢復(fù)(SA121)6/108/105/109/106/108/8解凍恢復(fù)(SA002)5/87/86/88/87/75/722實(shí)施例8使用閉合吸管更廣泛地評(píng)估玻璃化和去玻璃化方法為了評(píng)估玻璃化方法的質(zhì)量，在三種不同的場(chǎng)合使用三種不同的人BS細(xì)胞系(SAOOl、SA002和AS034)對(duì)大量人BS細(xì)胞進(jìn)行玻璃化(如上述實(shí)施例1中所描述的)。在各場(chǎng)合下各細(xì)胞系有>100支吸管被玻璃化。從這些批量的吸管中隨機(jī)地選擇8至10支進(jìn)行去玻璃化(如上述實(shí)施例2中所描述的)并接種在分開(kāi)的培養(yǎng)皿中的小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上面。在各培養(yǎng)皿中確定接種的hBS細(xì)胞團(tuán)以及附著、增殖以及表現(xiàn)合適形態(tài)學(xué)的hBS細(xì)胞團(tuán)的數(shù)目。所述結(jié)果顯示于圖1、2和3中并且顯示每支吸管產(chǎn)生有生活力的hBS細(xì)胞集落，按照標(biāo)準(zhǔn)方法將所述hBS細(xì)胞集落進(jìn)行傳代并描述其特征。實(shí)施例9玻璃化和解凍前后人BS細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)圖4顯示玻璃化前人BS集落(細(xì)胞系SA001)的典型形態(tài)學(xué)。去玻璃化和接種后，有生活力的集落增殖并表現(xiàn)未分化的人BS細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征(圖5)。隨后，按照標(biāo)準(zhǔn)方法將這些細(xì)胞進(jìn)行繁殖和傳代并且將人BS細(xì)胞集落的代表性說(shuō)明顯示于圖6。在人BS細(xì)胞系SA002和AS034中獲得了類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。實(shí)施例10在閉合吸管中接受玻璃化和去玻璃化的人BS細(xì)胞的后繼特征為了驗(yàn)證人BS細(xì)胞在玻璃化和去玻璃化過(guò)程后完全恢復(fù)和展現(xiàn)合適的特征，對(duì)hBS細(xì)胞進(jìn)行廣泛的特征描述。這包括表面抗原表達(dá)分析、核型分析和體外以及體內(nèi)的多能檢驗(yàn)。通過(guò)使用人BS細(xì)胞系SA001獲得下面的結(jié)果，并且通過(guò)4吏用人BS細(xì)胞系SA002和AS034也可獲得類似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。^:為VA#/^5"細(xì)^^逸歡必夢(mèng)染悉23將培養(yǎng)在小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞(MEF)上的去玻璃化的人BS細(xì)胞(細(xì)胞系SA001)在PFA中進(jìn)行固定，接著用TritonX-100進(jìn)行穿孔。在連續(xù)的洗滌和封閉步驟后，將所述細(xì)胞用一抗(按說(shuō)明)進(jìn)行溫育。隨后用綴合的二抗進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)DAPI染色顯示核。按照廠商(SigmaDiagnostics,Stockholm,Sweden)提供的說(shuō)明書(shū)使用商業(yè)購(gòu)得的試劑盒確定堿性磷酸酶(ALP)的活性。所進(jìn)行的各分析中的傳代編號(hào)標(biāo)示于圖7中的圖例說(shuō)明括號(hào)中。如圖7所表明的，所述結(jié)果顯示人BS細(xì)胞對(duì)SSEA-3、SSEA畫(huà)4、TRA-l-60、TRA-1-81、Oct-4和ALP顯示陽(yáng)性染色并且與未分化的人BS細(xì)胞相符，其對(duì)SSEA-1呈陰性。將進(jìn)行核型分析的培養(yǎng)在MEF上的去玻璃化的人BS細(xì)胞(SAOOl系)在花萼海綿誘癌素A存在的情況下進(jìn)行溫育，然后用細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌。通過(guò)離心收集細(xì)胞并使用乙醇和冰醋酸進(jìn)行固定。使用胰蛋白酶-姬姆薩染色顯示染色體。如圖8中所顯示的，所迷結(jié)果常。、、，，乂；端在雜活扭為了分析端粒酶活性，按照廠商的說(shuō)明書(shū)使用TeloTAGGG端粒酶PCRELISAPLus試劑盒(Roche,Basel,Switzerland)。所述測(cè)定使用端粒酶的內(nèi)部活性，通過(guò)PCR擴(kuò)增所述產(chǎn)物并用酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定(ELISA)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。在玻璃化后對(duì)人BS細(xì)胞系SAOOl進(jìn)行分析并培養(yǎng)在小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上，并且發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出高端粒酶活性。HBS細(xì)胞中的高端粒酶活性與其在培養(yǎng)中無(wú)限分裂能力有關(guān)。#粉必為考察去玻璃化的人BS細(xì)胞的多能性，用干細(xì)胞切割工具(SwemedLab，Gteborg，Sweden)將來(lái)自細(xì)胞系SAOOl的未分化集落轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)物中以允許胚泡體(Eb)形成。接著，將Eb涂覆在組織培養(yǎng)皿中，并且同時(shí)使用抗p微管蛋白(外胚層)、結(jié)蛋白(中胚層)，a曱胎蛋白和HNF-3P(內(nèi)胚層)的抗體對(duì)分化的細(xì)胞進(jìn)行免疫組織化學(xué)估測(cè)。同時(shí)也觀察到組裝成心肌細(xì)胞的收縮細(xì)胞(未顯示)?？傮w說(shuō)來(lái)，這些結(jié)果表明經(jīng)受玻璃化和去玻璃化過(guò)程的人BS細(xì)胞保持著其在體外分化成代表三種不同胚層的細(xì)胞的潛能(即其保持多能性)。所述結(jié)果示于圖9。為了考察去玻璃化人BS細(xì)胞的多能性，將未分化的細(xì)胞(細(xì)胞系SA001)通過(guò)手術(shù)置于具有嚴(yán)重免疫缺陷(SCID)小鼠的腎囊下。8周后殺死小鼠切除肺瘤并在PFA中固定。為了確定來(lái)自所有三個(gè)胚層的組織的存在，對(duì)蘇木精-依紅染色的石蠟切片進(jìn)行組織學(xué)估測(cè)。如圖10中所表明的，經(jīng)過(guò)玻璃化和去玻璃化過(guò)程的人BS細(xì)胞在體內(nèi)保持著其分化成代表所述三個(gè)不同胚層的細(xì)胞的潛能(即，其保持多能性)。-用于建立可用于玻璃化方法的細(xì)胞的一般方法用于建立適合于用于本發(fā)明方法的人hBS細(xì)胞的方法。在2003年7月10日以WO03/055992(相同的申請(qǐng)人)公開(kāi)的PCT申請(qǐng)中，描述了用于建立hBS細(xì)胞的合適方法。在本發(fā)明的一個(gè)方面，通過(guò)WO03/055992中要求保護(hù)的方法獲得所使用的細(xì)胞(在此引用作為參考)。用于建立來(lái)自受精卵母細(xì)胞的多能性人胚泡來(lái)源的千細(xì)胞或細(xì)胞系的方法包括步驟i)任選地使用受精的卵母細(xì)胞(具有1或2級(jí))以獲得胚泡(任選地具有A或B級(jí))，ii)用伺養(yǎng)細(xì)胞與胚泡共培養(yǎng)以建立一個(gè)或多個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞集落，iii)通過(guò)機(jī)械解剖分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，iv)將內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)以獲得胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系。V)任選地，繁殖所述胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系。使用作為該方法的起始材料的受精卵母細(xì)胞。受精卵母細(xì)胞的質(zhì)量對(duì)所獲得的胚泡的質(zhì)量非常重要。所述方法的步驟i)中的人胚泡細(xì)胞可來(lái)源于冷凍的或新鮮的體外受精的人卵母細(xì)胞。下面描述了用于選擇用于WO03/055992的方法之合適卵母細(xì)胞的方法。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的重要成功標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)卵母細(xì)胞的恰當(dāng)選擇。因此，如果只使用3級(jí)卵母細(xì)胞，獲得滿足一般要求(描述于下面)的hBS細(xì)胞系的概率就很低。捐贈(zèng)的新鮮受精卵母細(xì)胞在第0天將所述卵'母細(xì)胞吸入Asp-100(Vitrolife)，并在第1天于IVF-50(Vitrolife)中受精。根據(jù)第3天的形態(tài)學(xué)和細(xì)胞分裂評(píng)估所述受精卵母細(xì)胞。下列等級(jí)用于受精卵母細(xì)胞的評(píng)估l級(jí)受精卵母細(xì)胞平滑的卵裂球，無(wú)碎片2級(jí)受精卵母細(xì)胞<20%碎片3級(jí)受精卵母細(xì)胞>20%碎片在第3天評(píng)估后，將1級(jí)和2級(jí)的受精卵母細(xì)胞進(jìn)行移植或冷凍貯藏。將3級(jí)受精卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至ICM-2(Vitrolife)。將所述受精卵母細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)3-5天(即受精后5-7天)。根據(jù)下面的等級(jí)評(píng)估所述胚泡A級(jí)胚泡在第6天具有明顯的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)擴(kuò)增B級(jí)胚泡無(wú)擴(kuò)增但類似A級(jí)C級(jí)胚泡無(wú)可見(jiàn)ICM捐贈(zèng)的冷凍受精卵母細(xì)胞在第2天(受精后)用Freeze-試劑盒(Vitrolife)將所述受精卵在四細(xì)胞期進(jìn)行冷凍。將冷凍的受精卵母細(xì)胞貯存在液氮中。在5年期限界滿之前從捐獻(xiàn)者獲得知情同意。使用Thaw試劑盒(Vitrolife)解凍所述受精卵母細(xì)胞，并且從第2天起進(jìn)行上述方法。如上面所述，新鮮受精卵母細(xì)胞來(lái)自3級(jí)質(zhì)量，而冷凍受精卵母細(xì)胞來(lái)自l級(jí)和2級(jí)。根據(jù)通過(guò)已建立的方法荻得的數(shù)據(jù)，發(fā)育成胚泡的新鮮受精卵母細(xì)胞的百分比是19%，而50%的冷凍受精卵母細(xì)胞發(fā)育成胚泡。這意味著可能由于受精卵母細(xì)胞質(zhì)量更高的原因，所述冷凍受精卵母細(xì)胞可更好地獲得胚泡。11%的來(lái)源于新鮮受精卵母細(xì)胞的胚泡發(fā)育成干細(xì)胞系，而15。/。的來(lái)源于冷凍受精卵母細(xì)胞的胚泡發(fā)育成干細(xì)胞系?？傊?，在進(jìn)行培養(yǎng)的受精卵母細(xì)胞中2%的新鮮受精卵母細(xì)胞發(fā)育成干細(xì)胞系，而進(jìn)行培養(yǎng)的冷凍受精卵母細(xì)胞中有7%發(fā)育成干細(xì)胞系。在進(jìn)行本領(lǐng)域熟知的方法后將受精卵母細(xì)胞培養(yǎng)至胚泡階段。在Gardner等人的Embryoculturesystems，Trounson，A.O.和Gardner,D.K.(編著)的Handbookofinvitrofertilization,第二版，CRCPress,BocaRaton，第205-264頁(yè)；Gardner等人的FertilSteril，74,增刊3,0-086;Gardner等人的HumReprod，13，3434,3440;Gardner等人的JReprodImmunol(即將發(fā)表)；和Hooper等人的BiolReprod，62，增刊1,249中可查到用于制備胚泡的方法。在步驟i)中任選地來(lái)源于具有1或2級(jí)受精卵母細(xì)胞的胚泡建立之后，將具有A或B級(jí)的胚泡與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)以建立一個(gè)或多個(gè)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞集落。在涂覆在飼養(yǎng)細(xì)胞上后，監(jiān)控其生長(zhǎng)并且當(dāng)所述集落大到足以進(jìn)行人工傳代(約涂覆后1-2周)時(shí)，可將所述細(xì)胞從其它類型細(xì)胞中切開(kāi)并置于新的飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)以展平。通過(guò)使用玻璃毛細(xì)管作為切割工具，對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械切割分離?？赏ㄟ^(guò)顯微鏡可容易地對(duì)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并且因此不必用酶和/或抗體對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行任何處理以損害或除去滋養(yǎng)外胚層。因此，WO03/055992的方法減少對(duì)免疫切除法的需要。通過(guò)比較使用免疫切除法對(duì)比保持滋養(yǎng)外胚層完整的本發(fā)法的成功率，已發(fā)現(xiàn)避免免疫切除法的更簡(jiǎn)單、更快速和無(wú)創(chuàng)傷的方法比免疫切除法更有效。這些方法使得制備干細(xì)胞和分化這些細(xì)胞系在商業(yè)上可行。從總共122個(gè)胚泡中建立了19個(gè)細(xì)胞系(15.5%)。通過(guò)免疫切除法處理了42個(gè)胚泡并且其中6個(gè)成功地建立起細(xì)胞系(14%)。通過(guò)本發(fā)明方法處理80個(gè)胚泡并且建立了13個(gè)細(xì)胞系(16%)。隨后分割內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，將所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與伺養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)以獲得胚泡來(lái)源的干(BS)細(xì)胞系。在獲得hBS細(xì)胞系后，任選地繁殖所述細(xì)胞系以擴(kuò)增細(xì)胞量。因此，胚胞來(lái)源的干細(xì)胞系可通過(guò)例如每隔4-5天對(duì)所述干細(xì)胞系傳代來(lái)進(jìn)行繁殖。如果所述干細(xì)胞在傳代前培養(yǎng)超過(guò)4-5天，不想要的細(xì)胞分化的可能性就會(huì)增加。在此處已建立的實(shí)施例5中提供了在伺養(yǎng)培養(yǎng)系統(tǒng)中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代的特殊方法。人BS細(xì)胞系可分離自天然孵化的胚泡或來(lái)自具有完整透明帶的擴(kuò)張的胚泡。在上述方法中步驟i)的胚泡是天然孵化的胚泡。孵化的胚泡滋養(yǎng)外胚層可保持完整。可將孵化的胚泡或具有去除或部分去除透明帶的胚泡置于滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞上。在步驟ii)之前通過(guò)用一種或多種酸性試劑例如ZDTM-10(Vitrolife，Gothenburg,Sweden)、一種或多種酶或酶的混合物例如鏈霉蛋白酶處理至少可對(duì)胚泡的透明帶進(jìn)行部分降解或化學(xué)起褶。對(duì)具有完整透明帶的胚泡進(jìn)行短暫的鏈霉蛋白酶(Sigma)處理導(dǎo)致所述帶的消除。也可使用具有與鏈霉蛋白酶相同或相似蛋白酶活性的其它類型蛋白酶。在鏈霉蛋白處理后可將胚泡涂覆在所述的滅活的飼養(yǎng)細(xì)胞上。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，可在改善胚泡和/或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞(如果相關(guān))對(duì)飼養(yǎng)細(xì)胞的附著的試劑中進(jìn)行步驟ii)和/或步驟iv)。用于該目的的合適物質(zhì)是透明質(zhì)酸。用于將胚泡涂覆在飼養(yǎng)細(xì)胞上的合適培養(yǎng)基可以是補(bǔ)充有透明質(zhì)酸的hBS培養(yǎng)基，所述透明質(zhì)酸似乎可促進(jìn)所述胚泡在銅養(yǎng)細(xì)胞上的附著和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的生長(zhǎng)。透明質(zhì)酸(HA)是關(guān)節(jié)中細(xì)胞外基質(zhì)的重要粘多糖成分。其似乎通過(guò)與至少兩種細(xì)胞表面受體CD44和用于HA介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)性(RHAMM)的受體以及與細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白的結(jié)合相互作用來(lái)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。在hBS細(xì)胞建立過(guò)程中HA的正效應(yīng)可通過(guò)其與細(xì)胞膜中磷脂的表面活性極性頭部的相互作用來(lái)發(fā)揮，從而穩(wěn)定所述表面活性劑層并因此而降低內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚泡的表面28張力，所述表面張力的降低可導(dǎo)致與飼養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合效率的增加?？蛇x擇地，HA可與其在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或胚泡上的受體結(jié)合和/或與飼養(yǎng)細(xì)胞結(jié)合并發(fā)揮其正向影響內(nèi)細(xì)胞團(tuán)附著和生長(zhǎng)的生物學(xué)效應(yīng)。因此，其它可改變流體表面張力的試劑或其它影響胚泡與飼養(yǎng)細(xì)胞之間相互作用的方式也可用來(lái)替代透明質(zhì)酸。在上述方法中所述飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)對(duì)hBS細(xì)胞系的建立非常重要。胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系的繁殖可包括至多3次飼養(yǎng)細(xì)胞傳代，例如至多2次。適合用于本發(fā)明方法的飼養(yǎng)細(xì)胞是例如胚胎或成熟體來(lái)源的成纖維細(xì)胞。在本發(fā)明的方法中應(yīng)用于步驟ii)或iv)的伺養(yǎng)細(xì)胞可以是相同的也可以是不同的并且來(lái)源于動(dòng)物來(lái)源例如任何包括人、小鼠、大鼠、猴、倉(cāng)鼠、青蛙、兔等的哺乳動(dòng)物。來(lái)自人或小鼠的飼養(yǎng)細(xì)胞是優(yōu)選的。另一個(gè)獲得滿足一般要求的hBS細(xì)胞系的重要標(biāo)準(zhǔn)是進(jìn)行胚泡培養(yǎng)的條件。因此可通過(guò)使用低于約每cm260,000個(gè)細(xì)胞，例如低于約每cm255,000個(gè)細(xì)胞或低于約每cm250,000個(gè)細(xì)胞的密度的飼養(yǎng)細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)干細(xì)胞以對(duì)胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系進(jìn)行增殖。在特定的實(shí)施方案中，胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系的增殖包括用約每cm245，000個(gè)細(xì)胞的密度的伺養(yǎng)細(xì)胞來(lái)培養(yǎng)所述干細(xì)胞系。這些值應(yīng)用于在使用小鼠伺養(yǎng)細(xì)胞的情況下并且預(yù)期在其它類型的飼養(yǎng)細(xì)胞中也可發(fā)現(xiàn)合適的密度?；诒景l(fā)明的發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能找出這樣的合適密度?；睢?、…，。，'、通過(guò)上述建立方法獲得的胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系在合適的時(shí)間段內(nèi)保持自我更新和多能性，并且因此在合適的時(shí)間段內(nèi)是穩(wěn)定的。在本上下文中術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定"是指在有絲分裂滅活的胚胎伺養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)在未分化狀態(tài)下具有超過(guò)21個(gè)月的增殖能力。通過(guò)上述建立方法獲得的干細(xì)胞系滿足一般要求。因此，所述細(xì)胞系i)表現(xiàn)出在有絲分裂滅活的胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)在未分化狀態(tài)下具有超過(guò)21個(gè)月的增殖能力，和ii)表現(xiàn)出正常的整倍體染色體核型，和m)保持在體外和休內(nèi)發(fā)育成所有類型胚層的衍生細(xì)胞的潛能，和iv)表現(xiàn)至少兩種下列分子標(biāo)記OCT-4、堿性磷酸酶、糖類表位SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81和由單克隆抗體GCTM-2識(shí)別的硫酸角質(zhì)素/硫酸軟骨素細(xì)胞外周基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白核心，和v)不表現(xiàn)分子標(biāo)記SSEA-1或其它分化標(biāo)記，和vi)保持其多能性和當(dāng)注射入無(wú)免疫應(yīng)答的小鼠時(shí)在體內(nèi)形成畸胎瘤，和vii)能夠分化。通過(guò)下列標(biāo)準(zhǔn)確定通過(guò)上述方法獲得的未分化hBS細(xì)胞其分離自人的植入前受精卵母細(xì)胞即胚泡，并且表現(xiàn)出在有絲分裂滅活的祠養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)在未分化狀態(tài)下的增殖能力；其表現(xiàn)正常的染色體核型；其表達(dá)未分化hBS細(xì)胞的典型標(biāo)記，例如OCT-4、堿性磷酸酶、糖類表位SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81和由單克隆抗體GCTM-2識(shí)別的硫酸角質(zhì)素/硫酸軟骨素細(xì)胞外周基質(zhì)蛋白聚糖的蛋白核心，并且顯示沒(méi)有任何糖類表位SSEA-1或其它分化標(biāo)記的表達(dá)。此外，體外和體內(nèi)(畸胎瘤)多能性檢驗(yàn)表明可分化成所有胚層的衍生細(xì)胞。如上所述，所述方法提供了基本上純的多能性人BS細(xì)胞制備物，所述人BS細(xì)胞制備物i)表現(xiàn)出在有絲分裂滅活的胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)在未分化狀態(tài)下具有超過(guò)21個(gè)月的增殖能力；ii)表現(xiàn)出正常的整倍體染色體核型；iii)保持在體外和體內(nèi)都發(fā)育成所有胚層的衍生細(xì)胞的潛能；iv)表現(xiàn)至少兩種下列的分子標(biāo)記OCT-4、堿性磷酸酶、糖類表位SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81和由單克隆抗體GCTM-2識(shí)別的硫酸角質(zhì)素/硫酸軟骨素細(xì)胞外周基質(zhì)蛋白聚糖的蛋30200810166782.0白核心；v)不表現(xiàn)分子標(biāo)記SSEA-l或其它分化標(biāo)記，和vi)保持其多能性并且當(dāng)注射入無(wú)免疫應(yīng)答的小鼠時(shí)在體內(nèi)形成畸胎瘤，和vii)能夠分化。在Gage，F(xiàn).H.的Science,287:1433-1438(2000)中可找到用于檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記的方法。這些方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的并且包括方法例如RT-PCR或免疫學(xué)測(cè)定，在所述免疫學(xué)測(cè)定中使用針對(duì)所述細(xì)胞標(biāo)記的抗體。下面描述用于檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記的方法、雜交方法、核型分析、用于測(cè)量端粒酶活性和畸胎瘤形成的方法。這些方法可用于調(diào)查根據(jù)所述建立方法荻得的hBS細(xì)胞是否滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。^嫂邀歡/么^對(duì)繼續(xù)培養(yǎng)的hBS干細(xì)胞的分化狀態(tài)進(jìn)行例行監(jiān)控。用于監(jiān)控未分化hBS細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)記是SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81。在4。/。PFA中固定人BS干細(xì)胞，接著用0.5%的TritonX-100穿孔。在洗滌和用10%干牛奶封閉后，用一抗溫育所述細(xì)胞。在大致洗滌后用二抗溫育所述細(xì)胞并且用DAPI染色顯示細(xì)胞核。減遂碌遂雜按照廠商(SigmaDiagnostics)的說(shuō)明書(shū)〗吏用商業(yè)購(gòu)得的試劑盒確定堿性磷酸酶的活性。通過(guò)使用RT-PCR和基因特異性引物對(duì)(5隱CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG，5'-CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC)以及作為管家基因的GAPDH(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC，5，畫(huà)TCCACCACCCTGTTGCTGTA)測(cè)量轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的mRNA水平。在一輪FISH中用染色體特異性探針篩選一個(gè)或多染色體。該技術(shù)可檢測(cè)出大量遺傳畸變(如果存在)。為進(jìn)行該分析CTS使用了含有用于染色體13、18、21和性染色體(X和Y)的探針的商業(yè)購(gòu)得的試劑盒(Vysis.Inc，DownersGrove，IL，USA)。對(duì)于每個(gè)細(xì)胞系至少分析200個(gè)細(xì)胞核。將所述細(xì)胞懸浮于Carnoy，s固定劑中并滴到帶正電荷的載玻片上。將探針LSI13/21與LSI雜交緩沖液混合并加到所述載玻片上并用蓋玻片蓋上。將探針CEPX/Y/18與CEP雜交緩沖液混合并以相同的方法加到另一載玻片上。于70。C下變性5分鐘，接著在濕盒中于37。C雜交14-20小時(shí)。經(jīng)過(guò)三個(gè)洗滌步驟后用DAPIII對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色并將所述栽玻片在裝配有合適濾鏡和軟件的倒置顯微鏡(CytoVision,AppliedImaging)下進(jìn)行分析。核型分析核型分析允許對(duì)所有染色體以直接的方式進(jìn)行研究并且提供非常豐富的信息，可檢測(cè)到大量和更大結(jié)構(gòu)上的畸變。為了檢測(cè)鑲嵌現(xiàn)象，至少需要30個(gè)核型。然而，該技術(shù)非常費(fèi)時(shí)并且技術(shù)復(fù)雜。為了改善用于測(cè)定的條件可通過(guò)用導(dǎo)致細(xì)胞阻止在中期的秋水仙酰胺、秋水仙素的合成類似物和微管解聚試劑提高有絲分裂指數(shù)，但仍需要大量細(xì)胞的提供(6乂106細(xì)胞/分析)。將細(xì)胞在0.1ng/ml秋水仙酰胺存在的情況下溫育1-2小時(shí)，然后用PBS洗滌并用胰蛋白酶消化。通過(guò)以1S00rpm離心10分鐘收集所述細(xì)胞。用乙醇和冰醋酸固定所述細(xì)胞并用改進(jìn)的Wrights對(duì)染色體進(jìn)行染色觀察?；^差厲遂殺it比較基因組雜交(CGH)是對(duì)核型分析的補(bǔ)充。CGH產(chǎn)生更高的染色體分辨率并且在技術(shù)上具有較小的挑戰(zhàn)性。在DNA、A4、Texas紅dUTP/FITC12-dUTP和DNA聚合酶1的混合物中對(duì)分離的DNA進(jìn)行切口平移。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳以控制所得的DNA片段大小(600-2000bp)。將檢驗(yàn)和參照DNA進(jìn)行沉淀并重新懸浮于包含甲酰胺、葡聚糖硫酸酯和SSC的雜交混合液中。在濕盒中于37。C下在具有中期相的變性玻璃載玻片上進(jìn)行雜交。在大致洗滌后加入一滴抗衰減封固混合物(vectashield,O.lng/mlDAPIII)并用蓋玻片將所述32載玻片蓋上。然后在顯微鏡下并用圖象分析系統(tǒng)對(duì)載玻片進(jìn)行估測(cè)。裙在凝活'^因?yàn)楦叨肆Ｃ富钚砸驯淮_定為hBS細(xì)胞6的標(biāo)準(zhǔn)，因此在所述hBS細(xì)胞系中測(cè)量端粒酶活性。已知當(dāng)細(xì)胞達(dá)到更多的分化狀態(tài)時(shí)端粒酶活性持續(xù)降低。因此對(duì)所述活性的定量必須涉及更早的代數(shù)和對(duì)照樣品，并且可用作檢測(cè)分化的工具。所述方法，TelomerasePCRELISA試劑盒(Roche)使用端粒酶的內(nèi)切活性，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所述產(chǎn)物并用酶聯(lián)免疫吸收測(cè)定法(ELISA)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)進(jìn)行所述測(cè)定。來(lái)自該測(cè)定的結(jié)果通常顯示hBS細(xì)胞具有高端粒酶活性(>1)。所述細(xì)胞系保持其多能性并且當(dāng)注射入無(wú)免疫應(yīng)答的小鼠時(shí)在體內(nèi)形成畸胎瘤。此夕卜，在體外這些細(xì)胞可形成hBS細(xì)胞來(lái)源的小體。在這兩個(gè)模型中，可發(fā)現(xiàn)所有胚層的細(xì)胞特征。^^缺潛V、處分析人BS細(xì)胞系是否已保持多能性的一個(gè)方法是將所述細(xì)胞異種移植至免疫缺陷小鼠以獲得腫瘤、畸胎瘤。在所述肺瘤中發(fā)現(xiàn)的各類組織應(yīng)當(dāng)代表所有三個(gè)胚層。已有報(bào)道顯示來(lái)源于異種移植免疫缺陷小鼠的腫瘤的各種組織，例如橫紋肌、軟骨和骨(中胚層)、腸(內(nèi)胚層)和神經(jīng)蓮座(外胚層)。還有，大部分腫瘤由雜散(disorganized)的組織構(gòu)成。嚴(yán)重的組合免疫缺陷(SCID)小鼠(缺乏B和T淋巴細(xì)胞的林系)被用于畸胎瘤形成的分析。通過(guò)手術(shù)將人BS細(xì)胞置入睪丸中或腎嚢下。在睪丸或腎中，以10000至100000個(gè)細(xì)胞的范圍移植hBS細(xì)胞。理想地，每次對(duì)每個(gè)細(xì)胞系使用5-6只小鼠。初步結(jié)果顯示雌性小鼠在術(shù)后比雄性小鼠穩(wěn)定并且在腎中和在睪丸中進(jìn)行異種移植在產(chǎn)生腫瘤方面效果相同。因此，雌性SCID小鼠畸胎瘤模型是優(yōu)選的。所述腫瘤通常在約1個(gè)月后表現(xiàn)明顯。在1-4個(gè)月后殺死小鼠和解剖腫瘤，并固定用于石蠟或冷凍切片。然后通過(guò)免疫組織化學(xué)方法對(duì)所述腫瘤組織進(jìn)行分析。使用針對(duì)所有三種胚層的特定標(biāo)記。目前使用的所述標(biāo)記是用于區(qū)分小鼠組織和人腫瘤組織的E-鈣粘著蛋白、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(中胚層)、a-甲胎蛋白(內(nèi)胚層)和p-III-微管蛋白(外胚層)。此外，為了一般形態(tài)學(xué)觀察進(jìn)行蘇木精-依紅染色。在下列"建立實(shí)施例，，中對(duì)所述建立方法進(jìn)行描述。此處包括的實(shí)施例僅用作說(shuō)明目的并不以任何方式限制本發(fā)明范圍。此處描述的一般方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的并且所有反應(yīng)物和緩沖液是很容易獲得的，可商業(yè)購(gòu)得或容易地根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的已建立好的實(shí)驗(yàn)方案制備而來(lái)。所有的溫育都在37。C下，在C02氣體中進(jìn)行。所使用的一種合適的培養(yǎng)基稱作"BS細(xì)胞培養(yǎng)基"或"BS培養(yǎng)基，，并且可包含補(bǔ)充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基，所述成分各自的終濃度為青霉素100單位/ml,鏈霉素50ng/ml，非必需氨基酸O.lmM，L谷氨酰胺2mM，卩-硫基乙醇100nM，人重組bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)4ng/ml。另一種合適的培養(yǎng)基是"BS細(xì)胞體培養(yǎng)基"，其組成如下補(bǔ)充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基，所述成分的各自終濃度為青霉素50單位/ml,鏈霉素50ng/ml，非必需氨基酸0.1mM，L谷氨酰胺2mM,P-硫基乙醇100pM。在本上下文中術(shù)語(yǔ)"穩(wěn)定，，是指當(dāng)在有絲分裂滅活的胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)在未分化狀態(tài)下具有超過(guò)21個(gè)月的增殖能力。建立實(shí)施例建立實(shí)施例1建立來(lái)自天然孵育的胚胞的基本純凈的未分化干細(xì)胞制備物人胚泡來(lái)源于冷凍或新鮮的人體外受精的胚胎。將天然孵育的胚泡直接置于hBS細(xì)胞培養(yǎng)基(補(bǔ)充以20%的KNOCKOUTSerum替34代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco，sModifiedEagle's培養(yǎng)基，并且所述成分各自的終濃度為青霉素50單位/ml,鏈霉素50ng/ml,非必需氨基酸0.1mM，L谷氨酰胺2mM，p-硫基乙醇100jiM,人重組bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)4ng/ml)中的伺養(yǎng)細(xì)胞(EF)上，補(bǔ)充以0.125mg/ml透明質(zhì)酸。在將所述胚泡涂覆在EF細(xì)Jfe上后，監(jiān)控其生長(zhǎng)并且在涂覆約1-2周后集落大到足以人工傳代時(shí)將所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞從其它細(xì)胞類型中切開(kāi)并且通過(guò)培養(yǎng)在新的EF細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增。建立實(shí)施例2建立來(lái)自具有完整透明帶的胚泡的未分化干細(xì)胞的基本純化的制備物對(duì)于具有完整透明帶的胚泡，在將所述胚泡直接置于補(bǔ)充有透明質(zhì)酸(0.125mg/ml)的hBS培養(yǎng)基中的EF細(xì)胞層上后，在rS2(ICM-2)培養(yǎng)基中(Vitrolife，Gothenburg,Sweden)使用鏈霉蛋白酶(10U/ml，Sigma)進(jìn)行短暫溫育以降解透明帶。建立實(shí)施例3對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行組織化學(xué)染色收獲所述細(xì)胞以進(jìn)行RT-PCR和組織學(xué)(堿性磷酸酶)以及免疫細(xì)胞化學(xué)分析(參見(jiàn)下面)。分離RNA和進(jìn)行RT-PCR。按照廠商的推薦使用RneasyMini試劑盒(Qiagen)制備總細(xì)胞RNA。使用用于RT國(guó)PCR的AMVFirstStrandcDNASynthesis試劑盒(Roche)進(jìn)行cDNA合成并且使用PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen)進(jìn)行PCR。按照廠商的推薦使用商業(yè)購(gòu)得的試劑盒(Sigma)對(duì)堿性磷酸酶進(jìn)行組織化學(xué)染色。建立實(shí)施例4制備和培養(yǎng)hBS細(xì)胞系將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在組織培養(yǎng)皿中的EMFI培養(yǎng)基上DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle's培養(yǎng)基)，補(bǔ)充以10%FCS(胎牛血清)、0.1nM(5-硫基乙醇、50單位/ml青霉素、50ng/ml鏈霉素和2mML-谷氨酰胺(GibcoBRL)。使用絲裂霉素C(10ng/ml，3小時(shí))對(duì)所述祠養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂滅活。通過(guò)人工切割將人BS細(xì)胞集落置于滅活的小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行擴(kuò)增。將人BS細(xì)胞培養(yǎng)在具有hBS細(xì)胞培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)皿中的有絲分裂滅活的小鼠胚胎成纖維飼養(yǎng)細(xì)胞上，所述培養(yǎng)基是補(bǔ)充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基，所述成分各自的終濃度為青霉素50單位/ml，鏈霉素50pg/ml，非必需氨基酸0.1mM，L谷氨酰胺2mM，p-疏基乙醇100nM，人重組bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)4納克/ml。傳代7天后所述集落大到足以產(chǎn)生BS細(xì)胞小體。用玻璃毛細(xì)胞管將BS細(xì)胞集落切成0.4X0.4mm的小塊并涂覆在含有BS細(xì)胞小體培養(yǎng)基的非粘附性細(xì)胞培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)基包括補(bǔ)充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培養(yǎng)基，所述成分各自的終濃度為青霉素50單位/ml,鏈霉素50ng/ml，非必需氨基酸O.lmM，L谷氨酰胺2mM和j3-硫基乙醇100nM。所述BS細(xì)胞小體(包括嚢狀hBS細(xì)胞小體)在7-9天內(nèi)形成。建立實(shí)施例5hBS細(xì)胞傳代在傳代前使用NikonEclipseTE2000-U倒置顯微鏡(10X物鏡)和DXM1200的數(shù)碼相機(jī)對(duì)所述hBS細(xì)胞進(jìn)行拍照。每隔4-5天對(duì)集落進(jìn)行傳代。當(dāng)所述集落可被切成小塊(0.1-0.3X0.1-0.3mm)時(shí)其便大到足以進(jìn)行傳代。當(dāng)所述細(xì)胞第一次傳代時(shí)，其已經(jīng)培養(yǎng)了1-2周并且可以;陂切成約4片。將所述集落在立體顯微鏡下逐個(gè)地聚焦并根據(jù)上述大小在小方格36圖案上進(jìn)行切割。只對(duì)內(nèi)部均一的結(jié)構(gòu)進(jìn)行傳代。用切挪動(dòng)各集落方塊，將其吸入毛細(xì)管并置于新的飼養(yǎng)細(xì)胞(最多4天大小)上。將10-16個(gè)方塊均勻地放在每個(gè)新IVF培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)亞放置5至10分鐘以使所述細(xì)胞可粘附在新的飼養(yǎng)細(xì)胞上，然后再放入培養(yǎng)箱中。每周換三次hBS培養(yǎng)基。如果對(duì)集落進(jìn)行傳代，在該特定周更換兩次培養(yǎng)基。通常進(jìn)行"半更換"，其是指只吸出一半的培養(yǎng)基并用等量的新鮮的、溫和的培養(yǎng)基替代。如果需要可將整個(gè)體積的培養(yǎng)基進(jìn)行更換。建立實(shí)施例6玻璃化hBS細(xì)胞切割具有適當(dāng)?shù)奈捶只螒B(tài)學(xué)的來(lái)自所述細(xì)胞系的集落以進(jìn)行傳代。將100-2O0ml液氮無(wú)菌過(guò)濾至足夠量的冷凍管中。制備兩種溶液A和B(A:800fil具有1M海藻糖的CryoPBS,100^11，2-亞乙基二醇和100nlDMSO，B:600^1具有1M海藻糖的PBS，200^11,2-亞乙基二醇和200nlDMSO)并將所述集落置于A中進(jìn)行l(wèi)分鐘和置于B中進(jìn)行25秒。使用閉合吸管貯存所述冷凍集落。在將所述集落轉(zhuǎn)移至吸管中后，迅速將其放入裝有無(wú)菌過(guò)濾液氮的冷凍管中。建立實(shí)施例7接種胚胎小鼠飼養(yǎng)(EMFi)細(xì)胞通過(guò)在37°C下用含有絲裂霉素C的EMFi培養(yǎng)基溫育3小時(shí)對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行滅活。用明膠覆蓋IVF培養(yǎng)皿。吸入所述培養(yǎng)基并用PBS洗滌所述細(xì)胞。用胰蛋白酶替代PBS以分離所述細(xì)胞。溫育后，用EMFi培養(yǎng)基停止胰蛋白酶活性。然后通過(guò)離心收集所述細(xì)胞，在EMFi培養(yǎng)基中按1:5稀釋，并在Burker小室中進(jìn)行計(jì)數(shù)。將所述細(xì)胞稀釋至終濃度為170K細(xì)胞/mlEMFi培養(yǎng)基。用lml細(xì)胞懸浮液替代IVF培養(yǎng)皿中的明膠并放入培養(yǎng)箱中。接種后的第二天更換EMFi培養(yǎng)基。37用于將hBS細(xì)胞有效地將由飼養(yǎng)細(xì)胞支持的hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中和在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下長(zhǎng)期繁殖hBS細(xì)胞的方法可將本發(fā)明所使用的hBS細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中，與已知方法相比所述方法優(yōu)勢(shì)在于被轉(zhuǎn)移細(xì)胞在至少高達(dá)10次的傳代中保持穩(wěn)定。Richards等人的研究顯示hBS細(xì)胞系在未分化狀態(tài)下不能在無(wú)細(xì)胞基質(zhì)(包括MatrigelTM)中繁殖超過(guò)6次傳代。然而，所述hBS細(xì)胞可在Matrigel中穩(wěn)定高達(dá)35次傳代，甚至在冷凍/解凍周期后仍然表達(dá)未分化hBS細(xì)胞的標(biāo)記并且生長(zhǎng)速度保持大致相當(dāng)。此外，當(dāng)機(jī)械分離與酶分離相比較時(shí)，在涂覆2天后觀察到顯著更高數(shù)目的存活集落。關(guān)鍵的步驟似乎是將所述hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系的最初步驟。因此，下面描述用于將hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系的方法，其中將所述hBS細(xì)胞從飼養(yǎng)細(xì)胞中機(jī)械地切出。在此處的無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例中，只使用各集落的中間部分，盡管在Xu等人先前的工作中整個(gè)集落冒著被帶有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基污染的風(fēng)險(xiǎn)通過(guò)酶處理被進(jìn)行分離。此外，在非常精細(xì)的將飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)伺養(yǎng)細(xì)胞的表面上的步驟中，酶的使用造成涉及細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的重要表面分子的失活。Matrigel中的主要成分是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，例如IV類膠原蛋白和層粘連蛋白。據(jù)信當(dāng)與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合時(shí)細(xì)胞表面的整聯(lián)蛋白的活性成為調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、存活和繁殖的關(guān)鍵步驟。例如，在膠原蛋白受體中整聯(lián)蛋a在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)膠原基質(zhì)中的細(xì)胞增殖方面都具有獨(dú)特的作用?？赡苡蒱BS細(xì)胞大量表達(dá)的整聯(lián)蛋白a6和pi形成的層粘邊蛋白特異性受體也可在hBS細(xì)胞粘附至基質(zhì)表面中起著主要作用。因此，有一種可能是在所述細(xì)胞已適應(yīng)新的表面之前所述最初強(qiáng)烈的膠原蛋白酶IV處理不利地影響了一些起著附著或存活作用的重要表面受體。在此處的實(shí)施例中在關(guān)于細(xì)胞粘附、存活率和繁殖方面考察了通過(guò)機(jī)械或酶促分離將hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞環(huán)境中的不同技術(shù)。此外，發(fā)展了用助于長(zhǎng)期繁殖和大規(guī)模生產(chǎn)未分化的hBS細(xì)胞的純系群體的方法。同樣也考察了用于冷凍/解凍hBS細(xì)胞的常規(guī)冷凍保存技38術(shù)的用途。勿應(yīng)摔移^尤辨#勿應(yīng)伴^斧癥在切開(kāi)內(nèi)細(xì)胞團(tuán)后，將所述內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與飼養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)以獲得胚泡來(lái)源的干(BS)細(xì)胞系。在獲得hBS細(xì)胞系后，任選地繁殖所述細(xì)胞系以增加細(xì)胞的量。在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞體系中對(duì)hBS細(xì)胞進(jìn)行繁殖前，可將所述hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞體系。如之前在此處所提到的和在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例中所證明的，成功轉(zhuǎn)移至無(wú)伺養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中的方法。因此，必須通過(guò)機(jī)械切割將所述hBS細(xì)胞轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系，可通過(guò)使用玻璃毛細(xì)管作為切割工具進(jìn)行所述機(jī)械切割。如此處實(shí)施例中所顯示的，與酶處理的培養(yǎng)物相比，機(jī)械分離使得細(xì)胞更加極其有效地粘附在MatrigeITM上、更加快速地繁殖，并且在傳代過(guò)程中所述細(xì)胞更加穩(wěn)定得多。因此，根據(jù)本發(fā)明用于轉(zhuǎn)移HS細(xì)胞的方法不需要任何酶處理。如此處實(shí)施例中所看到的，在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下培養(yǎng)和繁殖的細(xì)胞具有與在飼養(yǎng)細(xì)胞條件下培養(yǎng)的細(xì)胞相似的有絲分裂指數(shù)。胚泡來(lái)源的干細(xì)胞系的繁殖包括在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述干細(xì)胞，由于在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)hBS細(xì)胞具有許多有利方面，例如不需要進(jìn)行祠養(yǎng)細(xì)胞的生產(chǎn)，因此可容易地根據(jù)商業(yè)產(chǎn)量將hBS細(xì)胞按比例擴(kuò)大生產(chǎn)并且無(wú)來(lái)自飼養(yǎng)細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)移或其它感染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，在無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞條件下轉(zhuǎn)移和繁殖步驟可包括如下步驟a)通過(guò)機(jī)械處理將胚泡來(lái)源的干細(xì)胞從飼養(yǎng)細(xì)胞上轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物上。b)任選地，在合適的培養(yǎng)基和/或在合適的支持底物上在祠養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述胚泡來(lái)源的干細(xì)胞，和c)任選地，每隔3-10天通過(guò)酶促和/或機(jī)械處理對(duì)所述胚泡來(lái)源的干細(xì)胞進(jìn)行傳代。39通常，包括i)-iii)的所有步驟。摔/^S鈿應(yīng)^匈#勿應(yīng)潛##^脊移^無(wú)匈#勿>敏潛#伴系如上所述已發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移步驟是個(gè)關(guān)鍵步驟。因此，應(yīng)當(dāng)通過(guò)機(jī)械分離的方法或在飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)體系中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械分離來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。可通過(guò)任何合適的切割工具例如具有尖銳末端和適合于切割的大小的工具來(lái)進(jìn)行這種機(jī)械處理。所述工具可以由任何合適的材料例如塑料或玻璃制成，并且具有25度角和200或300微米管腔、設(shè)計(jì)用來(lái)切割、操縱和轉(zhuǎn)移hBS集落或部分hBS集落的無(wú)菌的尖銳的玻璃毛細(xì)管切割工具是個(gè)合適的工具的例子。其由SwemedLabInternationalAB，Billdal,瑞典生產(chǎn)。要轉(zhuǎn)移的hBS細(xì)胞是hBS細(xì)胞集落并且從所述集落的中央切割出小塊并以細(xì)胞團(tuán)懸浮于合適的培養(yǎng)基中。一次或多次機(jī)械地將所述細(xì)胞團(tuán)分割開(kāi)例如直至所述細(xì)胞團(tuán)具有至多為原始集落的50%，例如至多約40%、至多約30%、至多約20%、至多約10%、至多約5%的大小。例如將所述大小分別確定為所述細(xì)胞團(tuán)或集落的直徑。在此處的無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例中給出了合適的用于轉(zhuǎn)移步驟的條件。當(dāng)然這些條件可在合適的限制內(nèi)變化，所述限制在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例1為無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物制備適應(yīng)性(conditioned)VitroHESTM-培養(yǎng)基(k-VitroHES-培養(yǎng)基)為適應(yīng)VitroHESTM-培養(yǎng)基制備mEF細(xì)胞，用絲裂霉素C處理匯合的單層mEF細(xì)胞(第二次傳代)并以59000細(xì)胞/cm2的濃度接種在裝有Dulbecco，sModifiedEagle培養(yǎng)基(D-MEM)的覆蓋有明膠(0.1%;Sigma)的培養(yǎng)扁瓶中，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有1%的青霉素/鏈霉素(PEST;10000單位/ml)、10%胎牛血清(FBS)和2mMGLUTAMAXTM-1補(bǔ)充物(200mM);所有東西都來(lái)自GibcoBRL/Invitrogen,Carlsbad,CA，USA。在經(jīng)過(guò)24小時(shí)的溫育時(shí)期并用PBS(GibcoBRL/Invitrogen)洗滌一次后，拋棄所述培養(yǎng)基并用VitroHESTM-培養(yǎng)基(0.28ml/cm2)替代進(jìn)行24小時(shí)的適應(yīng)期。每天從相同的mEF培養(yǎng)物(在第二次傳代中)中進(jìn)行高達(dá)三次的收集所述VitroHESTM-適應(yīng)培養(yǎng)基并且使用0.2jim的低蛋白結(jié)合過(guò)濾器(Sarstedt，Landskrona，Sweden)進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。使用新鮮的或在-20。C下冷凍過(guò)的k-VitroHES-培養(yǎng)基并且在使用前補(bǔ)充以4ng/ml的bFGF(GibcoBRL/Invitrogen)。如果貯存在+4。C度k-VitroHES-培養(yǎng)基中可使用長(zhǎng)達(dá)一周。當(dāng)貯存在-20。C時(shí)可長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月，在使用時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到生物活性減退的跡象。無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例2將hBS細(xì)胞系轉(zhuǎn)移至無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件上將最初的hBS細(xì)胞系保持在絲裂霉素C處理過(guò)的傳代10-50次的小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上并培養(yǎng)在補(bǔ)充有4ng/ml的人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的VitroHESTM-培養(yǎng)基上。對(duì)用于將hBS細(xì)胞從飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物中轉(zhuǎn)移至MatrigelTM覆蓋的培養(yǎng)皿中的兩種不同技術(shù)進(jìn)行評(píng)估，一種用機(jī)械分離而另一種用膠原酶處理。通過(guò)使用干細(xì)胞切割工具(SwemedLabAB，Bilidal,Sweden)將hBS細(xì)胞切成方塊，所述方塊代表集落的中部，并且將所述細(xì)胞小心地分離并轉(zhuǎn)移至HBSS溶液中。所述干細(xì)胞切割工具是具有25度角和200或300微米管腔、設(shè)計(jì)用來(lái)切割、操縱和轉(zhuǎn)移hBS集落或部分hBS集落的無(wú)菌尖銳的玻璃毛細(xì)管。其由SwemedLabInternationalAB,Billdal，瑞典生產(chǎn)。^^t^雜j^^雜炎A理f眉力^^,在HBSS中洗滌后將所述細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至膠原酶IV溶液(200單位/ml，Sigma)以進(jìn)行酶促分離。將所述細(xì)胞在37。C下和5%的C02中溫育30分鐘。在溫育期間，用移液器進(jìn)行重復(fù)的機(jī)械分離并在倒置顯微鏡下監(jiān)控分離過(guò)程。在溫育過(guò)后沉淀(400G進(jìn)行5分鐘)所述細(xì)胞懸浮物并在重新懸浮于k-VitroHES培養(yǎng)基中之前用KnockOutD畫(huà)MEM(GibeoBRL/Invitrogen)洗滌一次。旅^本發(fā)^進(jìn)^^批械為、岸在HBSS中洗滌后，使用lml自動(dòng)移液器機(jī)械地將所述細(xì)胞團(tuán)小心地分離開(kāi)。如上所述當(dāng)所述細(xì)胞團(tuán)的大小展現(xiàn)出相應(yīng)于通過(guò)膠原酶IV處理產(chǎn)生的細(xì)胞聚集體的大小一約為原始集落(平均20000個(gè)細(xì)胞/原始集落)的1/10-1/20時(shí)，完成所述分離過(guò)程。在HBSS中洗滌后，將所述集落轉(zhuǎn)移至膠原酶IV溶液(200單位/ml)以開(kāi)始進(jìn)行酶分離。對(duì)于兩種不同的技術(shù)，各將所述細(xì)胞接種到4個(gè)小孔中并在37°C下于5。/。的C02中溫育。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，每次接種相同量的細(xì)胞。2和6天后計(jì)算集落的大小和數(shù)量。尤辨#*^婆滋辨/*2#潛^為了最優(yōu)化hBS細(xì)胞從飼養(yǎng)細(xì)胞至無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞條件的轉(zhuǎn)移，評(píng)估兩種不同的技術(shù)，一種用機(jī)械分離而一種用酶促分離。相對(duì)于酶處理的培養(yǎng)物，機(jī)械分離使細(xì)胞對(duì)MatrigelTM產(chǎn)生更有效的粘附和更快速的增殖。當(dāng)機(jī)械分離與酶促分離(圖5)進(jìn)行比較時(shí)，在涂覆2天后觀察到顯著更高的存活集落的數(shù)目。對(duì)通過(guò)兩種不同技術(shù)分離后分別在MatrigelTM上產(chǎn)生的所有集落的總面積進(jìn)行比較(PO.001)。此外，在涂覆6天后與酶促分離的培養(yǎng)物相比機(jī)械分離的培養(yǎng)物中總集落面積顯著增加(P=0.036)。無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例3對(duì)培養(yǎng)在MatrigelTM上的hBS細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)和傳代在所有實(shí)驗(yàn)中使用4種不同的細(xì)胞系SA002、AS038、SA121和SA167。將所述細(xì)胞系在MatrigelTM上培養(yǎng)至35代并且甚至在冷凍/解凍周期后所述形態(tài)學(xué)外貌和其它hBS特征保持不變。所有培養(yǎng)物由不具有分化的形態(tài)學(xué)標(biāo)記的充分確定的hBS細(xì)胞集落構(gòu)成。在約3-6天后通過(guò)取走培養(yǎng)基對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行傳代并且在各小孔中加入lml膠原酶IV"00單位/ml)溶液并溫育15-20分鐘。為了幫助細(xì)胞從表面分離出來(lái)，進(jìn)行機(jī)械分離，接著進(jìn)行另外15分鐘的溫育。然后洗滌所述細(xì)胞，重新懸浮于k-VitroHESTM培養(yǎng)基中并以1:2至1:6的分隔比例接種在MatrigelTM上。每隔5至6天對(duì)所述hBS培養(yǎng)物進(jìn)行傳代并在每次傳代的第二至第三天更換培養(yǎng)基。無(wú)匈#*^《遂辨3^潛^觀察到在建立在Matrige「M上的hBS細(xì)胞傳代過(guò)程中，需要使用膠原酶IV的酶處理方法將集落從表面分離。相對(duì)于機(jī)械分離，在接種后發(fā)現(xiàn)傳代過(guò)程中酶促處理也使得繁殖速度增加。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例4培養(yǎng)在MatrigelTM上的hBS細(xì)胞的冷凍保存和解凍在冷凍前用膠原酶IV對(duì)4種不同的細(xì)胞系SA002、AS038、SA121和SA167處理20-30分鐘以將所述細(xì)胞相互分開(kāi)。離心后將所述細(xì)胞以每ml冷凍培養(yǎng)基含一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的濃度轉(zhuǎn)移至冷凍培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基含有包含10%DMSO，30%血清替代物和4ng/ml的bFgF的VitroHESTM-培養(yǎng)基。最終獲得的細(xì)胞懸浮液是單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的混合物。在長(zhǎng)期在液氮中貯藏前將冷凍管(0.5-1.0ml細(xì)胞懸浮物)快速轉(zhuǎn)移至Nalgene冷凍容器中于-80。C下貯存過(guò)夜或至少貯存2小時(shí)。ims細(xì)應(yīng)的席^在通過(guò)將冷凍管放入37°C水浴鍋中直至所有細(xì)胞懸浮物解凍來(lái)進(jìn)行解凍之前必須制備k-VitroHESTM-培養(yǎng)基并進(jìn)行預(yù)熱。離心(400G5分鐘)前將所述細(xì)胞懸浮物轉(zhuǎn)移至預(yù)熱的培養(yǎng)基中進(jìn)行5分鐘。通過(guò)加入lmlk-VitroHESTM-培養(yǎng)基至小孔中對(duì)Matrigel薄層覆蓋(BD)的小孔進(jìn)行再水化并于37°C下溫育30分鐘。將所述細(xì)胞沉淀在k-VitroHESTM-培養(yǎng)基中重新懸浮并轉(zhuǎn)移至24-或6-孔Matrigel板中。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例5無(wú)伺養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞的表征43在建立在Matrigel上后和經(jīng)過(guò)冷凍/解凍周期后進(jìn)行所有表征實(shí)驗(yàn)。^瘦勿應(yīng)必夢(mèng)如上所述對(duì)所述培養(yǎng)物進(jìn)行傳代，接種至6-或24-孔MatrigelTM板上并在進(jìn)行免疫染色前培養(yǎng)6天。用PBS洗涂所述培養(yǎng)物，在室溫下用4%甲醛(HistoLab，Gothenburg,Sweden)固定15分鐘，接著又在PBS中洗滌3次。所使用的單克隆一抗是抗SSEA-1、-3和-4(1:200;DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa，IowaCity,IA)、Tra-1-60、Tra-1-81(1:200;SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)的抗體，和多克隆兔抗磷酸組蛋白H3(1:150;KeLab，Upstate)。在使用合適的Cy3-或FITC綴合的二抗(1:300;JacksonimmunoResearchlaboratories,WestGrove,PA)進(jìn)行顯示之前將所述一抗于4。C下孵育過(guò)夜。同樣在室溫下以終濃度為0.5ng/ml的4，-6，二氨基畫(huà)2-苯基吲咮(DAPA;Sigma-AldrichSwedenAB，Stockholm，瑞典)對(duì)培養(yǎng)物溫育5分鐘以顯現(xiàn)所有細(xì)胞核。漂洗染色的培養(yǎng)物并使用DAKO熒光封固介質(zhì)(DakopattsAB，Alvsjd，Sweden)進(jìn)行封固并在倒置熒光顯微鏡(NikonEclipseTE2000-U)下進(jìn)行觀察。根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使用商業(yè)購(gòu)得的試劑盒(Sigma-Aldrich)對(duì)Matrigel培養(yǎng)的hBS細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶(AP)染色。端在躇活遂收獲、裂解Matrigel培養(yǎng)的hBS細(xì)胞并且根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)通過(guò)基于PCR的ELISA方法(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim,Germany)分析端粒酶活性。核型為、浙和^FXS好將用于核型分析的MatrigelTM繁殖的hBS細(xì)胞在秋7jC仙素(0.1ng/ml,Invitrogen，Carisbad，CA，USA)中溫育1至3小時(shí)、分離、固定、封固于載玻片上并通過(guò)使用改進(jìn)的Wrights染色(#WS-32，Sigma)顯示染色體。如前面所述制備中期相的板(plates)。為進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)分析，按照廠商說(shuō)明書(shū)使用商業(yè)購(gòu)的含有用于染色體13、18、21和性染色體(X和Y)的探針的試劑盒(MultiVysionTMPBMulticolourProbePanel;Vysis,Inc.,DownersGrove,IL)。使用裝配有合適濾鏡和軟件(CytoVision，AppliedImaging,SantaClara,CA)的倒置顯微鏡分析載片。為進(jìn)行畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)，使用免疫缺陷SCID小鼠(C.B-17/lcrCro曙scidBR，CharlesRiverLaboratories,德國(guó))。通過(guò)寸吏用膠原酶IV(200單位/ml)將MatrigelTM繁殖的hBS細(xì)胞集落酶促地從表面分離開(kāi)，機(jī)械地分割成小的細(xì)胞聚集體并以每個(gè)器官約50000至100000個(gè)細(xì)胞的量注射到腎囊下。用cryo-PBS注射液或來(lái)自同胎生下的小鼠初生腦細(xì)胞處理對(duì)照動(dòng)物。注射后經(jīng)八周殺死所述動(dòng)物并將腫瘤迅速固定在4%的多聚曱醛溶液中并用石蠟包埋。將所迷畸胎瘤切成8nm的切片并用AlcianBlue/VanGiesson染色以進(jìn)行組織學(xué)分析。0"々4S^及rCi為、浙:根據(jù)廠商說(shuō)明書(shū)使用RneasyMini試劑盒(Qiagen)分離來(lái)自所有4種MatrigelTM培養(yǎng)的hBS細(xì)胞系的總RNA。使用AMVFirstStrandcDNASynthesis試劑盒(Roche)從l^ig總RNA中合成eDNA并且使用PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen)進(jìn)行PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)包括四步最初的下降循環(huán)，所述下降循環(huán)在每個(gè)退火溫度上重復(fù)兩次循環(huán)，在94。C變性15秒，在66。C至60。C退火15秒并且在72°C延伸30秒。接下來(lái)的循環(huán)包括35個(gè)退火溫度為58。C的重復(fù)。在前面描述了用于Oct-4的正向和反向引物序列。B肌動(dòng)蛋白引物用作內(nèi)對(duì)照(正義，5-TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，反義，5國(guó)GCACAGCTTCTCCTTAATGTC國(guó)ACGC-3';400bp產(chǎn)物)。使用1.5%的瓊脂糖凝膠通過(guò)凝膠電泳將所述PCR產(chǎn)物按大小進(jìn)行分離。使用人肝臟作為PCR反應(yīng)的正對(duì)照和使用水作為負(fù)對(duì)照。^匈#*應(yīng)《滋浙4和5W潛果通過(guò)使用冷凍保存技術(shù)冷凍和解凍細(xì)胞系SA002、AS038、SA121和SA167以觀察是否可發(fā)現(xiàn)任何特征變化。解凍后所有四種細(xì)胞系都存活并開(kāi)始以類似的模式生長(zhǎng)在覆蓋有Matrigel的培養(yǎng)皿上。在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下的四種不同的hBS細(xì)胞系的多能性和維持性得以驗(yàn)證并且與前面的各細(xì)胞系在銅養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)下的結(jié)果進(jìn)行比較。45通過(guò)對(duì)形態(tài)學(xué)、未分化標(biāo)記的表達(dá)、端粒酶活性、核型和體內(nèi)分化進(jìn)行考察以描述這些特征。2^逸。敏/么^:與用抗SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-6-和TRA-1-80抗體染色(顯示出與多能性hBS細(xì)胞相符的清晰的陽(yáng)性免疫反應(yīng))相反，在所有無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞系中SSEA-1表達(dá)呈陰性。此外，所有四種MatrigelTM繁殖的細(xì)胞系中的細(xì)胞都展現(xiàn)高水平的AP反應(yīng)性。裙在雜承^:在三種MatrigelTM培養(yǎng)的細(xì)胞系(AS038、SA121和SA167)中進(jìn)行分析。培養(yǎng)在Matrigel中的hBS細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)具有高水平的端粒酶活性。裙《》^f和F/Si/:在其中兩種MatrigelTM培養(yǎng)的細(xì)胞系A(chǔ)S038和SA121中進(jìn)行核型分析。來(lái)自細(xì)胞系A(chǔ)S038的3個(gè)細(xì)胞中的3個(gè)和來(lái)自細(xì)胞系SA121的12個(gè)細(xì)胞中的10個(gè)發(fā)現(xiàn)具有正常的人46，XY核型(圖.IO)。來(lái)自SA121細(xì)胞系的剩余2個(gè)細(xì)胞表現(xiàn)出45，XY和42，XY的異常核型。盡管如此，對(duì)于飼養(yǎng)細(xì)胞和無(wú)伺養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞來(lái)說(shuō)，在長(zhǎng)期培養(yǎng)后核型的變化似乎是正常發(fā)生的事件。在本研究中詞養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞的核型分析與MatrigelTM"^殖后的結(jié)果相似，暗示著在這些無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下hBS細(xì)胞核型保持正常和穩(wěn)定。在其中兩個(gè)MatrigelTM繁殖的細(xì)胞系(SA(XY)和SA167(XX))中進(jìn)行FISH分析。對(duì)染色體X、Y、18、13和21進(jìn)行分析。對(duì)于兩個(gè)接受檢驗(yàn)的細(xì)胞系至少93%是正常的。來(lái)自FISH分析的結(jié)果與來(lái)自飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞系的結(jié)果相似。使用兩個(gè)MatrigelTM培養(yǎng)的hBS細(xì)胞系SA167和SA002形成畸胎瘤，并且結(jié)果顯示形成的畸胎瘤由代表來(lái)自所有三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的分化的細(xì)胞和組織構(gòu)成，提供了MatrigelTM繁殖的hBS培養(yǎng)物具有保持其多能性的證據(jù)。^Mt這Oct-4在所有四種培養(yǎng)在MatrigelTM上的細(xì)胞系中高度表達(dá)。46無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞實(shí)施例6在MatrigelTM涂覆的板中培養(yǎng)在無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞條件下的hBS細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)與培養(yǎng)在胚胎小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上的hBS細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)的比較將細(xì)胞系SA121同時(shí)培養(yǎng)在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下的MatrigelTM涂覆的板中和培養(yǎng)在胚胎小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行3天。然后通過(guò)磷酸化的組蛋白H3的核免疫反應(yīng)性對(duì)有絲分裂的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行定量。對(duì)兩種培養(yǎng)物中的有絲分裂指數(shù)進(jìn)行計(jì)算以比較無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞和飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的hBS細(xì)胞之間的生長(zhǎng)速度。稀虞與飼養(yǎng)層條件相比，培養(yǎng)在無(wú)祠養(yǎng)細(xì)胞(MatrigelTM)下的培養(yǎng)物具有相似的有絲分裂指數(shù)。無(wú)伺養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物增倍的時(shí)間與飼養(yǎng)細(xì)胞繁殖的hBS細(xì)胞的大致相同(約35小時(shí))。4權(quán)利要求1.用于細(xì)胞玻璃化的方法，包括i)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第一種溶液(溶液A)中，ii)任選地在第一種溶液中溫育所述細(xì)胞，iii)將步驟i)或ii)中獲得的所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第二種溶液(溶液B)中，iv)任選地在第二種溶液中溫育所述細(xì)胞，v)將從步驟iii)或iv)中獲得的所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)具有允許可在其中包含至少20μl體積大小的閉合吸管，vi)封閉所述一個(gè)或多個(gè)閉合吸管，和vii)玻璃化一個(gè)或多個(gè)閉合吸管。2.權(quán)利要求l的方法，其中所述閉合吸管的大小允許具有的體積從約20^1至約250nl，例如從約20|nl至約225nl、從約25pl至約200nl、從約25|xl至約175fd、從約25pl至約150fil、從約30fil至約125^1、從約30^1至約100nl、從約35^1至約75pl、從約40^1至約50nl。3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是BS細(xì)胞或BS細(xì)胞系。4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是hBS細(xì)胞或hBS細(xì)胞系。5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二種溶液中至少一種包含一種或多種冷凍保護(hù)劑。6.權(quán)利要求5的方法，其中一種或多種冷凍保護(hù)劑選自甘油、海藻糖、蔗糖、1，2-亞乙基二醇、DMSO、丙二醇和/或其混合物。7.權(quán)利要求5或6中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二種溶液包含一種或多種相同或不同的冷凍保護(hù)劑。8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的方法，其中在所述第一和第二種溶液中的一種或多種冷凍保護(hù)劑的濃度相同或不同。9.權(quán)利要求5-8中任一項(xiàng)的方法，其中在所述第二種溶液中冷凍保護(hù)劑的總濃度(按。/dv/v、％w/v或M計(jì)算)大于在所述第一種溶液中的濃度。10.權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述冷凍保護(hù)劑是海藻糖。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述海藻糖的濃度從約0.02M至約1M，例如從約0.05M至約0.9M，從約0.1M至約0.8M，從約0.2M至約0.7M，從約0.3M至約0.65M,從約0.4M至約0.6M，從約0.45M至約0.55M。12.權(quán)利要求5-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述冷凍保護(hù)劑是蔗糖。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述蔗糖的濃度在從約0.02M至約1M，例如從約0.05M至約0.9M,從約0.1M至約0.8M,從約0.2M至約0.7M，從約0.3M至約0.65M，從約0.4M至約0.6M,從約0.45M至約0.55M。14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在所述第一和第二種溶液中至少一種包含粘度調(diào)節(jié)劑。15.權(quán)利要求14的方法，其中所述粘度調(diào)節(jié)劑選自菲可、珀可、透明質(zhì)酸、清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸、明膠和甘油。16.權(quán)利要求14或15的方法，其中所述粘度調(diào)節(jié)劑是菲可。17.權(quán)利要求16的方法，其中菲可的濃度至多是約150mg/ml，例如至多約為100mg/ml，至多約為50mg/ml，至多約為25mg/ml，至多約為15mg/ml或至多約為10mg/ml。18.權(quán)利要求14-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二種溶液包含一種或多種相同或不同的粘度調(diào)節(jié)劑。19.權(quán)利要求14-18中任一項(xiàng)的方法，其中在所述第一和第二種溶液中的一種或多種粘度調(diào)節(jié)劑的濃度相同或不同。20.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一和第二種溶液中至少有一種是水性溶液。21.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中包括步驟ii)。22.權(quán)利要求21的方法，其中在約37。C下進(jìn)行從5秒至約20分鐘之間的溫育例如，從約10秒至約15分鐘，從約15秒至約10分鐘，從約20秒至約7.5分鐘，從約30秒至約5分鐘，從約40秒至約4分鐘，從約50秒至約3分鐘，從約30秒至約2分鐘，從約45秒至約1.5分鐘或約l分鐘。23.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中包括步驟iv)。24.權(quán)利要求23的方法，其中在約37。C下進(jìn)行從5秒至約10分鐘之間的溫育，例如，從約10秒至約7.5分鐘，從約10秒至約5分鐘，從約15秒至約4分鐘，從約15秒至約3分鐘，從約15秒至約2分鐘，從約20秒至約1分鐘，從約5秒至約1分鐘，從約5秒至約30秒或從約10秒至約30秒。25.權(quán)利要求23或24的方法，其中所在約37°C下進(jìn)行溫育約30秒或更短時(shí)間。26.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中約50%或更多例如，約55%或更多，約60%或更多，約65%或更多，約70%或更多，約75%或更多，約80%或更多，約85%或更多，約90%或更多或約95%或更多的細(xì)胞在去玻璃化后和培養(yǎng)在合適的培養(yǎng)基上后有生活力。27.—種細(xì)胞，通過(guò)權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)中所定義的方法對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行玻璃化。28.權(quán)利要求1-26中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括通過(guò)包含下列步驟的方法進(jìn)行去玻璃化viii)將一支或更多支玻璃化的閉合吸管置于具有溫度從約室溫至約40°C的環(huán)境中進(jìn)行一段時(shí)間以使閉合吸管中的內(nèi)容物解凍，ix)打開(kāi)一支或多支閉合吸管，x)使用所述第三種溶液(溶液C)對(duì)包含在一支或多支打開(kāi)的閉合吸管中的細(xì)胞進(jìn)行洗滌流程，xi)任選地將獲自步驟x)的洗滌后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第四種溶液(溶液D)中，并xii)任選地將所述細(xì)胞在第四種溶液中溫育，xiii)任選地從所述第四種溶液中轉(zhuǎn)移來(lái)自xii)的細(xì)胞并將所述細(xì)胞接種在飼養(yǎng)細(xì)胞上，和xiv)任選地進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞。29.權(quán)利要求28的方法包括步驟xi)、xii)和xiv)。30.權(quán)利要求29的方法，進(jìn)一步包括步驟xii)。31.權(quán)利要求28-30中任一項(xiàng)的方法，其中所述第三和/或第四(如果相關(guān))溶液包含一種或多種冷凍保護(hù)劑。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述一種或多種冷凍保護(hù)劑選自甘油、海藻糖、蔗糖、1,2-亞乙基二醇、DMSO、丙二醇和或其混合物。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述一種或多種冷凍保護(hù)劑是甘油、海藻糖、蔗糖或其混合物。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述冷凍保護(hù)劑的濃度是從約0.02M至1M,例如從約0.05M至約0.9M，從約0.1M至約0.8M，從約0.1M至約0.7M，從約0.1M至約0.6M,從約0.15M至約0.5M,從約0.2M至約0.4M。35.權(quán)利要求28-34中任一項(xiàng)的方法，其中如果相關(guān)，所述第三種溶液中冷凍保護(hù)劑的濃度高于所述第四種溶液中冷凍保護(hù)劑的濃度。全文摘要用于生物學(xué)細(xì)胞，特別是胚泡來(lái)源的干細(xì)胞(BS細(xì)胞)玻璃化的改進(jìn)方法。所述方法對(duì)在解凍后保持生活力的細(xì)胞非常溫和。所述方法包括，i)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第一種溶液(溶液A)中，ii)任選地在第一種溶液中溫育所述細(xì)胞，iii)將步驟i)或ii)中獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至第二種溶液(溶液B)中，iv)任選地在第二種溶液中溫育所述細(xì)胞，v)將從步驟iii)或iv)中獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至一個(gè)或多個(gè)具有允許可在其中包含至少20μl體積大小的閉合吸管，vi)封閉所述一個(gè)或多個(gè)閉合吸管，和vii)玻璃化一個(gè)或多個(gè)閉合吸管。本發(fā)明的重要特征在使用閉合吸管以及可被有效地玻璃化和隨后被解凍的相對(duì)較大的體積。文檔編號(hào)C12N5/08GK101497873SQ20081016678公開(kāi)日2009年8月5日申請(qǐng)日期2004年5月10日優(yōu)先權(quán)日2003年5月8日發(fā)明者A·舍格倫,E·舍格倫-詹森,P·埃里克森,S·埃內(nèi)巴克申請(qǐng)人:塞拉提斯股份公司