專利名稱：：用于轉化嗜酸硫桿菌屬細菌的質粒及轉化方法
技術領域：
：本發(fā)明公開了嗜酸硫桿菌屬0^^//"/0&"7勿》細菌，如嗜^lt^til&鐵硫桿菌(爿c/c^力/o6ac/"iAy尸e/T。ar他/5)、嗜酸氧化疏硫桿菌C4c/WM/o6a"7/i/sf力/oo;r他/w1)和嗜酸喜溫疏桿菌C4c/WM/o&"7/iAycaM/力中的功能'l!^t粒。以及利用這些質粒成功轉化嗜酸石俯菌屬細菌，如嗜酸氧"ftJE鐵硫桿菌、嗜酸氧^^^W菌和嗜酸喜^^桿菌的方法。
背景技術：
：嗜酸疏桿菌屬的細菌具有嗜酸、自養(yǎng)和化能無機營養(yǎng)的特點，換言之，它們生活在pH0-4的酸f生環(huán)嫂中，絲源為0)2，能量來源為i&iMt^。嗜酸缺菌屬細菌中有兩種對于生物iM戶具有重要意義，分別是嗜酸氧化亞鐵石缺菌和嗜W^^^踏菌。另夕卜，嗜酸喜i^W菌在生物iM戶^^呈中^^^M^越重要的作用。所謂生物采礦，通常來講，是指利用賴生物^^廣石中提取金屬。其最傳統(tǒng)且重要的表述為生物浸礦，但生物釆礦不只限于該過程，它還包括所涉及M物的監(jiān)^脈干預-這些技^M艮復雜而且是不斷A艮的-及與過程優(yōu)^^目關的實驗室水平研究或^技術的M。中溶^r屬的方法(RawlingsD.E.Microb.CellFact.2005;4(1):13)。當孩性物作用于金屬本身或^^離子(counterion)，釋改目的金屬離子到溶波時，這種作用^Ol接的。另一方面，當孩化物并不將目的金屬或者^if離子作為底物，而是產生加速^mi^斤述金屬溶解的化學環(huán)境，其中或者通4^h質(例如，產生石爐)或者因為其產生氧化劑而最終與幹溶解的鹽分(金屬和M離子)相互作用，這種作用是間接的。屬于嗜酸硫桿菌屬的物種，嗜酸氧化亞鐵石缺菌、嗜酸氧^5J^講菌和嗜酸喜^^踏菌，都能夠產生成分，這些成分利用氧作為電子受絲加^^1^刷^^(例如石;U匕物、元素硫、硫^MMl等等)的氧^ii率。在該過程中，它們產生^t^作為終產物，型如iiLe^ik和石刷VM鹽作為中間產物，其能夠溶解礦石中與確化物相關的金屬，特別狄的是，嗜酸氧化亞鐵-沐菌與某些生物學成分利用氧作為電子受體共同^fci價鐵變成三價鐵。產生的三^4失作為強氧化劑能夠氧^*婦^或其它^f可待氧化的^^。既然嗜酸石餅菌屬細菌如此重要，人們很自然i^想到通ii^立有效的轉化方法對這些細菌進^if傳,，以提高其氧化活性、在其內^目的功能如)^有4^^的:l^生、或更^A^了解^R^^幾制。#^細菌遺傳負荷的最傳統(tǒng)方法是利用轉化過程。該過程是指將目的DM片段直##^到待轉化的#^物中。其中有很多種轉^^支術，最常見的是電穿孔。嗜酸硫桿菌(^/WM/Mac///^s卯.)的所有##都是非常復雜的；既他在實驗室中進4辨#^不是那么簡單。i!A因為該細菌必須^^^l端酸性pH值中，而且其所利用作為底物的礦石也是不清楚的，或者當魁'鐵時*養(yǎng)基中以鹽的形式^i定下來，或者是粒子如元素硫?？捎萌饽縙C^到4feW定物，因為在菌落中可看到m^色的核。另一方面，由于細菌粘附于特定的物質，導綜洗涂階te物量的損失，而洗滌對于^W可^^物^t^bMfP是必需的。由于上述原因，有必^"^^^適的尤其針對這些細菌設計的轉化方法。已經設計了一種轉化方法以成功進^t酸硫桿菌屬細菌如嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、嗜酸氧^^;^菌和嗜酸喜^^危桿菌等的轉化。正如上面^ij的，最常用到的孩逸物轉化方法之一是電穿孑L。電穿孑L^t是利用短暫的高強度放電使細艦暫時^iit化。在細^-h形成瞬時敏的區(qū),結構稱為微孔，載體正是通iiit些區(qū),結構i^細胞。如^f'J用石w匕鐵作為底物，則嗜酸石缺菌屬細菌的電穿孔就變得4攤，因為細菌上亞4組的存在能夠破壞游化載體。另一方面，如W'j用石;il^作為底物，由于粘附于顆粒性物質上的部分細菌會丟失，因》^##;#^在洗滌后減少。但是不僅轉化方法不同，所用的遺傳載體應當具有某些特性使其在細賄功能。其中之一U制^i臺原點(or力。某些情況下它們對不同屬是特異的甚至對特定種是特異的，正因為此，即使我們能夠成功轉化嗜酸石;i^f菌屬細菌，我們也不能實現(xiàn)載體表達，除非我們具有適于嗜酸硫桿菌屬的復制系統(tǒng)。理想地，其需要獲得嗜酸石浙菌屬質粒，而且其復制勤會原點能夠齡到轉化載體上。最^￡具有強啟動子以<呆證目的基因轉錄。到目前為止只^il過很少的嗜酸石納菌質粒，更不用i^^征化了。Rawlings研究了其中的兩種質粒(RawlingsD.E.，2005，Plasmid53:137-147)，^g^殳有描述它們在轉化中的用途。在English的文章(English等人1995，Appl.Environ.Microbiol.,61:3256-3260)中，利用分離的嗜酸中間石樹菌C4c^//^/o6ac27/:w//2fer/z7e力'w5)質粒的復制子和嗜,不勒斯石踏菌"c2V/2Wo&c///wsi7eapo7/"加s)中與^^形絲關的肽的基因構建的栽體電穿孑L^化嗜,不勒斯石;IL^菌。扭種情況下，即使確實肯^jl轉化，*覺不到#蛋白質的表達，所以不能產生成功IHt類型。涉及嗜酸硫桿菌轉^^JII的另一篇文章是Kusano所發(fā)表的(Kusano等人1992，J.Bacteriol.，174:6617-6623),其中對嗜酸氧4緣鐵石餅菌進行了轉化，但并沒有公開該物種的質粒。事實上，作者利用以前從嗜酸氧化亞鐵石Jlt^t菌中分離的^^^M^子鵬r^^子輛建栽體。共電穿孔30個獨立的嗜^^化亞4失石缺菌菌林，但它們中M—個U轉化，效率為每微克載體120-200個^^菌落。這種轉4說率是非常低的，因此并不是合適的轉化方案。實際上，Kusano并沒有其它涉及該技術的研究工作，而且其后來的適用性^i殳有得到驗證，因為B嗜酸石講菌研究組一直沒能重復出Kusano的研究結果。有3篇文章通過利用;^桿菌作為供體以結合方式實現(xiàn)了嗜酸石W菌轉化(Yankofsky等人1983，J.Bacteriol.，153:652-657)，(Jin等人1992，A卯l.Environ,Microbiol.，58:429-430)和(Liu等人2000,J.Bacteriol.，182:2269-2276),一沒有得到,的轉^^t率。總之，在目前的技術^7K平下，既沒有用于嗜酸石缺菌屬細菌轉化的特異功f^t粒，"^殳有能夠實5^效轉化的方法，特別是對于嗜酸氧^^鐵-l^f菌、嗜酸氧"ft^J危桿菌和嗜酸喜S^^f菌。通，建嗜酸硫桿菌屬的特異功能質粒，^Htit^^^^嗜酸》充桿菌的特異轉化方';^f吏這一技林題得到解決，該質粒包含分離的嗜酸氧化亞鐵石沐菌(WenelenDSM16786)和嗜酸氧"j^彭缺菌(LicanantayDSM17318)質粒的復制絲原點(ori)，其連接到從Wenelen(DSM16786)菌抹分離的^i^動子。
發(fā)明內容本發(fā)明公開了能夠成功轉化嗜酸硫桿菌屬細菌如嗜酸氧化亞鐵硫桿菌種、嗜酸氧〗^^充桿菌種和嗜酸喜;^W菌種的質津A^轉化方法。這些質粒包含從嗜酸氧^i^鐵石;^菌中分離的質粒的復制^原點(or力，表示為序列l(wèi)或其反向互補序列，和從嗜酸氧^*彭納菌分離到的質粒的復制粉會原點(or力，表示為序列2或其反向互補序列。還包括從Wenelen(DSM16786)菌林分離的i^f酶的表達啟動子尸"/"Biosigma的'l"錄，表示為序列3。如將在后面描述的尸/2〃啟動子的優(yōu)點(圖3)是其強烈^ii受其調錄因的狄。描述了穿梭型克隆遺傳載體(質粒)，這些栽體包含至少一個序列1和2所示的or/,序列3所示的^啟動子特異用于其它基因的另一個復制起始原點，多克隆位點以U少一個才科eisl報告基因。轉化方法包括對嗜酸硫桿菌的培養(yǎng)M進^^步調整以使它們適于轉^^發(fā)明的質泮立。調節(jié)嗜酸石缺菌培，的pH值到5-7，并且將底物^^M四石ji^。如有必要，可先將底物由減黢亞鐵#^成元素硫怍為中間底物，^4#^5成連四確黢鹽。一_3^#^/在該條件下保彬|定，就利用已知的任何轉^a術尤其是電穿;ui行轉化。附圖簡述圖l.顯示可用于轉化嗜酸硫桿菌屬細菌的伏itii傳載體圖鐠。該圖譜顯示了pUCor/;本發(fā)明的or/1或2;帶有其自身啟動子的賦予卡那霉素Uan)拔(t的基因，戶h/r，帶有其自身啟動子的lacZ基因，和多克隆位點，包括戶""啟動子;5U且氨艇(His6)的MCS。具有本發(fā)明or/1的裁/M"應于pBM-3PnH,而具有本發(fā)明or/2的裁/^Mt應于pBM-4PnH。圖2.顯示多克隆位點序列，顯示MCS中的戶/7"啟動子，多克隆限制性位點和6個^組氨^列。圖3.顯^H古克隆^"發(fā)明載體中的蛋白質^i情況的^^片。嗜^化亞鐵石俯菌ourWenelen(DSM16786)菌林的銅藍蛋白基因作為克隆基因被^^到pBM-3PnH⑧載體上。該載體用于轉化;U^桿菌DH5oc培養(yǎng)物，克隆的蛋白質隨后利用組氨酸親和柱(NTA-瓊脂糖)進行純化。作為陰性對照，用不帶有所述克隆基因的pBM-3PnH⑧載體轉化;U^桿菌DH5ct培^^。由化學Mwestern-blot;^r測純化產物，其利用能識別六組氨齡列的特異*，經化學^jfe^;W自顯影洗滌顯影。泳道1和2分別對應于用含有嗜^IU匕亞鐵石tt1菌銅藍蛋白基因構建##化的兩個^桿菌DH5ct克隆的純4緣。泳道3顯示僅轉化了pBM-3PnH⑧栽體的;t^桿菌克隆陰'^ft照。結論在pBM-3PnH⑧載體中M^^到克隆的銅藍蛋白高^Ji。這證明化"啟動子強力^ii其調控基因的表l圖4.顯示對應于選擇平^Ji嗜酸氧化亞鐵石j^菌轉^/^的兩個培養(yǎng)平板照片。用咱^有卡那霉素拔1"生基因的pBM-3PnH@質津1#化嗜酸氧化亞4失石納菌培養(yǎng)物。平板A.對應于涂布在不#那霉素且pH5.5DOP的培養(yǎng)基中的轉^^，其最初從kan50|ig/mLpH5.5DOP篩選的具有pBM-3PnH⑧的轉4tS^獲得。平板B.對應于在含有卡那霉素平板的影印，kan50Mg/mL,pH5.5D0P。結論在兩個平紅都M^到轉化的菌落生長，表明本發(fā)明的轉化方法是成功的。只負MLA平紅生長的菌落為不穩(wěn)定的轉4沐。共得到4個穩(wěn)定轉化體。圖5.顯示來自轉化的嗜酸氧化亞鐵石浙菌^^養(yǎng)物的質粒DNA提取物的凝顏、片。泳道1和泳道2分別上樣10juL和20jnL提和^^,泳道3和泳道4分別對應100bp和X氾/^///^^標準。結論因為能夠回4i^載體，所以嗜酸氧^^鐵硫桿菌的轉化是穩(wěn)定的。圖6.A.顯示h/基因經PCR擴增的^M片。泳道1中的樣品，其PCR底物為從pBM-3PnH⑧質并MH匕的嗜酸氧化亞鐵石;^菌林中提取的DM。泳道3中的樣品為P曰性對照，其PCR底物為純化的pBM-3PnH⑧質粒，泳道2、4和5中的樣品為陰性對照，其中泳道2和5中的底物為水，而泳道4中為從未轉化的嗜酸氧化亞鐵石浙菌株中提取的DNA。泳道6和7分別為100bp和XHindIII襯標準。結論可以M^到轉化的菌林(l)與P日'l^t照(3)存^目同的^f，而在未轉化的陰性對照菌抹(4)中沒有條帶。因此回收的質粒正是pBM-3PnH@質粒。圖6.B.顯示培養(yǎng)平板的照片，所述平;^目應于大腸桿菌轉^^選擇平板。用從轉化的嗜酸氧化亞鐵瑜片菌克隆中回收的pBM-3PnH⑧質fi^化;^桿菌培#，該質粒包^f"那霉素抗'^&因。該平M補M50]Lig/mL卡那霉素的LB(LuriaBertani)瓊脂培養(yǎng)基中的轉化體。結論由于栽體能夠完整回收而且可以用于新的轉化，因此嗜酸氧化亞鐵石*菌的轉化^功的。發(fā)明詳述建立一種高效轉化嗜酸輸片菌細菌的方法在生物采礦中至關重要，因為它通#這些細菌中整合入有利于它們轉化的基因來改良細菌，在它們所參與過程中提高它們的效率。為了&'〗上述目的，獲得在該屬中有功能的含有復制起始原點的質并i^成轉化的方法很重要。得到該質粒的第一步是獲得嗜酸石沐菌or/。為了此目的，從嗜酸氧化鐵硫桿菌和嗜酸氧^^^if菌菌株中分離質粒。得到這些質粒^，進行測序并加以研究以確認它們中可能的or/。在所有情況下，確定可能的oW的存在，對于序列1，對應嗜酸氧^i^鐵硫桿菌，對于序列2，對應嗜^^^^W菌。對^4頁域技^A員來說，每個DM序列顯然等針其反向互補序列。椐此，每次我們所指的某一序列，對于序列1*列2，hU旨其反向互樸序列。獲得嗜酸石俯菌屬細菌特異的w2'允許我們首次構建高成功率的轉化載體，當構建的載體不含有表達啟動子時用來克隆，或者當構建的栽體含有^Ji啟動子時用于^it。本發(fā)明的質粒^i^含有從Biosigma所有的Wenelen(DSM16786)菌;fe^分離的M啟動子。選擇在該菌抹基因組中鑒定的固氮酶啟動子化"作為不同培養(yǎng)糾下都能高水平絲的強啟動子。尸""如序列3所示。由于我們的栽體中含有尸/2仏因此能夠確保受該啟動預控的目的基因強^Ji。一_§^#了嗜酸石危桿菌的or/'，序列1和序列2，以及戶/2"啟動子，序列3，就可以設計含有這些的轉化載體。特別設計了在兩種不同的屬或種中都有功能的穿梭載體。在這種情況下，除了嗜酸石*菌的ori，序列1和序列2夕卜，所ii^^ii包^ff異于其它屬的另一個復制，原點。該載包含^〃啟動子、多克隆位點以M少一個才封己基因或凈艮^^因。^M^領域已知的任何一個復制起始原點中選擇第二個復制起始原點，如or/pUC、or/ColEl、or/'pl5A、oWNTPl、or/'pBR345、oWpBR322、or/R6K等,^ffei^or!'pUC。設計遺傳栽體時，多克隆位點連接于才艮告基因，因jtb^所述克隆位點插入基因則iiA報告基因不負汰達。這樣就能夠確定在克隆位點是否成功插入目的基因。為了進行克隆，選#^只別多克隆位點內序列的卩艮制性內切酶，確保該序列;r^在于目的基因中。從已知的能夠通it^物顏色變化、^J^^M4^ii行鑒定的報告基因中選#^接克隆位點的報告基因，如""((3-半吝'Ut普酶)、g/M綠色熒光蛋白)、/w(費光素酶)等。報告基因尤其是P-半吝14t苷酶，h"基因。該栽^fM"有能夠通過篩選進行鑒定的標記基因，該基因從抗生素抗性基因中選擇。尤^LiW予卡那霉素(ir犯)私f生的基因。M的是多克隆位點還含有組^^，即編碼6個組M的序列，^^皮整合入我們要表達的蛋白質的^i^將為其絲^J^。包^i亥M的優(yōu)點在于首先，^J且氨酸脅的存在能夠方^^用來^H古^f可所克絲白質的狄其次，組氨酸六肽使包辨的嵌和蛋白質可以用絲鎘親和4ii^t^化。圖1代^^發(fā)明to的遺傳栽體，其中含有PUCw/;本發(fā)明的w71或2;帶有其自身啟動子的賦予卡那霉素(Kan)抗性的基因，帶有其自身啟動子的lacZ基因，尸/ac;以及含有戶/〃和組^j^C(His6)的多克隆位點(MCS)。具有本發(fā)明or/1的栽^t應pBM-3PnH，而具有本發(fā)明or/2的載^t應pBM-4PnH?？稍趫D2中詳細XC^該多克隆位點。圖3中證明了Pnit啟動子的強度，其顯示了克隆在P麗-3PnH⑧中的嗜酸氧化亞鐵石缺菌銅藍蛋白的表達，而避親和柱純^^被檢測到。利用^i且氨酸序列的特異^Mt過化學發(fā)光western-blot方法i^ft^r測。泳道1和2對應于用構建##化的兩個大腸桿菌DH5oc克隆的純化物。泳道3對應作為陰',照的僅pBM-3PnH@空栽#^#化的菌林的純^緣?？梢訶C^到受戶/"調控蛋白質的強力4it。本發(fā)明的質粒iMl^M頁域已知的方法構建，主要包^t酸石姚菌的or/，序列1和2，以及尸/〃啟動子，序列3。嗜酸硫桿菌的or/，序列1和序列2，以及戶/〃啟動子，序列3都可以單獨應用于此說明書未明確預見的^it傳構建體，i^t于^^頁域技^Mv員來說;1E而易見。每次將序列1的or/it亭列2的w/^^Ait傳構建體，將^J1提高嗜酸石jMf菌中的^iio每次將序列3的尸72"啟動子整合Aii傳構建載體，連接到所述啟動子的序列也將強力M。所述/^Hf序列用于上述目的的所有應用#1^為^^發(fā)明的明顯1務改。一旦已經構建本發(fā)明的質粒，J^T必要提供能夠使該質粒得以整合入嗜酸石;l[if菌的方法。轉^il些細菌首先遇到的困難在于所用的底物幾乎干^^斤有已知的操作方法。已知這些嗜酸石沐菌需^t失源和/i^克源作為能量來源。嗜酸氧化亞鐵石踏菌通常以石jfi^亞鐵作為底物。石繊亞4ibi—種優(yōu)^物，雖然當其氧化成鐵離子時，培絲的氧功肯巨*高，在轉4^jt前通過破壞DNA栽M通過增加電孤形成可能性而干擾電穿孔，所述電弧損傷細胞。適^f酸硫桿菌的另一種能量來源是具有不可溶缺點的元素硫，因此只能以耀b險的形iOA^培養(yǎng)物中，而且當它將其膽絲中去除時會帶走很多存在于培絲中的細菌，因為這些細菌黏附于底物^r立上。為了解決該方法中it5ij的第一個困難，我們選擇利用可溶硫源連四石M鹽(tetrathionatesalts)。我們已^C現(xiàn)，如^J^f紋培養(yǎng)，嗜酸石;Uf菌屬細菌接j]iJl:四-;l^it作為》克源。在第一階段，先用元素硫脊氏常用的硝酸亞鐵，然后再用連四石JL^L^^元素硫。每次改M物都是通iiA^來的培員中取出一些接種物射吏其生長在不同的底物培養(yǎng)基中。在4^亍新的培養(yǎng)^前有必^##^絲&'膽、定。艦常^A在3^^2周內，最通常在改她物一周后。轉化嗜酸硫桿菌遇到的第二個麻煩是這些細菌生長所需的極端酸ltpH值，該pHM常在甚至小于2的一定范圍內。為了IHE^化是否J^，通常在轉化載體中^^入一種負m予轉化細胞某樸歸的篩錄因，通過該4鍾可^^轉化細胞中區(qū)分轉化細胞。多數(shù)清況下，^^賦予某種抗生素^1"生的基因，絲錄培養(yǎng)基中加Ail種抗生素來篩選轉4沐。絕大多數(shù)抗生素都^1雜的有^^，在酸性pH下會j^jl變性并且其活,|^皮部分或^#制。因此pH2^#化的嗜酸石俯菌的篩選帶來了困難。為了解決這個問題，本發(fā)明的方法包^WI節(jié)培騎pH值的。每次升高培養(yǎng)基pH0.5-1，而且每次升高以5-15天時間間隔進4亍，以確^3|#^在每次pH升高之前^^惑定。通過制M同于原始組賴的培養(yǎng)&^絲升高培養(yǎng)基的pH值，利用錄^^I調節(jié)到較高的pH(每次升高的值介于0.5和1之間)。培養(yǎng)物pH的升高g^^底物的改變可以同時或相繼實施，先實施哪一步并沒有不同。一^SJii^了接近5-7的中性pH值，并利用連四石i^Jt作為底物的嗜酸石缺菌穩(wěn)定培養(yǎng)物，就可以運用本領域已知的^—技術實皿養(yǎng)物的轉化，特別是電穿孔。如果轉化方法需要，可以在轉化前用合適的緩沖'^ii行冰浴漂洗。一旦用本發(fā)明的質粒完成轉化，就應在含有篩選成分的平^Lh培養(yǎng)所迷細胞(，性包含在轉化載體中)。平絲25-45匸下孵育7-14天。長出的菌落就M功IH匕的細胞。本發(fā)明實施的一些實例列舉如下。這些實例只是—對^^發(fā)明的舉4'B兌明，決不限制^^發(fā)明。實施例實施例1.載儲建通過PCR擴增含有序列1所示or/的片斷，然后通過限制性內切酶(尸^7/處a/)定向。從pT0P0載體獲得ira/片段，并iL^^a/位點連接至圖2所示的多克隆位點(MCS)和從pBluescript載體獲得的pUC復制絲原點。通it^'J用T4連^S^將得到的片斷在/^//處a/位點處與oW1連接。IC^棘于屈0//^';^///1^刀位點之間的尸""啟動子和位于5^c/位點的六組氨斷列連接到遺傳載體上。產生的質粒命名為pBM-3PnH⑧，該質粒預期大小約4500bp，其結構如圖l所示。^f示準糾下，通過電穿孑傳連接產物轉化;^桿菌。在含有50jug/mL卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)JJi篩選轉^^。在含有50|ig/mL卡那霉素的LB液條養(yǎng)基中培養(yǎng)卡那霉素私性菌落，分離抝f生克隆的質粒DNA，并且鑒定通itF艮制性圖ifi殳計的質粒(利用氾/k////、處a/、及^/、S鵬/等酶切)，并PCR擴增構建的質粒中存在的不同片段。結果表明分離的質粒是構建的栽體。實施例2.通過電穿孑L^"化嗜酸氧^^鐵石;^菌首先，將培^^底^I整^^發(fā)明的底物，連四石繊鹽，并，養(yǎng)物的pH絲不變。制備lOraL在pH2.5條件下生長的嗜酸氧化亞鐵^if菌培養(yǎng)物，該培#以石jlt^il^失作為石;fl^L來源。吸取lmL所*養(yǎng)物中作為接種物并將，移到9mL1%的S培養(yǎng)基中。培絲在301C培養(yǎng)一周。然后，將S培養(yǎng)基中的lmL培養(yǎng)液轉移到9mL含0.1%連四石誠鹽的9K培養(yǎng)基中，其《JL^如表1所示。培輛在30。C下培養(yǎng)一周。表l.<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>It^將培養(yǎng)物的pH調至接近中性，并維持;^。為此目的，取1mL含有l(wèi)y。連四石;!L^鹽、pH2.5的9K培*并將^#入9mL含有0.1°/。連四石爐鹽的、pH3.5的9K培養(yǎng)基中。培養(yǎng)物在30匸下培養(yǎng)一周。重Jji述步驟，先接種入pH4.5的培養(yǎng)基，^^種入pH5.5的培^&。為了在轉4t^^前提高生物量，將10mL含有0.1。/。連四石爐鹽、pH5.5的9K培^4勿接種入90mL同樣的培養(yǎng)基中。該培輛在30。C下培養(yǎng)一周直至餘。從該#培絲中取出一些培養(yǎng)液，并將其在同樣的培養(yǎng)基中稀釋至10%,過夜培養(yǎng)以獲得新鮮的培，。次日上午，8，000rpm離心10分鐘收集細胞。將細胞^^jfo^浴中用40mLA溶液(9K鹽培養(yǎng);iJ^礎，pH1.8)漂洗。接著，#浴中用40niLB溶液(PBS5mM、蔗糖0.3M、10mMEDTA,pH8.0)進行第4漂洗。林浴中用30mL電穿孑遴沖液，即溶液C(PIPES3mM、蔗糖272mM，pH6.4)進行第三次漂洗。漂決后，用lmLC溶液懸浮^i定，^KijM:直至:ii^亍電穿孔。如實施例1所描述的，利用pBM-3PnH⑧栽^ii行電穿孔。10pL含7gpBM-3PnH⑧栽體，然后將其DM滲析30在0.2cm容器中對400liL細胞在2，500-3,000V和400Q奈件下進行電穿孔。每批400inL電穿孔的細胞分別在10mL含有0.r/。連四石jKM鹽的9K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不進行篩選。另外，作為陰'f樹照，在不同的艦中用10mL含有1.0y。連四石滅的9K培養(yǎng)基單獨培養(yǎng)400pL未電穿孔的細胞。所有的培#^在30。C振蕩培養(yǎng)過夜。次日，制名^~有50jLig/mL卡那霉素，pH5.5的D0P平板。DOP固，養(yǎng)!^笛述于文獻(Liu,Z.等人1999，p.39-49，R.Amils和A.Bailester(編輯)InternationalBiohydrometallurgySymposium,Elsevier,Amsterdam,TheNetherlands),(Peng，LB.等人，1994，J.Gen.A卯l.Microbiol.40:243-253)中。每杏聘頻中取200樣品均勻:^ki^布在制備的平紅，兩次重復。平板在30。C下培養(yǎng)7天。所有的平;MP顯示存在轉化體。然后，將其中一^板影印在無卡那霉素、pH5.5的DOP固*養(yǎng)基中U.)，和含有50pg/mL卡那霉素、pH5.5的DOP液，養(yǎng)基中(B.)。圖4顯示了這兩付板的照片。在沒有卡那霉素平板A中，荻得所有的最初轉化克隆。然而，在含有卡那霉素的平板B中，只有能繼續(xù)表錄因的穩(wěn)定轉4脈才肯^長。^Eit種情況下，獲得了4個穩(wěn)定轉化的嗜酸氧化亞4失石^菌克隆。利用能識別轉化載體中存在的卡那霉素抗'錄因的引物，同時針對篩選培養(yǎng)基(B)上生長的4個菌落，即l、2、3和4進行PCR^r測。#測了未修飾的陰性對照，以pBM-3PnH載體作為陽性對照的樹l。擴增結^明這些克隆含有卡那審素基因，并且得到了與陽4生對照相同大小的條帶。實施例3.從轉化的嗜酸氧化亞鐵石*菌菌林中回*1^1體。用4^J^法從用pBM-3PnH轉化的⑧并在含有50ng/ml卡那霉素的9K疏培養(yǎng)基中生長的嗜酸氧^i^鐵石辦菌克隆中分離質粒DM。如圖5所示，先制備一塊^iM角定栽體的存在，在第一個泳勤口入10)iL提^^^物，在第二個泳^|>入20pL從轉化的嗜^IU匕亞鐵石講菌菌林中提取的同樣的質粒DM提$0，a^。第三#第四個泳道分別對應100bp和入HindlII^^標準物樣品。顯示的條帶與載體的預期大小一致。逸*明，既然栽體負^皮回收，那么轉化魏定的。另外一種JiHiE^化成功的方法是用PCR擴增載體中包含的卡那霉素U3i2)抗'錄因。分別對用pBM-3PnH⑧轉化的嗜酸氧^JE鐵石踏菌菌林、未轉化菌林、pBM-3PnH⑥載體和水(作為陰松寸照)進行PCR反應。圖6.A顯示了反應結果，泳道1對應用pBM-3PnH⑧轉化的嗜酸氧化亞鐵硫桿菌菌椒泳道3是pBM-3PnH⑧載體，作為陽'f樹照；泳道4對應未轉化的嗜酸氧化亞鐵石餅菌菌株；'減2和泳道5是利用水的陰'I"樹照；泳道6和泳道7分別對應100bp和入HindIIIW標準。可以看到，轉化的菌抹(1)與P曰性對照(3)顯示了相同的條帶。而陰寸樹照未轉化的菌林(4)沒有絲顯示。因此，回收的質^^J"應pBM-3PnH。用從轉化的嗜酸氧化亞鐵石缺菌林系中分離的質粒DM轉化燥桿菌培養(yǎng)物。結果如圖6.B所示，從圖中可以看出轉化的燥桿菌株系在含有卡那霉素的培養(yǎng)平Wi生長。上述的實施例作為本發(fā)明的例子，決不限制在所附的權利要求書中所描述的^^發(fā)明的范圍。序列表序列號1長的1647pb'類型DNA分類嗜酸氧化亞纟失石危桿菌復制起始原點(Acidithiobacillusferrooxidansori)序列ATTTTCACTAACATAGCGACAACACTAGGTGCAATCAAATAGTTGCCGTTTAGTCTTATGGCTGTTATCAGACATTACGATGAGGTCGCTCATTTTGCTTCCTGTCAGGATAG丌(TGACG丌GTAGCTTCCAGTGTCGTGA丌CGGCTTTTAATCTCT丌GAGATCGCGCTCAATACGATCCTGCCCAGCCTGAAAGCGTTTCAGGTGTTCCAGCATGAGG丌CTCTATCTCGTTTGCCATAGTTGTC丌AGACGGCCTTGCCGCCTGCCTCCTGATG丌GGCCGCCCTTCACCACACTAAACCCTTTCGCC丌GGCCTTATCAGCTGTTCTCACTGCC丌CTGGTGAGTAGCCCCTTTTCCCTTCCATCCGAATTCTGGATTCAAGGTGTAAGTGCGGTTTTGGCCCCATTTTGGTCCAACAATAAGCGCATCTAAACTGATGAGGCGCTTAA丌GCCCTG丌GACTCGCGCTCGATCGATGTTCATCTCCCGCGAAAATCTTGAGTGGTCCTTGTGCCATCGTAAAAAACCTCCCCTTCTCAAAAGCTAGTATCCCTATCAACGAAGTCAAATGCCATTTnTGCCCCCTTGTTGACTCCACAGTCATCATTGATGATTGTACAGTCAACAAGGGGTTTTGCAAGCCATTATTTTAACGGCTGImilIGCCCCCIIIIICTTA丌CTAACAGGCCGTGCCAGCGAAGCGCACTGGGGCGGTTGCGGTAGCGTCGGTCGATTTGCAAGCAAATCGACCGCCACTCCTCGCCCGACrrTGACCCTTCGGGTCCTGAGCTAAAGCTATTnTGTGACTTGCAACAAAACACCACGATTGTCGAAAGTTTGGGGGGGGCCGCCAGAGCGGGGGGGGGGAACGGCACGTTCCCCGCCGGGGATGTTCGTGGGCGGTCCGACGCAGTCGGAGCAAGCGCCCACTCCTTTTCTTGCCAGCAGGACGATTAGGTGGCAGTCTGCCCATATTCGACGGAGACTAGCAAGGGGCGTTGCCCCCTTGACCCCCTGACACTGCCGGAGCGCTTTAACGTGACAAGCCACAAAGACA序列號2長的1104pb類型DM分類嗜酸氧化亞4失石克桿菌復制起始原點(Acidithiobacillusferrooxidansori)序列TTCGTTACGGTAACAAGGCGAACGGCTCAAGCCCTCTCCCCCAGACCCCCTCACCCAGCCCGTGCAGGCCATACGATGCACGCTGTAGCCACTATTCCGCCCTCTGGGCGGTTGCGGATTCGTTCGACGATTTGCAAGCAAATCACCGCCCTCACCCGCGCTCCCTCCTGTTTTCCTACGAGCTAACGCTnTCTTTTTCCCGATAGGGAATCCATTGCACCATTGGCGAGCTCATTCATTGCGCACTTTACAAAAATTGCGCAATTTTATTGCTTTTGAGCAAACCAGTACTTTACCGTTCTGAGAGACACGCCAAGGGCATACCTGATTGGAGGCTTTCCTGCCCCGCTCCGCCTGCTGTTCTGGCGTATGCGTCGCTGATGCTCTTAGCCGTGGCCTTCACTTCGGCAAAGGGTAAGGGCTGCGGAAACTCGCCGTTAATGGCCTGTAATCGCTCCAGGACGGCTTTTGACCATCGACCAAGCCCATTGGGTGCCCAATACTCCCTGACAGCCCCGTAGGCCCAGAAACGACCTGGTTCATGCCGAATGGCACTATCGCAAACGGTCGTTTTTGAGGCTCCATCCTGAGAATGCACGGAAACGCTGTGTTTGCTGGTGATTGCGACGCTCAAAAACGGCTCTCAATTTCAGTTGGCCAGGATTATGGGTTTTGAGAACAGCAGAGTGGGAATCTTCAAAATCATGGGGTCCAACATCCTTAAC序列號3長的106pb類型DNA分類Pnit，Wenelen林(DSM16786)固氮酶啟動子序列A序列表<110〉BI0SIGMAS.A.<120>用于轉化嗜酸硫桿菌屬細菌的質粒及轉化方法<130>NA<150〉CL2115-2007<151〉2007-07-19〈160〉3<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211>1647<212〉DNA<213>嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)<400〉1attttcactaacatagcgacaacactaggtgcaatcaaatagttgccgtttagtctgctt60taggttaaaaggcaataacgggaggcgctgtattggtgccgcccgttatttatggctgtt120atc卿cattacgatg'aggtcgctcatt"gcttcctgtcaggata.gttcaagacggcgc180tcaatgcgctggatgcgctcatccaagctgtcataacgcacatgctgctctgcaatggag240cctgacaggtgtgccagataUgcatgatcgttgacgttgtagcttccagtgtcgtgatt300cggcttttaatctctttgagatcgcgctcaat.acgatcctgcccagcctgaaagcgtttc360aggtgttccagcatgaggttctctatctcgtUgccatagttgtcttagacggccttgcc420gcctgcctcctgatgttggccgcccttcaccacactaaaccctUcgccttggccttatc480agctgttctcactgccttctggtgagtagccccttttcccttccatccgaattctggatt540caaggtgtaagtgcggttttggccccattttggtccaacaataagcgcatctaaactgat600gaggcgcttaattgccctgttgactcgcgctcgatcgstgttcatctcccgcgccatgtc660cgcctgagaaacggcgatatggttctgatagtccagcttgcggagcaagttcatcaagac720gcggaagccgtccacacccaaatcctgagcatgatcctcgaaaatcttgagtggtccttg780tgccatcgtaaaaaacctccccttctcaaaagctactggaacgggccgctgaaccagcat840aggcactcgctcggaaagtatctcaccagtatccctatcaacgaagtcaaatgccatttt900ttgcccccttgttgactccacagtcatcattgatgattgtacagtcaacaaggggttttg960caagccattattttaacggctgtttttttgccccctttttctta"ttctaacaggccgtgc1020cagcgaagcgccgcacggacccggtaagcccccgcgatagcggtxgtcaaacccggccca1080ggagccgctaggagtgggcgcttgcctcgacctatggtcgagccgcccacgaacccttaa1140agggcctcacagggcat.tctagggcacctgtagcaagcattccgccccactggggcggtt1200gcggtagcgtcggtcgatttgcaagcaaatcgaccgccactcctcgcccgactttgaccc1260ttcgggtcctgagctaaagctatttttgtgacttgcaacaaaacaccacgattgtcgaaa1320gtttggggggggccgcc卿gcgggggcaatagccccggagggggtcgatccggcgaagg1380agcgcagcgactgaggacagggggaacggcacgttccccgccggggatgttcgtgggcgg1440tccgacgcagtcggagc卿cgcccactccUttcUgccagc鄉(xiāng)acgattaggtggca1500gtctaaccactgtaaagctagcctacccgtcgaacacgagcaccccctgacggggttgcc1560catattxgacggagactagcaaggggcgttgcccccttgaccccctgacactgccggagc1620gctttaacgtgacaagccacaaagaca1647<210>2<211〉1101<2i2〉鵬<213>嗜酸氧化硫硫桿菌(八cidithiobacillusthiooxidans)<400〉2ttcgttacggtaacaaggcgaacggctcaagccctctc.ccccagaccccctcacccagcc60cgtgcaggccatacgatgcacgctgUgccactattccgccctctgggcggttgcggatt120<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>emt3cc幼ccggtcggtcttagatgggggccacactga肪atttga10權利要求1.一種用于轉化嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)細菌的質粒，其特征在于它包含一個從嗜酸硫桿菌屬細菌分離的復制起始原點，并且主要包括序列1和2所示ori之一的核苷酸序列或各自的反向互補序列，和序列3所示從Wenelen株系(DSM16786)分離的固氮酶啟動子Pnit，該啟動子強烈地促進受其調控的基因的表達。2.才娥權利要求1的質粒，^#棘于它絲包含序列No.1所示oW之一的核齡列或其反向互補序列，使其能夠轉化嗜酸石缺菌屬細菌，尤其是嗜酸氧化亞鐵石*菌種64c^//r//o6aci7/iw/br了oox/^2/w，細菌。3.才^^5Uf'涹求1的質粒，其特征在于它M包含序列No.2M的之一的核齡列或其反向互補序列，使其能夠轉化嗜酸石沐菌屬細菌，尤其是嗜酸氧^j^缺菌種64c2WM/o&s"7/mM/oar/rfs/wJ細菌。4.才財居45U，漆求1的質粒，^##于它是一個能用于多種不同屬或不同種的微生物的載體(穿梭載體)。5.才N^權利要求4的質粒，^#棘于它包^#異于其它種的第二個復制船會原點、克隆位點和至少一個才科己基因。6.才權利要求5的質粒，其特征在于A〃啟動子々條于多克隆位點，并且調節(jié)所述克隆了的基因的^io7.才N^權利要求5的質粒，其特M于，于克隆位點，優(yōu)選多克隆位點，有一^R編碼六組氨,的序列，該六組氨^k可以作為質粒所克隆的蛋白質的C-絲的組氨親。8.才M^5^，漆求5的質粒，其特征在于所錄二個復制起始原點選自or/pUC、oWColEl、or/pl5A、oWNTP1、oWpBR345、oWpBR322、or/R6K。9.才娥^U，漆求8的質粒，^#棘于報告基因選自已知的報告基因，如7acZU-半孝Ut香酶)、-/7(綠色熒光蛋白)、/wc(焚光素酶)或可通狄物顏色變^^^^f亍^^定的其它才艮4"基因。10.才M^權利要求9的質粒，^#棘于報告基因與克隆位,^目連，因此在所述克隆位點插入基因決定了報告基因不4it。11.才^^5U'J要求10的質粒，^#棘于該報告基因是&-半專Ut苷酶/a"基因。12.根據(jù)權利要求9的質粒，其特征在于它含有第二樣自抗生素抗I"錄因的才艮"^基因。13.根據(jù)權利要求12的質粒，其特征在于^^該基因賦予對卡那霉素14.根據(jù)權利要求8的質粒，其特征在于第二個復制^原點是pUCoW。15.—種轉化嗜酸硫桿菌屬細菌的方法，其特征在于在于它包括以下步驟a.制^t酸石踏菌"c/力7A/o&2C27/m)培#^;b.逐洋糊整培養(yǎng)物的pH值，使#于5和7之間；c.#^培養(yǎng)底物為連四石;1^;d.制備權矛虔求1-14中^-項所定義的負^嗜酸石;^菌中^i自己的轉化載體；e.從步驟d^%供的以轉化載體修飾的培*獲得嗜酸石克桿菌轉化體，以獲得轉化的嗜酸^W菌；其中步驟b和c可以同時或按相繼實施，哪一步先實施并無不同。16.根照權利要求15的方法，其特征在于步驟b是在如下糾下實施的每次升高的pH值襯0.5和1之間，絲高一次間隔時間是5-15天，每次升高pH之前^l^射緣養(yǎng)的穩(wěn)定性。17.根據(jù)權利要求16的方法，其特征在于合適的間隔時間是5-7天。18.根據(jù)權利要求15的方法，其特征在于步驟C中的培養(yǎng)底物;^w5A^鐵^^^t素硫，然后^ff^M四石i^JL19.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于底物的每次都是一個機3U2周的階段，以4呆*養(yǎng)的穩(wěn)^:性。20.根據(jù)權利要求16的方法，其特征在于合適的間隔時間是5-9天。21.根據(jù)權利要求15的方法，其特征在于步驟(1制備的栽^*有從嗜酸硫桿菌質豐立分離的復制，原點。22.根據(jù)權利要求15的方法，其特征在于轉化是利用賄^^中的^""轉^^支術實施。23.根據(jù)權利要求22的方法，其特征在于電穿孑L是^^f^I的^^。24.根據(jù)權利要求15的方法，其特征在于嗜酸石;^菌培#^是嗜酸氧化亞鐵贈菌培絲。25.才^^U，J要求15的方法，其特征在于嗜酸石沐菌培#^是嗜酸氧^*危石缺菌培絲。26.才^l權利要求15的方法，其特#于嗜酸硫桿菌培#^是嗜酸喜^^危桿菌(Acidithiobacilluscaldus)培^/。全文摘要本發(fā)明公開了嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)細菌，如嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、嗜酸氧化硫硫桿菌(Acidithiobacillusthiooxidans)和嗜酸喜溫硫桿菌(Acidithiobacilluscaldus)中的功能質粒。以及利用這些質粒成功轉化嗜酸硫桿菌屬細菌，如嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、嗜酸氧化硫硫桿菌和嗜酸喜溫硫桿菌的方法。文檔編號C12R1/01GK101413010SQ20081017566公開日2009年4月22日申請日期2008年7月18日優(yōu)先權日2007年7月19日發(fā)明者貝朗格P·E·馬丁內斯,巴爾德坎托斯P·帕拉達申請人:拜奧希格馬公司