專利名稱：一種由Pseudoalteromonas sp.MYX44生產(chǎn)的к-卡拉膠酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物技術(shù)
背景技術(shù)：
有關(guān)卡拉膠酶的報(bào)道并不多見。早在1943年，Mori就從海洋軟體動(dòng)物中提取到能夠水解角叉菜卡拉膠的酶。海洋假單胞菌Pseudomonas carrageenovora是最早研究的能夠產(chǎn)生卡拉膠酶的微生物。該酶在對k-卡拉膠降解的過程中，使其粘度迅速下降，還原糖含量增加，降解產(chǎn)物以4-硫酸-新卡拉二糖為主。現(xiàn)在已經(jīng)在假單胞菌、噬纖維菌屬Cytophaga、別單胞菌屬A. carrageenovora及某些未鑒定菌種中發(fā)現(xiàn)到卡拉膠降解酶。Luk，yanov等(1994)從紅藻Chondrus， Polysiphonia， Tichocarpus等分離至lj 100株細(xì)菌，其中25株菌具有卡拉膠降解活性。 目前的研究已經(jīng)確定k _卡拉膠酶屬于16族糖苷水解酶，k _卡拉膠酶的分類號E.C. 3. 2. 1.83，為專一性內(nèi)切酶，專門水解a-3，6-內(nèi)醚-D-半乳糖和P-4-硫酸-D-半乳糖之間的P-l，4-糖苷鍵。Sarwar等1987年報(bào)道用2216E培養(yǎng)基添加商業(yè)0. 1%卡拉膠培養(yǎng)海洋細(xì)菌Cytophaga sp. lk_C783，分離胞外卡拉膠酶。用硫酸銨沉淀、離子交換色譜、凝膠過濾色譜純化得到k -卡拉膠酶，純化的酶分子量用SDS/PAGE電泳測定為100kDa。Potin等1991年報(bào)道從紅葉藻屬(Delesseria sanguinea)分離了一株能夠降解不同硫酸化的半乳糖聚合物(瓊膠或卡拉膠)的細(xì)菌，用硫酸銨、凝膠過濾色譜(S印hacryl S-200HR)、離子色譜(DEAE-S印harose-CL6B)純化k -卡拉膠酶，用SDS/PAGE電泳檢測為單一蛋白質(zhì)。測定酶分子量為40kDa。 Araki(1999)從海藻表面分離到k-卡拉膠酶產(chǎn)生菌一海洋弧菌CA-1004，通過硫酸銨鹽析和層析技術(shù)使從發(fā)酵液中分離的卡拉膠酶純化分子量為35kDa。 pl和Km值分別達(dá)到9. 2和3. 3mg/ml。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種來源于海水的菌株P(guān)seudoalteromonas sp. MYX44并利用該菌株制備的k-卡拉膠酶以及相關(guān)的酶學(xué)性質(zhì)。 本發(fā)明分離純化出一株來源于海水的菌株P(guān)seudoalteromonas sp.MYX44，其具有產(chǎn)生k-卡拉膠酶的特性，保藏單位中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號為CCTCC M 207151。保藏日期2007年9月25日.保藏單位地址中國武漢，武漢大學(xué).發(fā)明的特點(diǎn)是 首次分離出產(chǎn)k -卡拉膠酶Pseudoalteromonassp. MYX44菌株。該菌株為不產(chǎn)孢子的桿狀，革蘭氏陰性。不抗酸，沒有莢膜，氧化酶陽性，無色素。0. 8-1. 2 ii mX 1. 8-2. 2 y m，端生單鞭毛。該菌株來源于海水，為氧化型糖代謝，3%和7% NaCl胨水中生長良好，經(jīng)過生理生化特征和16S r DNA基因序列測定鑒定為Pseudoalteromonas序列表l，但是未能給出具體種，暫命名Pseudoalteromonas sp. MYX44。為此菌株在2216E培養(yǎng)基上26。C培養(yǎng)24h形成單菌落，菌落乳白色，圓形，邊緣整齊。該菌株具有營養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)28h，其發(fā)酵液中k-卡拉膠酶的活力達(dá)到最高(32°CT 測定)。用本發(fā)明的菌株作為k -卡拉膠酶的生產(chǎn)菌株，具有產(chǎn)品的活性高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn) 周期短、成本低的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。通過酶的分離純化，將純化的酶蛋白單一組 分進(jìn)行N端測序得到20個(gè)氨基酸的序列經(jīng)檢索不同于已經(jīng)報(bào)告的k-卡拉膠酶。判定其 為一個(gè)新的k-卡拉膠酶。


純化的k-卡拉膠酶SDS-PAGE電泳結(jié)果。左邊為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，右邊為 Pseudoalteromonas sp. MYX44生產(chǎn)的k -卡拉膠酶純酶單帶，表示數(shù)量單位為kDa。
具體實(shí)施例方式1.菌株的分離純化 本發(fā)明Phyllobacterium sp. nov. 921F菌株的獲得從黃海水域采集海水樣品， 加入到裝有25ml富集培養(yǎng)基(蔗糖2g， NaN03lg， K2HP040. 5g， MgS040. 5g， NH4C1 0. 5g， FeS040. Olg， H20 lOOOml， pH7. 2)的三角瓶中，30°C ， 160r/mim搖瓶培養(yǎng)3d。然后將富集培 養(yǎng)液用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后，取0. 2ml涂布初篩分離培養(yǎng)基(蛋白胨10g，豆粉1. 0g， NaC114. 0g，KH2P04l. 0g，CaCl20. lg，瓊脂15. 0g，H20 1000mL，pH 10.0。)平板。30。C倒置培 養(yǎng)48h，獲得選取平板上有液化性狀的白色菌落，得到一株能產(chǎn)k-卡拉膠酶的細(xì)菌。
2.菌株的鑒定將分離得到是菌株經(jīng)過16S r DNA基因序列測序結(jié)果GGCCGGTTGAGATTGCTCCGAT
AAGTCCGGAAGTGCCCGCACCACTTGTGAGT 根據(jù)測定結(jié)果鑒定為Pseudoalteromonas,但是未能給出具體種，暫命名 Pseudoalteromonas sp. MYX44。為此菌株在2216E培養(yǎng)基上26。C培養(yǎng)24h形成單菌落，菌
5落乳白色，圓形，邊緣整齊。該菌株具有營養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。
3.制備酶 將Pseudoalteromonas sp. MYX44菌株用液體2216E培養(yǎng)基活化后，以7%的接種 量接入到裝有75mL發(fā)酵培養(yǎng)基(含有O. 1% k _卡拉膠的2216￡培養(yǎng)基去除瓊膠)的250mL 三角瓶中，26t:搖瓶培養(yǎng)28h，培養(yǎng)液4t:下3000rpm將酶發(fā)酵液冷凍離心3500rpm、5min，上 清液加入硫酸銨使飽和度達(dá)到30%，析出的雜蛋白質(zhì)經(jīng)高速離心(7，000rpm)去掉，上清液 繼續(xù)加入硫酸銨使飽和度達(dá)到80%，析出的蛋白質(zhì)經(jīng)高速離心(7，000rpm)回收，作為粗酶 用于進(jìn)一步純化。
4.純化酶 將粗酶液分散，以含有0. 025M Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)進(jìn)行透析，每隔4h更換 一次透析外液，用BaCl2檢查透析外液是否含有硫酸根，直至無硫酸根檢出。將透析好的酶 液加樣于S印hadex G-200凝膠層析柱，洗脫液0. 025M Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)，在280nm 下檢測蛋白峰，DNS法測酶活，收集有活性的蛋白，進(jìn)行下一步純化。將S印hadex G-200 層析柱部分純化后的活性蛋白加樣于CM-cellulose 52柱，洗脫液為含有0_1. 0M NaCl的 25mMNa2HP04-NaH2P04(pH7. 2)緩沖液，在280nm下檢測蛋白峰，DNS法測酶活后收集有活性 的蛋白。直至獲得單一電泳純的酶組分，用于以下步驟的測定。
5.酶分子量測定 用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)技術(shù)確定k-卡拉膠酶的分子量。具體方法 是試劑準(zhǔn)備 (1) 、30%儲備膠溶液丙烯酰胺(Acr)29. Og，亞甲雙丙烯酰胺(Bis) 1. Og，混勻后 加H20， 370C溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室溫。 (2)、1.5M Tris-HCl (pH 8.0) :Tris 18. 17g加H20溶解，濃鹽酸調(diào)pH至8. 0，定容 至100ml。 (3)、1M Tris-HCl (pH 6.8) :Tris 12. llg加H20溶解，濃鹽酸調(diào)pH至6. 8，定容至 100ml 。 (4)、10% SDS :電泳級SDS 10. Og加H20 68。C助溶，濃鹽酸調(diào)至pH 7. 2，定容至 100ml 。 (5)、電泳緩沖液(pH 8. 3) :Tris 3. 02g，甘氨酸18. 8g， 10% SDS 10ml加ddH20溶 解，定容至100ml 。 (6) 、10%過硫酸銨(AP) :lgAP加H20至10ml 。 (7)、2' SDS電泳上樣緩沖液1M Tris-HCl(pH 6. 8) 2. 5ml， b_巰基乙醇1. Oml， SDS 0.6g，甘油2. Oml，O. 1%溴酚蘭1. Oml， H20 3.5ml。 (8)、考馬斯亮蘭染色液考馬斯亮蘭0. 25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml， H20 225ml 。 (9)、脫色液甲醇、冰醋酸、1120以3 : 1 : 6配制而成。 操作步驟采用垂直式電泳槽裝置 (1)、聚丙烯酰胺凝膠的配制 ①分離膠(10% )的配制 H20 4. Oml 30%儲備膠3.3ml
1. 5M Tris-HCl 2. 5ml
10% SDS 0. 1ml
10% AP 0. 1ml取lml上述混合液，加TEMED(N，N，N'，N'-四甲基乙二胺)lOiil封底，余加TEMED
4iU，混勻后灌入玻璃板間，以水封頂，注意使液面平。(凝膠完全聚合需30-60min) ②積層膠(4% )的配制 ddH20 1.4ml 30%儲備膠0.33ml 1M Tris-HCl 0. 25ml 10% SDS 0. 02ml 10% AP 0. 02ml TEMED 2 ii 1 將分離膠上的水倒去，加入上述混合液，立即將梳子插入玻璃板間，完全聚合需 15-30min。 (2)、樣品處理將樣品加入等量的2XSDS上樣緩沖液，IO(TC加熱3-5min，離心 12000gX lmin，取上清作SDS-PAGE分析，同時(shí)將SDS低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作平行處理。
(3)、上樣取10ia誘導(dǎo)與未誘導(dǎo)的處理后的樣品加入樣品池中，并加入20iil低 分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品作對照。 (4)、電泳在電泳槽中加入電泳緩沖液，連接電源，負(fù)極在上，正極在下，電泳時(shí)， 積層膠電壓60V，分離膠電壓IOOV，電泳至溴酚蘭行至電泳槽下端停止(約需3hr)。
(5)、染色將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮蘭染色液染色，室溫4-6hr。
(6)、脫色將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。
(7)、凝膠攝像和保存在圖像處理系統(tǒng)下將脫色好的凝膠攝像，結(jié)果存于軟盤中， 凝膠可保存于雙蒸水中或7%乙酸溶液中。將樣品加入2倍濃度的Sample Buffer中，在 沸水浴中加熱5min變性，取出冷卻后進(jìn)行電泳。固定后，用考馬斯亮藍(lán)R250進(jìn)行染色。標(biāo) 準(zhǔn)蛋白是Phosphorylase B :97， 4kDa ;Bovine serum albumin(BSA) :66kDa ;Ovalbumin : 43kDa scarbonicanhydrase :31kDa trypsin inhibitor (20. lkDa)禾口 lysosyme(14. 4kDa)。 電泳后，測定各樣品從開始電泳的位置起移動(dòng)的距離，將它們相對全長的比例和各標(biāo)準(zhǔn)蛋 白質(zhì)分子量的，計(jì)算此酶的分子量為SDS-PAGE上顯示的分子量為35kDa(見圖1)。
6.酶蛋白的等電點(diǎn)測定用等點(diǎn)聚焦電泳測定酶蛋白的等電點(diǎn)。
(1)、材料蛋白樣品
(2)、試劑 聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、兩性電解質(zhì)、尿素、NP40、 teiton-100 電極液1M磷酸(陽極液)、1M氫氧化鈉(陰極液) 固定液100g三氯乙酸、10g磺基水楊酸溶于500ml，定容為1000ml 染色液0. 35g考馬斯亮藍(lán)R-150溶于300ml脫色液中，加熱到60-70。C，加入0. 3g
硫酸銅。 脫色液25%乙醇、8%冰乙酸溶于水樣品緩沖液1% Ampholine、2% Triton X-100、9M尿素
(3)、操作步驟
①樣品制備 用IEF樣品緩沖液提取待分析樣品，如其他緩沖液提取的樣品則應(yīng)透析后，冷凍 干燥、再復(fù)溶于IEF樣品緩沖液。充分溶解后，離心去除不溶雜質(zhì)。
②制模具 洗干凈兩塊IEF專用玻璃板，進(jìn)行硅化和反硅化處理，兩塊玻璃板的硅化和反硅 化面相對，放上夾條，夾子夾好。 ③配膠膠液組成6ml膠母液(10 %，19/1) ;6-8 %尿素；lml Ampholine(pH3. 5-10) ;60_80ull0% AP ;
5ul TEMED 灌膠配好的膠迅速灌入模具 ⑤電泳等膠凝固后，小心揭去上下玻璃板，將塑料墊片底部擦干，小心放于電泳
槽上。在膠面兩邊各放一根浸透電極緩沖液的電極條。在膠面上任意位置上放上小擦鏡紙
片，在紙片上加樣，蓋上蓋子，功率25W電泳，約10min后，暫停電泳，取下紙片，繼續(xù)電泳約
30min，待電流達(dá)4mA以下，停止電泳。 ⑥表面電極測定蛋白質(zhì)的pl ⑦固定取出塑料片，放入固定液中15min ⑧染色取出塑料片放入染色液中65t:染色，直至條帶出現(xiàn) ⑨結(jié)果根據(jù)Ampholine pH 3. 0-10的有效pH范圍計(jì)算出待測樣品的pl = 8. 5。
7.酶蛋白的N端測序《DNA測序標(biāo)準(zhǔn)方法》(SCI-S-001)依據(jù)Edman降解法原理，即蛋白質(zhì)的自由 a _氨基與PITC(異硫氰酸苯酯)偶聯(lián)后，與之相鄰的第二殘基的肽鍵大為消弱，在無水酸 TFA(三氟乙酸)的作用下發(fā)生特異性的斷裂，暴露出第二殘基的a-氨基，再與PITC反 應(yīng)，循環(huán)往復(fù)地進(jìn)行偶聯(lián)降解反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)受Edman反應(yīng)產(chǎn)率的限制。按照常規(guī)條件進(jìn) 行SDS-PAGE，將電泳完畢的凝膠按照海綿，濾紙，PVDF膜，凝膠，濾紙，海綿的次序?qū)㈦娪≯E 夾層裝好，并放入小型電轉(zhuǎn)槽中，在50V(100-170mA)于室溫下進(jìn)行電印跡轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)間 為2小時(shí)。取出PVDF膜并用去離子水略為漂洗，用甲醇浸泡數(shù)秒鐘，用麗春紅(Ponceau S) 染色。蛋白質(zhì)N末端測序是采用Edman降解法，N端前20位氨基酸殘基的序列由Applied Biosystems公司的PROCISE蛋白質(zhì)測序儀測定。結(jié)果如下 Asn-Pro-Thr-Cys-His-Ile-Ala-Lys-Pro-Gly-Glu-Thr-Thr-Ile-Leu-Gln-Glu-C ys-Arg-Ser簡寫為NPTCH IAKPG ETTIL QECRS。
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權(quán)利要求
一株弧菌Pseudoalteromonas sp.MYX44，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏號為CCTCC M 207151。
2. —株弧菌Pseudoalteromonas sp. MYX44，其16S r DNA基因序列測序結(jié)果是CATGGTG ACTTCAT CACTCTG CCGGTTT GACTTAA TCTCTGG GTGCGGG AAAAACA CCCACGC TTTCACCCGTATTAACTTTCCGGTGCAACTAGGATCCACTTG TGAGT。
3. 權(quán)利要求1所述的菌株在一種由Pseudoalteromonas sp. MYX44生產(chǎn)的k -卡拉膠酶。
4. 權(quán)利要求2所述k-卡拉膠酶，其特征是該酶的分子量為35kD。
5.如權(quán)利要求2所述的K-卡拉膠酶，其特征是該此酶的N端氨基酸序列為 Asn-Pro-Thr-Cys-His-Ile-Ala-Lys-Pro-Gly-Glu-Thr-Thr-Ile-Leu-Gln-Glu-Cys-A rg-Ser簡寫為NPTCH IAKPG ETTIL QECRS。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種來源于海水的菌株P(guān)seudoalteromonas sp.MYX4該菌株具有營養(yǎng)要求范圍廣，容易培養(yǎng)和培養(yǎng)時(shí)間短的特點(diǎn)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)28h，其發(fā)酵液中κ-卡拉膠酶的活力達(dá)到最高(32℃下測定)。用本發(fā)明的菌株作為κ-卡拉膠酶的生產(chǎn)菌株，具有產(chǎn)品的活性高、穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短、成本低的特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/42GK101724577SQ20081017076
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月21日
發(fā)明者江曉路, 牟海津, 馬悅欣 申請人:中國海洋大學(xué)