專利名稱：：一種檢測下呼吸道致病菌的基因芯片和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因芯片和檢測用試劑盒，尤其涉及一種檢測下呼吸道致病菌的基因芯片和試劑盒。
背景技術(shù)：
：呼吸道感染是感染性疾病中最常見種類之一，約占感染性疾病的30%40%，了解引起該類疾病的病原菌種類，特別是及時地培養(yǎng)、分離出致病菌，對疾病的臨床診斷、藥物選擇及預(yù)后具有重要意義。下呼吸道感染(氣管炎、支氣管炎、細(xì)支氣管炎及肺炎)是嚴(yán)重威脅當(dāng)今社會人群健康的感染性疾病。對于老年人和兒童這些免疫功能較弱者的危害尤其嚴(yán)重。流行病學(xué)研究表明，每年急性呼吸道感染造成約200萬5歲以下的兒童死亡，是這個年齡組兒童的主要死亡原因。約75%肺炎死亡病例發(fā)生于1歲以下的嬰兒，而約1%的肺炎病例會留下后遺癥(如支氣管擴(kuò)張)，這些后遺癥增加再次感染的危險性。在美國，肺炎在所有死亡原因中列第6位，是最常見的致命性院內(nèi)獲得性感染。根據(jù)關(guān)于下呼吸道發(fā)表文獻(xiàn)和醫(yī)院下呼吸道感染數(shù)據(jù)分析，引起下呼吸道感染的最常見細(xì)菌為金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和卡他莫拉菌。國標(biāo)中臨床致病菌的方法多是采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定的方法，報(bào)告檢驗(yàn)結(jié)果大致需57天，加之檢驗(yàn)方法繁瑣、費(fèi)時費(fèi)力。與實(shí)驗(yàn)診斷的其他科學(xué)相比，臨床微生物診斷方法的發(fā)展相對滯后。1997年7月，Affymetrics，Inc.(SantaClara，CA)公司的ThomasR.等人發(fā)明的第6，228，575號美國專利公開了以生物芯片技術(shù)對微生物進(jìn)行定種和表型分析的方法。從二十世紀(jì)九十年代開始，基因芯片技術(shù)作為一種全新的核酸分析檢測技術(shù)建立起來，并隨著人類基因組計(jì)劃的開展而逐步發(fā)展。該技術(shù)綜合運(yùn)用了分子生物學(xué)、集成電路制造、計(jì)算機(jī)、半導(dǎo)體、共聚焦激光掃描、熒光標(biāo)記等技術(shù)，使檢測過程具有敏感性高、特異性強(qiáng)、大規(guī)模集成化、自動化、操作簡便快捷、效率高等特點(diǎn)，在基因表達(dá)相關(guān)研究和生物制藥研究等方面得到普遍應(yīng)用。因此，如果將基因芯片技術(shù)用于細(xì)菌的鑒定，不僅可以大大簡化檢測手段，提高檢測速度，而且具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度、高通量、可重復(fù)性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前最常使用的微生物鑒定的靶分子是16SrRNA和23SrRNA，國內(nèi)外已有很多文獻(xiàn)報(bào)道。利用16SrRNA和23SrRNA可將細(xì)菌微生物鑒定至種或?qū)?，但是對于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌種或?qū)俚蔫b定十分困難(BodrossyL，SessitschA.2004.Oligonucleotidemicroarraysinmicrobialdiagnostics.CurrentOpinioninMicrobiology.7:245-25)。目前利用16S-23SrRNA間區(qū)作為靶分子進(jìn)行細(xì)菌的鑒定已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)(NubelU，SchmidtPM，ReiPE，etal.2004.OligonucleotidemicroarrayforidentificationofBacillusanthracisbasedonintergenictranscribedspacers16SrRNA或者23SrRNA的十倍，因此具有更高的分辨率，甚至可將細(xì)菌區(qū)分到型，對于親緣關(guān)系較近的種屬的區(qū)分具有16SrRNA和23SrRNA不可比擬的優(yōu)勢。同時兩端是保守的16SrRNA基因和23SrRNA基因區(qū)，可在兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物可避免了多對引物帶來的引物二聚體的問題，長度在200bp-1000bp之間，大小易于操作，因而靶序列的擴(kuò)增和標(biāo)記過程更加簡化，也更容易控制，符合操作簡便快捷的實(shí)際要求。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測下呼吸道致病菌的基因芯片，以彌補(bǔ)傳統(tǒng)臨床下呼吸道致病菌檢測技術(shù)存在的費(fèi)時耗力的缺陷，擴(kuò)展病原菌檢測范圍，提高檢測靈敏度和特異性，降低勞動強(qiáng)度，縮短檢測周期。本發(fā)明所述的檢測下呼吸道致病菌的基因芯片包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中所述的該寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列(1)從金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌或鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)、銅綠假單胞菌或流感嗜血桿菌的16S基因、肺炎鏈球菌或嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因、卡他莫拉的copB基因的一種或多種DNA序列中選取的序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；(3)上述(1)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。其中，上述的從金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌或鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)、銅綠假單胞菌或流感嗜血桿菌的16S基因、肺炎鏈球菌或嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因、卡他莫拉的copB基因中選取的DNA片段具有SEQIDNO:3-SEQIDNO:28所示的DNA序列中的一種或多種DNA序列。其中，上述的寡聚核苷酸探針還包含陽性對照探針和陰性對照探針。上述的陽性對照探針優(yōu)選具有SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示的DNA序列。本發(fā)明的另一目的是提供上述的基因芯片的應(yīng)用，其可用于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌或卡他莫拉菌中至少一種致病菌的檢測。其中，所應(yīng)用的檢測引物具有SEQIDNO:29_SEQIDNO:36所示的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的至少一種。本發(fā)明的再一目的是提供一種檢測下呼吸道致病菌的試劑盒，該試劑盒包含上述的基因芯片，所述基因芯片包含SEQIDN0:3-SEQIDNO:28所示的DNA序列中的一種或多種DNA序列。該試劑盒還包含檢測引物，該檢測引物優(yōu)選具有SEQIDN0:29-SEQIDNO:36所示的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的至少一種。本發(fā)明的試劑盒還包含雜交盒、雜交液或分析鑒定結(jié)果用的判讀軟件以及說明書。本發(fā)明的再一目的是提供上述的試劑盒的應(yīng)用，其可用于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和卡他莫拉菌中至少一種致病菌的檢測。由上述的技術(shù)方案可見，本發(fā)明首次將基因芯片技術(shù)引入下呼吸道常見致病菌檢測領(lǐng)域，建立了一種快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性強(qiáng)的全新的下呼吸道常見致病菌檢測基因芯片及其檢測方法，利用本發(fā)明的基因芯片可以達(dá)到檢測下呼吸道常見的致病菌的目的，由于操作簡便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)，對于醫(yī)院臨床檢驗(yàn)部門有重要的應(yīng)用價值。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下面特舉較佳實(shí)施例，并配合說明書附圖，作詳細(xì)說明如下。圖l為本發(fā)明基因芯片的-圖2為本發(fā)明基因芯片的-圖3A為利用本發(fā)明的基因圖3B為利用本發(fā)明的基因圖3C為利用本發(fā)明的基因圖3D為利用本發(fā)明的基因圖3E為利用本發(fā)明的基因圖3F為利用本發(fā)明的基因圖3G為利用本發(fā)明的基因圖3H為利用本發(fā)明的基因-個實(shí)施例的外形示意圖。-個實(shí)施例上單一點(diǎn)陣探針排布規(guī)律示意圖。芯片檢測下呼吸道金黃色葡萄球菌時的雜交結(jié)果c芯片檢測下呼吸道肺炎克雷伯菌時的雜交結(jié)果。芯片檢測下呼吸道銅綠假單胞菌時的雜交結(jié)果。芯片檢測下呼吸道卡他莫拉菌時的雜交結(jié)果。芯片檢測下呼吸道流感嗜血桿菌時的雜交結(jié)果。芯片檢測下呼吸道肺炎鏈球菌菌時的雜交結(jié)果。芯片檢測下呼吸道鮑曼不動桿菌時的雜交結(jié)果。芯片檢測下呼吸道嗜肺軍團(tuán)菌時的雜交結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1探針的設(shè)i十和制備1.序列獲得(1)細(xì)菌16srDNA序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到八種菌(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和卡他莫拉菌)的全部16srDNA序列。(2)16S-23SrDNA間區(qū)序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌及他們的近緣菌的所有16S-23SrDNA間區(qū)序列。肺炎克雷伯氏菌的間區(qū)序列公共數(shù)據(jù)庫中僅有9株菌的21條間區(qū)序列，產(chǎn)酸克雷伯氏菌的間區(qū)序列只有1株菌的1條序列，滿足不了篩選特異探針的需求。本實(shí)驗(yàn)室對22株肺炎克雷伯氏菌，3株臭鼻克雷伯氏菌，2株鼻硬結(jié)克雷伯氏菌，4株產(chǎn)酸克雷伯氏菌，1株土生克雷伯氏菌和l株植生克雷伯氏菌和2株解鳥氨酸克雷伯氏菌進(jìn)行了間區(qū)的測序。用上述從16srDNA和23srDNA序列設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增間區(qū)，PCR產(chǎn)物純化后連接到T載體上，后電轉(zhuǎn)進(jìn)DH5a感受態(tài)中，挑取含500bp-lkbp的質(zhì)粒測序，測序儀ABI3700。測得的序列用StadenPackage軟件拼接，從而得到肺炎克雷伯氏菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌及其近緣菌的間區(qū)序列。(3)copB基因序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到卡他莫拉菌的全部copB基因序列。(4)gyrB基因序列的獲得從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的全部gyrB基因序列。2.探針設(shè)計(jì)(1)細(xì)菌的通用探針八種菌全部的16srDNA序列及其他菌的16srDNA序列導(dǎo)入GlustalX軟件中，選取靠近間區(qū)的一段16srDNA保守序列作為探針，滿足長度27bp士2bp，Tm值68。C±3°C。(2)間區(qū)探針分別將金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌的所有16S-23SrDNA間區(qū)序列導(dǎo)入GlustalX軟件中，從而得知該菌的間區(qū)序列有幾種類型，每種類型選取一條代表序列在公共數(shù)據(jù)NCBI中作blastn比對，確定可否作為特異靶點(diǎn)以及特異靶點(diǎn)的位置。對照GlustalX比對結(jié)果，選取滿足不同株間該區(qū)段都保守的性質(zhì)，同時長度27bp士3bp，Tm值68。C士3。C。(3)copB基因探針將上述從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到的卡他莫拉菌的copB基因序列用序列比對軟件GlustalX比對，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入01igoArray2.0軟件中，參數(shù)設(shè)定如下-n20;-l30;-L40;-D3000;-t79;-T90;-sG5°G;—x65°G;—N2;—p33，-P65;—mGGGGGCCGGCTTTTTAAAAA;—g15。運(yùn)行程序在線設(shè)計(jì)探針。從輸出結(jié)果中選擇長度在27bp士2bp，Tm值68t:士3t:的探針。(4)gyrB基因探針將上述下載肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB序列導(dǎo)入GlustalX軟件中，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入01igoArray2.0軟件中，參數(shù)設(shè)定如下—n20;-l30;-L40;-D3000;-t79;-T90;-s65°C;-x65°C;-N2;-p33，-P65;-mGGGGGCCCCCTTTTTAAAAA;-g15。運(yùn)行程序在線設(shè)計(jì)探針。從輸出結(jié)果中選擇長度在27bp士2bp，Tm值68t:士3t:的探針。3.探針合成將下表l中的探針序列的5'端延長15個T(表1所示的熒光探針序列中沒有包含延長的IO個T)并氨基化后委托探針合成公司(北京奧科公司)合成，備用。4.探針篩選將合成好的探針溶解并適量稀釋后用基因芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)在玻璃片基上制成基因芯片，通過雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異、靈敏的探針。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選擇了30條長度在35bp士2bp、Tm75°C士2。C的探針，并通過269次雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探針篩選，最終得到如表1所示的探針。其中，編號為NO.l(SEQIDN0:1)的探針序列選自所有細(xì)菌的16srDNA，作為陽性對照用來檢測是否有細(xì)菌，編號為N0.2的探針作為熒光探針，編號為N0.3(SEQIDNO:2)負(fù)對照用來檢測是否有細(xì)菌，編號為NO.4的探針為50%的DMSO，用作空白對照，編號NO.5_N0.11的7條探針序列(SEQIDN0:3-SEQIDNO:9)選自金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)，編號NO.12-NO.18的7條探針序列(SEQIDNO:10-SEQIDNO:16)選自銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌的16S基因，編號NO.19-NO.22的4條探針序列(SEQIDNO:17_SEQIDNO:20)選自肺炎鏈球菌的gyrB基因，編號NO.23-NO.26的4條探針序列(SEQIDNO:21-SEQIDNO:24)選自卡他莫拉的copB基因中，編號NO.27-NO.30的4條探針序列(SEQIDN0:25-SEQIDNO:28)選自嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因中。表1:本發(fā)明基因芯片上選用的寡核苷酸探針序列及可檢測出的致病菌<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)施例2引物的設(shè)計(jì)和制備1.序列獲得同前設(shè)計(jì)探針的序列。2.設(shè)計(jì)引物:(1)擴(kuò)增間區(qū)序列引物的設(shè)計(jì)從公共數(shù)據(jù)庫NCBI中下載得到的8種細(xì)菌的16SrDNA用序列比對軟件GlustalX比對后，選取靠近間區(qū)的一段16srDNA保守序列作為上游引物，長度符合Tm值50。C士5。C、長度17bp士2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:N0NE，且包含細(xì)菌通用探針序列在內(nèi)。(2)擴(kuò)增copB基因序列引物的設(shè)計(jì)將上述從GenBank公共數(shù)據(jù)庫下載得到的卡他莫拉copB基因序列用序列比對軟件GlustalX比對，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0軟件中，相應(yīng)參數(shù)設(shè)定如下SearchFor:PCRPrimers,Searchtypes:Both.SearchRanges:SensePrimerlto672，Anti_sensePrimerlto672，PCRProductSize:100bptolOOObp.PrimerLength:20bp±2bp.SearchMode:Automatic。從輸出結(jié)果中選取Tm值50°C±5°C、長度17bp±2bp、Hairpin:NONE、Dimer:NONE、FalsePriming:NONE、CrossDimer:N0NE且包含探針序列在內(nèi)的引物。(3)擴(kuò)增gyrB基因序列引物的設(shè)計(jì)將上述下載得到的所有肺炎鏈球和嗜肺軍團(tuán)菌菌gyrB基因序列用序列比對軟件GlustalX比對，找到該基因的保守區(qū)段，將該保守區(qū)段導(dǎo)入引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0軟件中，相應(yīng)參數(shù)設(shè)定如下SearchFor:PCRPrimers,Searchtypes:Both.SearchRanges:SensePrimerlto2415，Anti_sensePrimerlto2415，PCRProductSize:100bptolOOObp.PrimerLength:20bp±2bp.SearchMode:Automatic。從輸出結(jié)果中選取Tm值50°C士5。C、長度17bp士2bp、Hairpin:N0NE、Dimer:N0NE、FalsePriming:N0NE、CrossDimer:N0NE且包含探針序列在內(nèi)的引物。3.引物合成將下表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奧科)合成，備用。4.引物篩選將合成好的引物溶解并適量稀釋，一方面通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增16S-23SrDNA間區(qū)、16S基因、卡他莫拉copB基因和肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因序列檢測引物的擴(kuò)增性，另一發(fā)面，四對引物同時對8種菌的不同菌株進(jìn)行擴(kuò)增檢測四對引物的相容性，最終得到用于制備本發(fā)明基因芯片所需的特異、靈敏的引物。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，選取了既包含探針又適合同時使用4對引物擴(kuò)增8種下呼吸道常見致病菌(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和卡他莫拉菌的)DNA的引物8條，為適應(yīng)同時四對引物的PCR，經(jīng)生物信息學(xué)初篩并通過大量PCR實(shí)驗(yàn)篩選，篩選出如表2所示的適用引物。表2用于下呼吸道中8種常見致病菌檢測DNA的PCR擴(kuò)增的引物序列引物編號SEQID引物序列(5'-3')擴(kuò)增作用P-1NO:29TGTACACACCGCCCGTC16S-23SrDNA間區(qū)上游引物P-2NO:30GGTACTTAGATGTTTCAGTTC16S-23SrDNA間區(qū)下游引物P-3NO:31AGAGTTTGATCMTGGCTCAG16S基因上游引物P-4NO:32CCGTCAATTCMTTTRAGTTT16S基因上游引物P-5NO:33GAAAGGGCATTMACMACWGA肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因上游引物P-6NO:34GWGTSAYTTCACGMGCACGC肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因下游引物P-7NO:35GGTGAGTGCCGCTTTTACA卡他莫拉c叩B基因上游引物P-8NO:36GARTYRCGYCCATGYTCTAA卡他莫拉c叩B基因下游引物10棚列3細(xì)猛燃——K鵬1.溶解探針將實(shí)施例1中合成的探針分別溶解于50%匿SO溶液中，稀釋使探針的終濃度達(dá)到IPg/iil。2.加板將溶解好的探針加入384孔板的相應(yīng)位置，每孔10。3.點(diǎn)樣將如圖1所示的57.5mmX25.5mmXlmm(長X寬X高)的潔凈的醛基化玻片(CELAssociates，Inc.)放到芯片點(diǎn)樣儀(Spotarray72)的載物臺上，使用SpotArray的控制軟件(TelechemSMP3stealthpin)，運(yùn)行程序，按圖2所示的排布方式點(diǎn)在醛基化的玻片上4.5mmX4.5mm的點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)，構(gòu)成中低密度DNA微矩陣，玻片上的六個點(diǎn)陣區(qū)內(nèi)陣列排布規(guī)律相同。點(diǎn)陣區(qū)域尺寸3mmX2.25mm，該點(diǎn)陣內(nèi)點(diǎn)間距250iim，矩陣12X9，12X250iim=3mm，9X250iim=2.25mm，標(biāo)準(zhǔn)片基尺寸75.5mmX25.5mmXlmm。4.干燥將點(diǎn)好的芯片室溫下過夜干燥，然后在45t:烘箱干燥2小時。5.交聯(lián)用交聯(lián)儀(uvpcl-2000MultracioletCrosslinker)600J交聯(lián)2次。將交聯(lián)好的芯片放回潔凈芯片盒中，備用。由圖2可見，每個點(diǎn)樣區(qū)內(nèi)為12(行)X8(列)個探針點(diǎn)。N0.1框區(qū)示意的位置為檢測細(xì)菌16S基因的正對照探針，NO.2框區(qū)示意的位置為熒光探針，NO.3框區(qū)示意的位置為檢測細(xì)菌ITS基因的正對照探針，其它為各致病菌的特異探針(對應(yīng)于表l中的相應(yīng)探針編號)。實(shí)施例4利用基因芯片快速檢測下呼吸道樣品中常見致病菌1.樣品處理醫(yī)院采集痰樣，標(biāo)本接于預(yù)先配制好的225ml2YT培養(yǎng)基中，37°C，200rpm過夜振蕩培養(yǎng)。2.提取基因組lml過夜培養(yǎng)的樣品8000rpm離心5分鐘沉淀可能存在的致病菌菌體，棄上清(盡量空干)。向沉淀中加入100ul去離子水重懸，8000rpm，離心5分鐘，去除上清。加入100ul的裂解液(配方如下)，IO(TC沸水浴15分鐘，12000rpm離心3分鐘，上清即為粗提的DNA模板。附裂解液配方1XPCR緩沖液(含Mg+)0.5%的NP400.5%的Tween203.擴(kuò)增靶序列取上述基因組提取方法提取的3ul中層上清作為模板加入PCR反應(yīng)混合液中，PCR反應(yīng)混合液配方如下表3所示。(注以下表3-表4中的PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合物，Taq酶均購自Sangon公司)表3MultiplexPCR反應(yīng)混合液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>注表中P-l至P-2以及P-3和P-4為表2中所列的引物。將反應(yīng)管放入PCR儀(Biometra)中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下94°C5分鐘94。C30秒52°C45秒72°C1分鐘回到第二步，共35個循環(huán)72°C5分鐘4°C20分鐘3.純化將上述獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用純化柱(MILIPORE公司)純化，具體步驟如下(1)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至純化柱中，加水補(bǔ)足至400ill。(2)25。C、6000rpm離心15分鐘，丟棄收集管。(3)將純化柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml的離心管中，加入25iU的超純水(MilliQ)，37°C放置5分鐘。(4)將純化柱倒置放在1.5ml的離心管上，6000rpm離心2分鐘，收集產(chǎn)物。4.標(biāo)記靶序列取12ill純化產(chǎn)物，加入標(biāo)記混合液中，標(biāo)記反應(yīng)混合液配方如下表4所示。表4標(biāo)記混合液配方<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注表中P-2和P-4為表2中所列的引物。將反應(yīng)管放入PCR儀(Biometra)中，設(shè)定的循環(huán)參數(shù)如下94°C5分鐘94°C30秒52°C45秒72°C1分鐘回到第二步，共35個循環(huán)72"C5分鐘4。C20分鐘5.烘干將標(biāo)記產(chǎn)物置65t:烘箱烘干。6.雜交向雜交盒(博奧公司)內(nèi)預(yù)加入70ii1ddH20以保持濕度。12ill雜交液(配方如下所示)回溶烘干產(chǎn)物并加在實(shí)施例三中制備的下呼吸道常見致病菌檢測基因芯片的探針陣列區(qū)域，蓋上定制的蓋片(博奧公司)(注意蓋片和載玻片之間不能有氣泡)，蓋緊雜交盒，4(TC水浴鍋中雜交16小時。7.洗滌雜交到時，取出雜交盒，去除蓋片，將基因芯片依次在洗液A中洗滌3分鐘，洗液B中洗滌3分鐘，洗液C中洗滌90秒，空氣中風(fēng)干。雜交液配方10%硫酸葡聚糖(dextranSulfate);25%甲酰胺(formamide);0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)；6XSSPE洗液A:1XSSC(氯化鈉-檸檬酸鈉溶液)；0.1%SDS洗液B:0.05XSSC洗液C:95X乙醇8.掃描用GenePixpersonal4100A生物芯片掃描儀(AXONinstrument)掃描，所用參數(shù)如下軟件及版本GenePixPro6.0[O川]officialname:575DF35PMTGain:550掃描分辨率10iim掃描結(jié)果存為JPG、TIF、GPR格式用本發(fā)明的基因芯片檢測下呼吸道致病菌(金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌和卡他莫拉菌)時的雜交掃描結(jié)果如圖3A-3J所示。9.分析判讀根據(jù)掃描出的雜交圖像，以正對照探針的位置作為圖像坐標(biāo)，判斷出現(xiàn)熒光信號的特異探針的位置，對照點(diǎn)陣排布圖判斷出致病菌。若只有正對照探針有信號，則不存在此八種致病菌。輔你l5乂寸細(xì)猛則灘鼎赫翻對實(shí)施例3中制備的下呼吸道常見致病菌檢測基因芯片的特異性進(jìn)行鑒定如下總計(jì)用141株致病菌的標(biāo)準(zhǔn)株和檢出株以及他們的近緣菌株來鑒定實(shí)施例三中制備的下呼吸道中常見致病菌檢測基因芯片的特異性。在該特異性鑒定試驗(yàn)中，使用的所有菌株情況見表5。利用本發(fā)明的基因芯片和上述檢測方法進(jìn)行雜交檢測，均顯示了正確的雜交結(jié)果，這說明本發(fā)明的基因芯片具有良好的特異性。表5:特異性試驗(yàn)用到的菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>頭狀葡萄球菌1」i肺炎鏈球菌jbikim3唾液鏈球菌1&1乳鏈球菌5Y^/^cocrw《潔i1無乳鏈球菌1o1屎鏈球菌1b1糞鏈球菌ia1豬鏈球菌1牛鏈球菌1&1熒光假單胞菌1P1施氏假單胞菌4a4硝酸基還原假2J2單胞菌惡臭假單胞菌lk1食油假單胞菌T^ewti麵Ottas1戶/油飛a產(chǎn)堿假單胞菌ia1硝酸基還原假單胞菌ia1臭鼻克雷伯氏2菌鼻硬結(jié)克雷伯ib,ik2氏菌土生克雷伯氏iJ1菌植生克雷伯氏iJ1菌16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>a，中科院微生物研究所(As)。b，中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心(CMCC)。c，澳大利亞醫(yī)學(xué)與獸醫(yī)學(xué)研究所(頂VS)。d，流行病學(xué)微生物學(xué)研究所(IEM)，中國預(yù)防醫(yī)學(xué)研究會。e，英國國家菌種保藏中心(NCTC)。f，德國微生物和細(xì)胞保藏中心(DSMZ)。g，瑞典哥德堡大學(xué)培養(yǎng)物保藏中心(CCUG)。h，中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC)。i，中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。j，捷克微生物保藏中心(CCM)k，美國典型菌種保藏中心(ATCC)。l，德國科隆大學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)院(MIH)。m，澳大利亞新南威爾士州疾病感染和微生物中心(CIDM)。n，比利時菌種中心(LMG)。o，中國獸醫(yī)學(xué)菌種國家保藏中心(CVCC)。p，中國軍事科學(xué)醫(yī)學(xué)院(A匪S)。q，來自于深圳疾病控制與預(yù)防中心的臨床菌株。r，來自于天津中醫(yī)藥大學(xué)的臨床菌株。s，來自于天津人民醫(yī)院的臨床菌株。t，來自于天津一中心醫(yī)院的臨床菌株。u，來自于天津三中心醫(yī)院的臨床菌株。v，來自于天津兒童醫(yī)院的臨床菌株。w，來自于天津南開醫(yī)院的臨床菌株。x，來自天津出入境檢驗(yàn)檢疫局的檢出株。對實(shí)施例3中制備的下呼吸道中常見致病菌檢測基因芯片的靈敏度進(jìn)行檢測如下該基因芯片的檢測靈敏度經(jīng)過107次雜交實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，0.lng的微量基因組DNA或每25g(ml)痰液中有(l-5)cfu就可保證上述8種致病菌具有穩(wěn)定、良好的雜交結(jié)果，這說明本發(fā)明的基因芯片具有很高的檢測靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其較佳實(shí)施例的描述，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，可以做出各種可能的等同改變或替換，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。序列表〈110〉天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司〈120〉一種檢測下呼吸道致病菌的基因芯片和試劑盒〈130>8P13003-CN〈160>34〈170>PatentInversion3.2〈210>1〈211>25〈212>DNA〈213〉基于細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的正對照探針序列〈400>1ttgtacacaccgcccgtcacaccat25〈210>2〈211>52〈212>DNA〈213〉負(fù)對照〈400>2tttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttt52〈210>3〈211>29〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>3gcttatgcgagcgcttgacaatctattct29〈210>4〈211>28〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>4taaagcagtatgcgagcgcttgactaaa28〈210>5〈211>30〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>5atgtgaacgtttgacttataaaaatggtgg30〈210>6〈211>25〈212>DNA〈213〉基于肺炎克雷伯氏菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>6atttgaagaggttgcaaacgatggg25〈210>7〈211>23〈212>DNA〈213〉基于肺炎克雷伯氏菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>7ggcctaccaaatttgcgaagcaa23〈210>8〈211>31〈212>DNA〈213〉基于鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>8tcattatcacggtaattagtgtgatctgacg31〈210>9〈211>32〈212>DNA〈213〉基于鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>9agtgtgatctgacgaagacacattaactcatt32〈210>10〈211>24〈212>DNA〈213〉基于銅綠假單胞菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>10tcatacgtcctgagggagaaagtg24〈210>11〈211>25〈212>DNA〈213〉基于銅綠假單胞菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>11gggcagtaagttaataccttgctgt25〈210>12〈211>23〈212>DNA〈213〉基于銅綠假單胞菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>12atgaagggagcttgctcctggat23〈210>13〈211>21〈212>DNA〈213〉基于銅綠假單胞菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>13tccgttgggatccttgagatc21〈210>14〈211>28〈212>DNA〈213〉基于流感嗜血桿菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>14cggtagcaggagaaagcttgctttcttg28〈210>15〈211>27〈212>DNA〈213〉基于流感嗜血桿菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>15tttgggggttggggtttaactctggcg27〈210>16〈211>26〈212>DNA〈213〉基于流感嗜血桿菌的16SDNA設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>16gttggggtttaactctggcgcccgta26〈210>17〈211>27〈212>DNA〈213〉基于肺炎鏈球菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>17aagcgccaaggtttggaacaaaccaag27〈210>18〈211>26〈212>DNA〈213〉基于肺炎鏈球菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>18gcgccaaggtttggaacaaaccaagc26〈210>19〈211>26〈212>DNA〈213〉基于肺炎鏈球菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>19agcgccaaggtttggaacaaaccaag26〈210>20〈211>31〈212>DNA〈213〉基于肺炎鏈球菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>20ggacccaaaaatcttcactgaaacaacaatc31〈210>21〈211>29〈212>DNA〈213〉基于卡他莫拉菌的copB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>21gccattgacctaaaaattgacaacgct29〈210>22〈211>27〈212>DNA〈213〉基于卡他莫拉菌的copB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>22caccaaggtcgctttatgctagaccct27〈210>23〈211>27〈212>DNA〈213〉基于卡他莫拉菌的copB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>233gacg朋3gc3cggctecagatttgcg27〈210>24〈211>29〈212>DNA〈213〉基于卡他莫拉菌的copB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>24tacttctcaatttgtcagcattcgtggca29〈210>25〈211>26〈212>DNA〈213〉基于嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>25gcatttgctagtgcgtagac3tgg3326〈210>26〈211>26〈212>DNA〈213〉基于嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>26ctegct朋朋gattecgtgaattgtc26〈210>27〈211>29〈212>DNA〈213〉基于嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>27gagcactt朋3te朋朋t朋laacaccagt29〈210>28〈211>26〈212>DNA〈213〉基于嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的探針序列〈400>28gtatctccaacaggtgatgatgctcg26〈210>29〈211>17〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌和嗜肺軍團(tuán)菌16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的通用檢測用上游引物序列〈400>29tgtacacaccgcccgtc17〈210>30〈211>21〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌和嗜肺軍團(tuán)菌16SrDNA設(shè)計(jì)并人工合成的通用檢測用下游引物序列〈400>30ggtacttagatgtttcagttc21〈210>31〈211>20〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌卡他莫拉菌和嗜肺軍團(tuán)菌16SrDNA設(shè)計(jì)并人工合成的通用檢測用上游引物序列〈400>31agagtttgatcmtggctcag20〈210>32〈211>20〈212>DNA〈213〉基于金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌和嗜肺軍團(tuán)菌16S-23SrDNA間區(qū)設(shè)計(jì)并人工合成的通用檢測用上游引物序列〈400>32ccgtcaattcmtttragttt20〈210>33〈211>20〈212〉DNA〈213〉基于肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的檢測用上游引物序列〈400>33gaaagggcattmacmacwga20〈210〉34〈211>20〈212>DNA〈213〉基于肺炎鏈球菌和嗜肺軍團(tuán)菌gyrB基因設(shè)計(jì)并人工合成的檢測用下游引物序列〈400〉34gwgtsayttcacgmgcacgc20〈210>35〈211>19〈212>DNA〈213〉基于卡他莫拉copB基因設(shè)計(jì)并人工合成的檢測用上游引物序列〈400>35ggtgagtgccgcttttaca19〈210>36〈211>20〈212>DNA〈213〉基于卡他莫拉copB基因設(shè)計(jì)并人工合成的檢測用下游引物序列〈400>36gartyrcgyccatgytctaa20權(quán)利要求一種檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片，包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其特征在于固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針包含從以下序列中選取的一種或多種序列(1)從金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌或鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)、銅綠假單胞菌或流感嗜血桿菌的16S基因、肺炎鏈球菌或嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因、卡他莫拉的copB基因的一種或多種DNA序列中選取的序列；(2)上述(1)中選取的DNA序列的互補(bǔ)DNA序列；(3)上述(1)或(2)中選取的DNA序列的互補(bǔ)RNA序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片，其特征在于所述固定在固相載體上的寡聚核苷酸探針具有SEQIDN0:3-SEQIDN0:28所示的DNA序列中的一種或多種DNA序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片，其特征在于還包含陽性對照探針和陰性對照探針。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片，其特征在于所述陽性對照探針具有SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2所示的DNA序列。5.權(quán)利要求1所述的檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于其在檢測金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌或卡他莫拉菌中至少一種致病菌的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片的應(yīng)用，其特征在于包括使用檢測引物，該檢測引物具有SEQIDN0:29-SEQIDNO:36所示的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的至少一種。7.—種檢測下呼吸道致病菌的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1所述的基因芯片。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的基因芯片包含SEQIDN0:3-SEQIDNO:28所示的DNA序列中的一種或多種DNA序列。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于還包括檢測引物，該檢測引物具有SEQIDNO:29-SEQIDNO:36所示的DNA序列或其互補(bǔ)DNA序列的至少一種。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于還包括雜交盒、雜交液。11.權(quán)利要求7所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于其在檢測金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌或卡他莫拉菌中至少一種致病菌的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種檢測下呼吸道中致病菌的基因芯片，其包括固相載體和固定在該固相載體上的寡聚核苷酸探針，其中上述寡聚核苷酸探針包括從金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌或鮑曼不動桿菌的16S-23SrDNA間區(qū)、銅綠假單胞菌或流感嗜血桿菌的16S基因、肺炎鏈球菌或嗜肺軍團(tuán)菌的gyrB基因、卡他莫拉的copB基因的一種或多種DNA序列中選取的序列或其互補(bǔ)的DNA或RNA序列。本發(fā)明還提供包含上述基因芯片的試劑盒。利用本發(fā)明的基因芯片和試劑盒可檢測下呼吸道致病菌，而且操作簡便，準(zhǔn)確性高，重復(fù)性強(qiáng)。文檔編號C12Q1/68GK101748193SQ20081018256公開日2010年6月23日申請日期2008年12月5日優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日發(fā)明者姚英,曹勃陽,王磊申請人:天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司