專利名稱：木脂素羥化酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)木脂素具有引入羥基的活性的酶、及利用該酶的方法。
背景技術(shù)：
木脂素是維管束植物的次級(jí)代謝產(chǎn)物[例如，芝麻素及芝麻林酚
(sesamolin)等]，在植物中廣泛分布。到目前為止，己報(bào)道木脂素含有于 植物的種子、果實(shí)、切穗、塊莖及/或塊根等中，主要對(duì)植物中的生物體防 御體系起作用。此木脂素，因具有強(qiáng)力的抗氧化性等，所以，在植物以外的 很大范圍內(nèi)也具有生理學(xué)及藥理學(xué)功能這一點(diǎn)很受關(guān)注。木脂素具有如卜結(jié) 構(gòu)，其為具有"-C3骨架的苯丙素類化合物進(jìn)行2分子聚合的結(jié)構(gòu)，8， 8'鍵 合型最為普遍[參考Lignans，D. C. Ayres and J. D丄oike (1990)]。
代表性的木脂素，可例舉芝麻(Sesamum indicum)中含有的(+ ) — 松脂醇、(+ ) —芝麻素、(+ ) —芝麻素酚(sesaminol) 、 ( + ) —芝麻 林酚(sesamolin)及(+ ) —芝麻酚林酚(sesamolinol);連翹(Forsythia intermedia)中含有的(+ )—松脂醇、(_)—牛蒡子苷元(arctigenin) 及(一) 一羅漢松脂素(matairesinol);唐古特瑞香(Daphne tangutica) 中含有的(一)一松脂醇及(一)一落葉松脂素；亞麻(Linum usitatissimum) 中含有的(+ ) —開環(huán)異落葉松脂素(Secoisolariciresinol)等[參考 Photochemistry Rev. (2003) 2: 257 — 288]。上述木脂素的分子結(jié)構(gòu)多種 多樣，從骨架結(jié)構(gòu)上按8種亞類(sub class)分類[參考Phytochemistry Rev. (2003) 2:371-390]。
木脂素的生物合成途徑以胡麻科芝麻、木樨科連翹、亞麻科亞麻為屮心 進(jìn)行，已報(bào)道了一些催化代謝途徑的酶及基因。其中，報(bào)道了松脂醇是通過 松柏醇聚合而合成的生物合成上最初的木脂素，且由(+ ) —松脂醇經(jīng)過各
6種植物種中特有的生物合成途徑合成多種多樣的木脂素[參考
J. Wood. Sci. 53， 273-284 (2007) 、 Lig腿s :biosynthesis and function, Comprehensive natural products chemistry, (1999) 1:640-713]。 另夕卜， 通過胡椒醇合成酶對(duì)(+ ) —松脂醇作用而合成胡椒醇。松脂醇是木脂素生 物合成途徑中最初合成的木脂素，所以，是分布于許多植物中的主要的木脂 素，例如，含有于菊科、木樨科、夾竹桃科、傘形花科、瑞香科、木蘭科、 百合科、松科植物中。
參與木脂素生物合成的酶，已報(bào)道有對(duì)連翹(Forsythia intermedia) 等中松脂醇的合成起作用的dirigent蛋白質(zhì)(排列蛋白質(zhì))[參考非專利文 獻(xiàn)6: Plant Physiol. ， (2000)123: 453及專利文獻(xiàn)1:日本特表2001—507931 公報(bào)等]。此外，參與木脂素生物合成的酶的基因及其利用，已報(bào)道冇連翹的 松脂醇一落葉松脂素還原酶基因[參考非專利文獻(xiàn)7: J. Biol. Chem. ， ( 1996) 271: 29473及專利文獻(xiàn)l]、西部紅柏(Thuja plicata)的松脂醇一落葉松 脂素還原酶基因(參考非專利文獻(xiàn)8)以及重組開環(huán)異落葉松脂素脫氫酶及 其使用方法[參考非專利文獻(xiàn)9: J. Biol. Chem., (2001) 276: 12614及專利 文獻(xiàn)2:日本特表2002 — 512790公報(bào)等]。且還報(bào)道了芝麻中的具有胡椒醇-芝麻素合成活性的細(xì)胞色素P450酶基因以及使用方法[參考非專利文獻(xiàn)10: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, (2006) 103:10116及專利文獻(xiàn)3:日本特表2007 —507201公報(bào)]。
已知木脂素骨架形成后受到糖苷化、羥基化、甲基化、異戊二烯化等多 種多樣的修飾，己報(bào)道對(duì)于作為芝麻木脂素的芝麻素酚(sesaminol)等的呋 喃駢呋喃型木脂素具有糖苷化活性的糖苷酶基因己被分離，還報(bào)道/K使川 方法(參考專利文獻(xiàn)l:日本特開2006 — 129728公報(bào))。
已知原產(chǎn)中國(guó)的菊科橐吾屬干崖子橐吾(Ligularia kanaitizensis)、 夾竹桃科黃蟬屬黃蟬(Allamanda neriifolia)中，存在以松脂醇為代表的 呋喃駢呋喃型木脂素的9位的羥基化衍生物[參考非專利文獻(xiàn)1: Lignans， D.C.Ayresand J. D. Loike (1990);非專利文獻(xiàn)2: Phytochemistry， ( 1988) 27, 575、非專利文獻(xiàn)3: Indian J. Chem. ， (1995) 34B, 975等]。已報(bào)道了 9
7位的羥基化衍生物9一羥基松脂醇通過體內(nèi)(in vivo)試驗(yàn)而證明的抗氧化
活性、丁酰膽堿酯酶抑制活性、還有最近研究出的對(duì)氧化損傷的神經(jīng)細(xì)胞的
保護(hù)作用。此外，還報(bào)道了在羥基被進(jìn)一步修飾而成為酯基的2—甲基一2 — 丁烯酸一松脂醇中，具有抗HIV-1反轉(zhuǎn)錄酶(RT)活性，其生物合成途徑還 有待闡明[參考非專利文獻(xiàn)4: J. Pharmacy and Pharmacology, (2005) 57， 233.;非專利文獻(xiàn)5: Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences, (2005) 42,167; 非專利文獻(xiàn)6: J. Pharm. Pharmacol., (2007) 59:521 等]。
如上所述，盡管報(bào)道了具有羥基的木脂素的有用性，但作為木脂素的羥 化酶，至今為止也只知道從蒺藜科Chaparral中分離的(+ ) —Larreatricin 羥化酶(參考非專利文獻(xiàn)7: Proc. Nat. Acad. Sci.USA， (2006) 100:10641)。 此酶屬于植物氧化酶的一種的多酚氧化酶(PP0)家族[參考非專利文獻(xiàn)8: Trends in Plant Science, (2007) 12， 29]。此外，還已知除本酶家族以外， 細(xì)胞色素P450酶、2-酮戊二酸依賴型加氧酶等的氧化酶家族也催化木脂素的 羥基化反應(yīng)(參考非專利文獻(xiàn)9: De Montellano, P. R. 0. ， Cytochrome P450-structure, mechanisum， and biochemistry. 3rd edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers, NY. (2005)及非專利文獻(xiàn)10: J. Biol. Chem.
(2004) 279,1206)。但是，(+ ) 一Larreatricin羥化酶是呋喃環(huán)9 (9，)
位上沒有氧的木脂素的羥化酶，所以，對(duì)于催化以松脂醇為代表的呋喃駢呋 喃型木脂素的9位羥化酶依然不清楚。因此，更加希望獲得木脂素羥化酶基
因和進(jìn)行功能分析。
專利文獻(xiàn)l日本特開2006-129728公報(bào)
非專利文獻(xiàn)l Lignans，D.C. Ayres and J. D. Loike (1990)
非專利文獻(xiàn)2 Phytochemistry, (1988) 27,575
非專利文獻(xiàn)3 Indian丄Chem. ，(1995) 34B， 975
非專利文獻(xiàn)4 J. Pharmacy and Pharmacology, (2005) 57,233.
非專利文獻(xiàn)5 Proceedings of the Pakistan Academy of Sciences,
(2005) 42，167;非專利文獻(xiàn)6 J. Pharm. Pharmacol.,(2007) 59:521 非專利文獻(xiàn)7 Proc. Nat. Acad. Sci.USA， (2006) 100:10641 非專利文獻(xiàn)8 Trends in Plant Science, (2007) 12,29 非專禾U文獻(xiàn)9 De Montellano， P. R. 0., Cytochrome P450-structure,
mechanisum， and biochemistry. 3rd edition. Kluwer Academic/Plenum
Publishers, NY. (2005)及
非專利文獻(xiàn)10丄Biol. Chem. (2004) 279， 1206.

發(fā)明內(nèi)容
鑒于以上情況，本發(fā)明的目的在于提供具有木脂素羥基化活性的酶，特 別是提供催化向木脂素類中引入羥基的反應(yīng)的醇，優(yōu)選催化由胡椒醇向9一 羥基胡椒醇、由松脂醇向9一羥基松脂醇進(jìn)行的羥基化反應(yīng)的酶。換句話說， 本發(fā)明的目的在于，使用具有向木脂素(優(yōu)選9位)引入羥基的活性的酶， 提供代謝工程學(xué)上的羥基化木脂素(優(yōu)選9位被羥基化的木脂素；以下稱9 一羥基化木脂素)。
本發(fā)明的目的還在于，提供為高效生成木脂素或羥基化木脂素，用代謝 工程學(xué)的方法制作使木脂素和羥基化木脂素含量比增加或減少的植物的方 法。
本發(fā)明涉及如下所示的具有木脂素羥基化活性的多肽、編碼該多肽的多 核苷酸、含有該多核苷酸的載體或轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體制造具有木脂素羥 基化活性的多肽的方法等。
(1) 多肽，其為具有木脂素羥基化活性的多肽，含有
(a) 序列號(hào)26的氨基酸序列；
(b) 序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、插入、取
代及/或附加的氨基酸序列；或
(c) 與序列號(hào)26的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列。
(2) 多肽，其為上述(1)中所述的具有木脂素羥基化活性的多肽，含
有(a)序列號(hào)26的氨基酸序列；或
(b')序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、插入、 取代及/或附加的氨基酸序列。
(3) 多核苷酸，其特征在于，是下述(a) (e)的任一個(gè)
(a) 多核苷酸，其含有序列號(hào)27的堿基序列；
(b) 多核苷酸，其編碼含有序列號(hào)26的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(c) 多核苷酸，其編碼在序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 15個(gè)氨基酸 發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的多肽，且具有木脂素羥基化活性的多肽;
(d) 多核苷酸，其編碼與序列號(hào)26的氨基酸序列有至少80%同源性的 多肽，且具有木脂素羥基化活性的多肽；或
(e) 多核苷酸，其與序列號(hào)27的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的
多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有木脂素羥基化活性的多肽。
(4) 上述(3)中所述的多核苷酸，其編碼具有木脂素羥基化活性的多 肽，且是下述(f) (i)中的任一個(gè)-
(f) 多核苷酸，其由序列號(hào)27的堿基序列組成；
(g) 多核苷酸，其與序列號(hào)27的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的
多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件雜交；
(h) 多核苷酸，其由與序列號(hào)27的堿基序列至少90%同源的堿基序列
組成；或
(i) 多核苷酸，其是序列號(hào)27的堿基序列中，1 多個(gè)堿基發(fā)生缺失、 插入、取代及/或附加的多核苷酸。
(5) 多核苷酸，其是上述(3)中所述的多核苷酸，由序列號(hào)27的堿
基序列組成。
(6) 上述(3) (5)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，所述木脂素 羥基化活性是對(duì)木脂素的9位的羥基化。
(7) 寡核苷酸，其特征在于，其由上述(3) (6)中任一項(xiàng)所述的 多核苷酸的片段或其互補(bǔ)序列組成。(8) 上述(7)中所述的寡核苷酸，其特征在于，其抑制上述(1)或
(2)中所述的多肽的表達(dá)。
(9) 載體，其特征在于，包含上述(3) (6)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
(10) 多肽的制造方法，其特征在于，其使用上述(9)中所述的載體。
(11) 轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了上述(3) (6)中任一項(xiàng)所述的 多核苷酸。
(12) 上述(11)中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過導(dǎo)入木脂素及上 述(3) (6)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，改變了羥基化木脂素的含有比率。
(13) 上述(11)或(12)中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其是生物或 其后代或來自生物或其后代的組織。
(14) 上述(13)中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，上述生物是植物。
(15) 上述(14)中所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，上述植物是芝麻、連 翹或亞麻。
(16) 用于制造多肽的方法，其特征在于，使用上述(11) (15)中 任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體。
(17) 羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，使用上述(11) (15)
中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體。
(18) 上述(17)中所述的羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，上
述羥基化木脂素的底物為胡椒醇或松脂醇。
(19) 細(xì)胞，其特征在于，含有上述(9)中所述的載體。
(20) 上述(19)中所述的細(xì)胞，其特征在于，其是來自芝麻、連翹或 亞麻的細(xì)胞。
(21) 用于制造多肽的方法，其特征在于，使用上述(19)或(20)中 所述的細(xì)胞。
(22) 羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，使用上述(19)或(20) 中所述的細(xì)胞。
ii(23) 上述(22)中所述的羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，上 述羥基化木脂素的底物為胡椒醇、松脂醇。
(24) 羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，使用上述(1)或(2) 中所述的多肽。
(25) 上述(24)中所述的羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，J二 述羥基化木脂素的底物為胡椒醇或松脂醇。
(26) 食品或工業(yè)產(chǎn)品，其特征在于，含有通過上述(17) 、 (22)或 (24)中任一項(xiàng)所述的制造方法得到的羥基化木脂素。
(27) 上述(26)中所述的食品或工業(yè)產(chǎn)品，其特征在于，上述羥基化 木脂素的底物為胡椒醇或松脂醇。
(28) 增加生物中羥基化木脂素含量的方法，其特征在于，包含將上述 (3) (6)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)生木脂素的生物中的工序。
(29) 上述(28)中所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生上述木脂素的生物 為芝麻、連翹或亞麻。
(30) 上述(28)或(29)中所述的方法，其特征在于，上述木脂素為 胡椒醇或松脂醇。
(31) 減少生物中羥基化木脂素含量的方法，其特征在于，包含將上述 (8)中所述的寡核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)生木脂素的生物中的工序。
(32) 上述(31)中所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生上述木脂素的生物 為芝麻、連翹或亞麻。
(33) 上述(31)或(32)中所述的方法，其特征在于，上述木脂素為
胡椒醇或松脂醇。
(34) 化合物，其是具有下述通式的化合物(9一羥基胡椒醇)，0CH3
如利用本發(fā)明所涉及的多肽(木脂素羥化酶)，即可達(dá)到人為調(diào)節(jié)生物 (特別是植物)中木脂素及羥基化木脂素的量的效果。此外，通過使用本發(fā) 明所涉及的木脂素羥化酶，在木脂素中導(dǎo)入新型羥基，可對(duì)其羥基進(jìn)--步進(jìn) 行修飾，例如可進(jìn)行糖苷化、酯化?；谏鲜鲂Ч景l(fā)明可開發(fā)出新型生 理功能物質(zhì)。
通過使用基因重組技術(shù)，使本發(fā)明所涉及的木脂素羥化酶在所需生物中
表達(dá)，可達(dá)到由胡椒醇人工生產(chǎn)9一羥基胡椒醇、及/或由松脂醇人工生產(chǎn)9 一羥基松脂醇的效果。此外，通過使用基因重組技術(shù)，使本發(fā)明所涉及的木 脂素羥化酶在所需生物中表達(dá)，即可達(dá)到制成人為控制了木脂素和羥基化木 脂素的量的植物及/或微生物的效果。


圖1表示通過RT-PCR的SiD基因的表達(dá)分析。
圖2表示SiD6的生成物的HPLC分析。
圖3表示通過SDS-PAGE的SiD6重組蛋白質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果。
圖4表示P3 (9—羥基胡椒醇)的通過麗R分析的信號(hào)歸屬。
圖5表示P3 (9—羥基胡椒醇)的結(jié)構(gòu)。
圖6表示SiD6催化的木脂素羥基化反應(yīng)的概括圖。
具體實(shí)施例方式
13本發(fā)明者使用與到目前為止已知的、作為木脂素羥化酶的多酚氧化酶不
同的、屬于氧化酶家族的2 —酮戊二酸(以下稱為2-0G。)依賴性雙加氧酶 基因作為探針，由芝麻種子cDNA文庫(kù)中綜合式得到芝麻2-0G依賴性雙加氧 酶樣基因群組(以下稱為SiD基因)。使得到的各SiD基因在大腸桿菌中表 達(dá)。使這些重組蛋白質(zhì)與松脂醇或胡椒醇反應(yīng)后，使用HPLC分析、LC-MS分 析及薩R分析，篩選催化羥基松脂醇或羥基胡椒醇生成的酶。其結(jié)果可知， SiD6催化由松脂醇生成9一羥基松脂醇的反應(yīng)，且可知Sid6催化由胡椒醇生 成9一羥基胡椒醇的反應(yīng)。此木脂素是到目前為止從未報(bào)道過的新型羥基木 脂素。
以下詳細(xì)敘述本發(fā)明所涉及的具有木脂素羥基化活性的多肽、編碼該多 肽的多核苷酸及所述多肽、多核苷酸的利用。 (1)多肽
本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)了以木脂素、特別是以胡椒醇及/或松脂醇為主要底物的 新型羥化酶，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)上述新型羥化酶羥基化胡 椒醇，而到目前為止，羥基胡椒醇還未被發(fā)現(xiàn)。
首先，本發(fā)明提供多肽，其為具有木脂素羥基化活性的多肽，含有(a)
序列號(hào)26的氨基酸序列；(b)序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 15個(gè)氨
基酸發(fā)生缺失、插入、取代及/或附加的氨基酸序列；或(c)與序列號(hào)26 的氨基酸序列有至少80%同源性的氨基酸序列。
在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"多肽"可與"肽"或"蛋白質(zhì)"互換使用。 此外，多肽的"片段"指該多肽的部分片段。此外，本發(fā)明所涉及的多肽可 為由天然供給源分離的多肽，也可為化學(xué)合成后的多肽。
術(shù)語(yǔ)"被分離"的多肽或蛋白質(zhì)，指從其天然環(huán)境中提取的多肽或蛋白 質(zhì)。例如，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽及蛋白質(zhì)，可認(rèn)為與通過任 意的適當(dāng)?shù)募夹g(shù)實(shí)質(zhì)上純化的天然或重組的多肽及蛋白質(zhì)同樣被分離。
本發(fā)明所涉及的多肽，包括天然的純化產(chǎn)物、通過化學(xué)合成方法合成的 產(chǎn)物及由原核生物宿主或真核生物宿主(例如，包括細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、 高等植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞)通過重組技術(shù)產(chǎn)生的產(chǎn)物。依賴重組產(chǎn)生方法中所使用的宿主，本發(fā)明所涉及的多肽可被羥基化或未被羥基 化。且本發(fā)明所涉及的多肽在一些時(shí)候，作為宿主介導(dǎo)過程的結(jié)果，可含有 起始改變的蛋氨酸殘基。
在本說明書中使用時(shí)，"木脂素羥基化活性"是指對(duì)木脂素進(jìn)行羥基化 的活性(優(yōu)選生成9 —羥基化木脂素活性)，即指向木脂素轉(zhuǎn)移羥基的活性。 即在本說明書中使用時(shí)，羥化酶與羥基轉(zhuǎn)移酶可互換使用。
在實(shí)施方式之一中，本發(fā)明所涉及的多肽優(yōu)選是由序列號(hào)26的氨基酸序
列組成的多肽。
在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的多肽優(yōu)選是如上所述的由序列號(hào)26 的氨基酸序列組成的多肽的突變體、且具有木脂素羥基化活性。
此種突變體可例舉為包含缺失、插入、倒位、重復(fù)、及形式(type)取 代(例如，親水性殘基取代為其他殘基，但是通常，強(qiáng)疏水性殘基不取代強(qiáng) 親水性殘基)的突變體。特別是多肽中，"中性"氨基酸取代一般基本不影 響其多肽的活性。
多肽氨基酸序列中的一些氨基酸可在不顯著影響此多肽的結(jié)構(gòu)或功能的 情況下被容易地改變,這是該領(lǐng)域中眾所周知的。且不僅是人為改變，在天然 的蛋白質(zhì)中存在有不使該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能顯著改變的突變體也是眾所周 知的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用周知技術(shù)，容易地使多肽氨基酸序列中1 多個(gè) 氨基酸發(fā)生突變。例如，根據(jù)公知的定點(diǎn)誘變法，可使編碼多肽的多核苷酸 的任意堿基發(fā)生突變。此外，可針對(duì)編碼多肽的多核苷酸的任意位點(diǎn)設(shè)計(jì)引 物，制備缺失突變體或附加突變體。且如使用本說明書中所述的方法，可容 易地確定所制備的突變體是否具有所需活性。
優(yōu)選突變體具有保守性或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。優(yōu)選沉默 取代、添加及缺失，特別優(yōu)選保守性取代。這些均不改變本發(fā)明所涉及的多 肽活性。
被認(rèn)為是代表性的保守性取代，為脂肪族氨基酸Ala、 Val、 Leu、及l(fā)ie 中1個(gè)氨基酸取代為其他氨基酸；羥基殘基Ser及Thr的互換、酸性殘基Asp及Glu的互換、酰胺殘基Asn及Gln之間的取代、堿基性殘基Lys及Arg的 互換、以及芳香族殘基Phe、 Tyr之間的取代。
如上詳示，有關(guān)哪種氨基酸的變化可能是沉默表達(dá)型(即是否對(duì)功能無 顯著有害的效果)的進(jìn)一步的介紹，可見于Bowie， J.U.等《Decipheringthe Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions)) ， Science 247:1306-1310 (1990)(在本說明書中作為參 考引用)中。
本發(fā)明中的優(yōu)選多肽，是具有木脂素羥基化活性的多肽，含有(a)序列
號(hào)26的氨基酸序列；或(b，)序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 多個(gè)氨基
酸發(fā)生缺失、插入、取代及/或附加的氨基酸序列。此種突變多肽，不局限于 如上所述的、具有通過公知的突變多肽制備法人為導(dǎo)入的突變的多肽，還可 以是分離純化天然存在的多肽后的產(chǎn)物。
本發(fā)明所涉及的多肽，可以是氨基酸以肽鍵結(jié)合形成的多肽，但不限于 此，也可為包含多肽以外的結(jié)構(gòu)的復(fù)合多肽。在本說明書中使用時(shí)，"多肽 以外的結(jié)構(gòu)"，可例舉為糖鏈、異戊二烯基等，但無特別限定。
此外，本發(fā)明所涉及的多肽也可包含附加多肽。附加多肽，例如可為組 氨酸標(biāo)簽(His tag) 、 c-Myc標(biāo)簽(c_Myc tag) 、 Flag等的表位標(biāo)記多肽。
此外，本發(fā)明所涉及的多肽，可以是將編碼本發(fā)明所涉及的多肽的多核 苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，使該多肽在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的狀態(tài)，也可以是從細(xì)胞、組 織等中分離純化的狀態(tài)。且本發(fā)明所涉及的多肽也可為化學(xué)合成。
在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的多肽可如融合蛋白一樣，以改變 了的形態(tài)重組表達(dá)。例如，本發(fā)明所涉及的多肽的附加氨基酸[標(biāo)簽(tag)]、 特別是帶電氨基酸的區(qū)域，為改善在宿主細(xì)胞內(nèi)、在純化期間或持續(xù)操作及 保存期間的穩(wěn)定性及持續(xù)性，可附加在多肽的N末端及/或C末端。多肽可 具有多個(gè)標(biāo)簽(tag)，各個(gè)標(biāo)簽(tag)的位置可分離也可連續(xù)。
在本實(shí)施方式中涉及的多肽的N末端或C末端可附加標(biāo)簽(tag)標(biāo)記[標(biāo) 簽(tag)序列或標(biāo)記(marker)序列]，標(biāo)簽標(biāo)記，例如是編碼使融合多肽 容易進(jìn)行純化的肽的序列。此種序列可在多肽的最終制備前除去。在本發(fā)明
16的此特定優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)簽氨基酸序列是六聚組氨酸肽[例如，由PQE
載體(Qiagen, Inc.)提供的標(biāo)簽]，其他情況下，很多可由公共的及/或商 業(yè)手段獲得。例如，如Gentz等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)(本說明書中作為參考引用)中記載，六聚組氨酸用于融合蛋白的 簡(jiǎn)單的純化。"HA"標(biāo)簽是用于針對(duì)來自流感紅血球凝集素(HA)蛋白的表 位進(jìn)行純化的其他有用的肽，在Wilson等、Cell 37: 767 (1984)(本說明 書中作為參考引用)中有所記載。其他的此種融合蛋白，包括在N或C末端進(jìn) 行Fc融合的本實(shí)施方式所涉及的多肽或其片段。
本發(fā)明所涉及的多肽，如以下詳述可重組生成，也可化學(xué)合成。 重組生成的進(jìn)行可使用該領(lǐng)域中眾所周知的方法，例如，可使用以下詳 述的載體及細(xì)胞進(jìn)行。
合成肽可使用化學(xué)合成的公知方法合成。例如，Houghten記載了用于多 數(shù)的肽合成的簡(jiǎn)單方法，其中，多數(shù)的肽為用不足4星期時(shí)間制備且具有特征 的、表示HAl多肽片段的單一氨基酸改造物的10 20mg的248個(gè)不同的13殘基 月太。Houghten，R.A. ，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 82:5131-5135 ( 1985)。此 "Simultaneous Multiple Peptide Synthesis (SMPS)"方法并在Houghten 等(1986)的美國(guó)專利第4， 631， 211號(hào)中記載。此方法中，將用于各種肽的 固相合成的各種樹脂置于各自的溶劑透過性袋(packet)中，可最佳使用與 固相法相關(guān)的大量相同的重復(fù)工序。完整的操作手冊(cè)的步驟，可同時(shí)進(jìn)行 500 1000以上的合成(Houghten等、前面己出現(xiàn)、5134)。這些文獻(xiàn)在本說
明書中作為參考引用。
如下詳述，本發(fā)明所涉及的多肽，在用于對(duì)木脂素進(jìn)行羥基化以得到羥 基化木脂素的方法及在試劑盒中有用。
本發(fā)明所涉及的多肽，可催化木脂素(特別是胡椒醇或松脂醇)的羥基 化反應(yīng)。
如此可以說，本發(fā)明所涉及的多肽至少含有序列號(hào)26所示的氨基酸序列 即可。即應(yīng)該注意的是，由序列號(hào)26所示的氨基酸序列和具有特定功能[例如 標(biāo)簽(tag)]的任意的氨基酸序列組成的多肽也包含于本發(fā)明中。且序列號(hào)
1726所示的氨基酸序列及該任意的氨基酸序列，可在不妨礙各自功能的情況下 用適合的連接肽連接。
此外，本發(fā)明所涉及的多肽，因該多肽除具有對(duì)松脂醇進(jìn)行羥基化的活 性以外還具有對(duì)胡椒醇進(jìn)行羥基化的活性，所以，該多肽的用途應(yīng)不限定于 對(duì)松脂醇進(jìn)行羥基化生成它們的羥基化物。
也就是說，本發(fā)明的目的在于提供具有對(duì)木脂素進(jìn)行羥基化活性的多肽， 不在于本說明書中具體記載的多肽制備方法等。因此，必須注意的是，通過 上述各方法以外的方法得到的具有羥基化木脂素活性的多肽也屬于本發(fā)明的 技術(shù)范圍。
(2)多核苷酸
此外，本發(fā)明還提供編碼具有木脂素羥基化活性的本發(fā)明所涉及的多肽
的多核苷酸。具體地說，本發(fā)明提供多核苷酸，其特征在于，是下述(a) (e)的任一個(gè)。
(a) 多核苷酸，其含有序列號(hào)27的堿基序列；
(b) 多核苷酸，其編碼含有序列號(hào)26的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
(c) 多核苷酸，其編碼序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 15個(gè)氨基酸發(fā) 生缺失、取代、插入及/或附加的、且具有木脂素羥基化活性的多肽；
(d) 多核苷酸，其編碼與序列號(hào)26的氨基酸序列有至少80%同源性、
且具有木脂素羥基化活性的多肽；或
(e) 多核苷酸，其與序列號(hào)27的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的
多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有木脂素羥基化活性的多肽。
在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"可與"基因"、"核酸"或"核 酸分子"互換使用，指核苷酸的聚合體。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"堿基 序列"可與"核酸序列"或"核苷酸序列"互換使用，用脫氧核糖核酸(省 略為A、 G、 C及T)的序列表示。"含有序列號(hào)l所示的堿基序列的多核苷酸或 其片段"是指包含用序列號(hào)1的各脫氧核苷酸A、 G、 C及/或T表示的序列的多
核苷酸或其片段部分。
本發(fā)明所涉及的多核苷酸可以RNA (例如mRNA)的形態(tài)或DNA的形態(tài)(例如cDNA或基因組DNA)存在。DNA可以是雙鏈或單鏈。單鏈DNA或RNA可以是編 碼鏈(也稱作正義鏈)或也可以是非編碼鏈(也稱為反義鏈)。
在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"是指幾個(gè)至數(shù)十個(gè)核苷酸結(jié)合 的產(chǎn)物，可與"多核苷酸"互換使用。寡核苷酸，短的稱為二核苷酸(二聚 體)、三核苷酸(三聚體)，長(zhǎng)的用30mers或100mers聚合的核苷酸的數(shù)量表
示。寡核苷酸可作為更長(zhǎng)的多核苷酸的片段生成，也可化學(xué)合成。
本發(fā)明所涉及的多核苷酸的片段，至少為12nt (核苷酸)，優(yōu)選為至少 約15nt，更優(yōu)選為至少約20nt，且更優(yōu)選為至少約30nt，進(jìn)一步更優(yōu)選為至 少約40nt長(zhǎng)度的片段。至少20nt長(zhǎng)度的片段，例如是指包含序列號(hào)l所示的堿 基序列中的20個(gè)以上連續(xù)的堿基片段。參考本說明書，因本說明書已提供序 列號(hào)l所示的堿基序列，所以，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地制備基于序列號(hào)l的 DNA片段。例如，為制備各種大小的片段，可方便地使用限制性核酸內(nèi)切酶來 切割或通過超音波剪切，或此種片段也可合成制備。適合的片段(寡核苷酸) 可通過Applied Biosystems Incorporated ( ABI， 850 Lincoln Center Dr. ， Foster City, CA 94404) 392型合成儀等合成。
本發(fā)明所涉及的多核苷酸，其5'端或3'端可與編碼上述標(biāo)簽(tag) 標(biāo)記[標(biāo)簽(tag)序列或標(biāo)記(marker)序列)]的多核苷酸融合。
本發(fā)明所涉及的多核苷酸，優(yōu)選編碼具有木脂素羥基化活性的多肽或其 突變體的多核苷酸。
本發(fā)明提供編碼具有木脂素羥基化活性的多肽的多核苷酸的突變體。"突 變體"，可如天然的等位基因突變體一樣天然形成。"等位基因突變體"， 是指占據(jù)生物染色體上指定基因座的基因的一些可交替的形態(tài)之一。非天然 存在的突變體，例如可使用該領(lǐng)域眾所周知的誘變技術(shù)生成。
在實(shí)施方式之一中，本發(fā)明所涉及的多核苷酸，優(yōu)選編碼具有木脂素羥 基化活性的多肽的多核苷酸的堿基序列中1個(gè) 多個(gè)堿基發(fā)生缺失、插入、取 代或附加的突變體。突變體可在編碼區(qū)或非編碼區(qū)或其兩者中產(chǎn)生突變。編 碼區(qū)中的突變，可產(chǎn)生保守或非保守的氨基酸的缺失、插入、取代及/或附加。本發(fā)明中的優(yōu)選多核苷酸，編碼具有木脂素羥基化活性的多肽，且是下 述(f) (i)中的任一個(gè)多核苷酸。
(f) 多核苷酸，其由序列號(hào)27的堿基序列組成；
(g) 多核苷酸，其與序列號(hào)27的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的 多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交；
(h) 多核苷酸，其由與序列號(hào)27的堿基序列至少90%同源的堿基序列 組成；或
(i) 多核苷酸，其為序列號(hào)27的堿基序列中，1 多個(gè)堿基發(fā)生缺失、
插入、取代及/或附加的多核苷酸。
在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的多核苷酸，包括編碼具有木脂素 羥基化活性的多肽的多核苷酸、或與該多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下雜交的多 核苷酸，優(yōu)選分離后的多核苷酸。
本發(fā)明中最優(yōu)選的多核苷酸，是序列號(hào)27的堿基序列所組成的多核苷酸。
雜交可使用如Sambrook等、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. ， Cold Spring Harbor Laboratory (1989)中所述的眾所周知 的方法進(jìn)行。通常溫度越高，鹽濃度越低，其嚴(yán)謹(jǐn)性越高(雜交越難)，可獲 得更高同源性的多核苷酸。適宜的雜交溫度因堿基序列、其堿基序列的長(zhǎng)度 不同而不同，例如，以編碼6個(gè)氨基酸的18個(gè)堿基所組成的DNA片段為探針 使用時(shí)，優(yōu)選5(TC以下的溫度。
在此，"在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交的多核苷酸"是指例如，以序列號(hào)27的堿 基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸或編碼序列號(hào)26的氨基酸序列的 多核苷酸的全部或一部分為探針，通過使用菌落雜交法、噬菌斑雜交法或 Southern雜交法等所得到的多核苷酸(例如，DNA)。雜交的方法，例如可 使用Molecular Cloning 3rd Ed. 、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中所記載的方法。
本說明書中所述的"嚴(yán)謹(jǐn)條件"，可為低嚴(yán)謹(jǐn)條件、中嚴(yán)謹(jǐn)條件及高嚴(yán)謹(jǐn) 條件中的任一種。"低嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5XSSC、 5XDenhardt溶液、0. 5%SDS、 50%甲酰胺、32。C的條件。"中嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5XSSC、 5XDenhardt 溶液、0.5%SDS、 50%甲酰胺、42'C的條件。"高嚴(yán)謹(jǐn)條件"，例如，為5XSSC、 5XDenhardt溶液、0. 5。/。SDS、 50%甲酰胺、50。C的條件。在上述條件中，越 提高溫度，越能期待高效獲得具有高同源性的多核苷酸(例如，DNA)。但影 響雜交嚴(yán)謹(jǐn)性的因素還可為溫度、探針濃度、探針長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度、時(shí)間、 鹽濃度等多種因素，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過適當(dāng)選擇這些因素，實(shí)現(xiàn)同樣的 嚴(yán)謹(jǐn)條件。
且雜交中使用市售的試劑盒時(shí)，例如，可使用Alkphos Direct Labelling Reagents (Amersham Pharmacia公司制)。此時(shí)，根據(jù)試劑盒中附帶的說明 方案，與標(biāo)記后的探針保溫過夜后，將膜在55"C的條件下用含有0. 1% (w/v) SDS的1次洗滌緩沖液洗滌，之后可檢測(cè)雜交后的多核苷酸(例如，DNA)。
除上述以外，可雜交的多核苷酸，通過FASTA、 BLAST等同源性搜索軟件， 使用默認(rèn)參數(shù)計(jì)算時(shí)，可例舉為與編碼序列號(hào)26的多核苷酸有80%以上、 8P/o以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88% 以上、89%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以h、 96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. P/。以上、99. 2%以上、99. 3%以卜.、 99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上99. 8%以上、99. 9%以上同源 性的多核苷酸。
且氨基酸序列、堿基序列的同源性，可使用根據(jù)Karlin及Altschul的 BLAST算法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87， 2264-2268' 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 90: 5873， 1993)決定。開發(fā)了基于BLAST算法、被稱為 BLASTN、 BLASTX的程序(Altschul SF， et al: J. Mol. Biol. 215: 403， 1990)。使用BLASTN分析堿基序列時(shí)，參數(shù)例如為score二100、 wordlength =12。且使用BLASTX分析氨基酸序列時(shí)，參數(shù)例如為score = 50、wordlength 二3。使用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)，使用各程序的默認(rèn)參數(shù)。
且本發(fā)明提供上述多核苷酸的片段或其互補(bǔ)序列所組成的寡核苷酸。 即使在本發(fā)明所涉及的寡核苷酸不編碼木脂素羥基化多肽時(shí)，本領(lǐng)域技 術(shù)人員也可容易地理解，本發(fā)明所涉及的多核苷酸可作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的引物用于制備本發(fā)明所涉及的多肽。不編碼木脂素羥基化多肽的本 發(fā)明所涉及的寡核苷酸的其他用途，可例舉為以下各項(xiàng)(1) cDNA文庫(kù)中 的木脂素羥化酶基因或其等位基因或拼接改造物的分離；(2)用于提供木脂 素羥化酶基因的正確的染色體位置的、向分裂中期染色體鋪展的原位雜交(例 如， "FISH" ) (Verma等，Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)中所記載)；及(3)用于檢 測(cè)特定組織中木脂素羥化酶mRNA表達(dá)的Northern印跡分析。
本發(fā)明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸，不僅僅為雙鏈DNA，包括構(gòu)成其 的正義鏈及反義鏈的各單鏈DNA、 RNA。本發(fā)明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸， 可作為用于通過反義RNA機(jī)理的基因表達(dá)操作的工具使用。通過反義RNA技 術(shù)，可觀察到來自內(nèi)源性基因的基因產(chǎn)物的減少。通過導(dǎo)入本發(fā)明所涉及的 寡核苷酸，可使具有木脂素羥基化活性的多肽的含量降低，其結(jié)果，可控制 植物中的羥基化木脂素含量或含量比(增加或減少)。本發(fā)明所涉及的多核 苷酸或寡核苷酸，可以是包含非翻譯區(qū)(UTR)的序列、載體序列(包括表達(dá) 載體序列)等的序列。
獲得本發(fā)明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸的方法，可例舉為分離包含本 發(fā)明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸的DNA片段的各種公知的方法。例如，制
備與本發(fā)明所涉及的多核苷酸堿基序列的一部分特異性雜交的探針，篩選基 因組DNA文庫(kù)或cDNA文庫(kù)，可得到本發(fā)明所涉及的多核苷酸或寡核苷酸。此 種探針，只要是與本發(fā)明所涉及的多核苷酸的堿基序列或其互補(bǔ)序列的至少 一部分特異性雜交的多核苷酸(寡核苷酸)即可。
通過此種雜交篩選的多核苷酸，可例舉為天然的多核苷酸(例如，來自 芝麻科植物、苔蘚植物等植物的多核苷酸)，也可為來自植物以外的多核苷 酸。
獲得本發(fā)明所涉及的多核苷酸的其他方法，可為使用PCR的方法。該P(yáng)CR 擴(kuò)增方法的特征在于，例如，包括利用本發(fā)明所涉及的多核苷酸的cDNA的5' 端及/或3'端的序列(或其互補(bǔ)序列)制備引物的工序、使用上述引物以
22基因組DNA (或cDNA)等為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的工序，使用本方法，即可大 量獲得含有本發(fā)明所涉及的多核苷酸的DNA片段。
用于得到本發(fā)明所涉及的多核苷酸的供給源無特別限定，但優(yōu)選含有胡 椒醇或松脂醇的生物材料。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"生物材料"指生物 學(xué)樣品(由生物體得到的組織樣品或細(xì)胞樣品)。下述實(shí)施例中使用芝麻， 但不限于此。
使用本發(fā)明所涉及的多核苷酸，可合成轉(zhuǎn)化體或在細(xì)胞中具有木脂素羥 基化活性的多肽。
使用本發(fā)明所涉及的多核苷酸，通過檢測(cè)雜交的多核苷酸，可容易地檢 測(cè)出表達(dá)了具有木脂素羥基化活性的多肽的生物。
本發(fā)明所涉及的寡核苷酸，通過作為檢測(cè)編碼具有木脂素羥基化活性的 多肽的多核苷酸的雜交探針或用于擴(kuò)增該多核苷酸的引物使用，可容易地檢 測(cè)出表達(dá)了具有木脂素羥基化活性的多肽的生物或組織。且進(jìn)一步，將上述 寡核苷酸作為反義寡核苷酸使用，可抑制上述生物體或其組織或細(xì)胞中具有 木脂素羥基化活性的多肽的表達(dá)。
本發(fā)明所涉及的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽除具有對(duì)松脂醇進(jìn) 行羥基化的活性以外，還具有對(duì)胡椒醇進(jìn)行羥基化的活性。因此，本發(fā)明所 涉及的多核苷酸的用途，不限定于僅將松脂醇作為底物進(jìn)行羥基化，生成這 些羥基化物(例如，9位的羥基化物)。
也就是說，本發(fā)明的目的在于，提供編碼具有對(duì)胡椒醇或松脂醇進(jìn)行羥 基化活性的多肽的多核苷酸、及與該多核苷酸雜交的寡核苷酸，而不在于本 說明書中具體記載的多核苷酸及寡核苷酸的制備方法等。因此，必須注意的 是，通過上述各方法以外的方法得到的、編碼具有對(duì)胡椒醇或松脂醇進(jìn)行羥 基化活性的多肽的多核苷酸，也屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。 (3)本發(fā)明所涉及的多肽或多核苷酸的利用
本發(fā)明還提供通過使用本發(fā)明所涉及的多肽或多核苷酸，用于調(diào)節(jié)(增 加或減少)生物(優(yōu)選植物)中的木脂素及羥基化木脂素的量的方法及該得 到調(diào)節(jié)的生物(優(yōu)選植物)的利用。
23(A)載體
本發(fā)明提供為生成具有木脂素羥基化活性的多肽而使用的載體。本發(fā)明 所涉及的載體可以是用于體外翻譯的載體，也可以是用于重組表達(dá)的載體。
本發(fā)明所涉及的載體只要含有上述本發(fā)明所涉及的多核苷酸，無特別限 定。例如，可例舉為插入了編碼具有木脂素羥基化活性的多肽的多核苷酸的
cDNA的重組表達(dá)載體等。重組表達(dá)載體的制備方法可例舉使用質(zhì)粒、噬菌體
或粘粒等的方法，無特別限定。
載體的具體種類無特別限定，可適當(dāng)選擇在宿主細(xì)胞中可表達(dá)的載體。
即選擇與宿主細(xì)胞的種類相應(yīng)的、確實(shí)使本發(fā)明所涉及的多核苷酸表達(dá)的適 合的啟動(dòng)子序列，將其與本發(fā)明的多核苷酸整合進(jìn)各種質(zhì)粒等中的載體作為 表達(dá)載體使用。
本發(fā)明所涉及的表達(dá)載體，依賴于應(yīng)導(dǎo)入的宿主的種類，含有表達(dá)調(diào)控 區(qū)(例如，啟動(dòng)子、終止子及/或復(fù)制起點(diǎn)等)。作為細(xì)菌用表達(dá)載體的啟動(dòng) 子，可使用常用的啟動(dòng)子(例如，trc啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子等)， 作為酵母用啟動(dòng)子，例如可例舉為3—磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子、PH05啟動(dòng) 子等，作為絲狀菌用啟動(dòng)子例如可例舉為淀粉酶、trpC等。并且作為動(dòng)物細(xì) 胞宿主用啟動(dòng)子可例舉為病毒性啟動(dòng)子(例如，SV40早期啟動(dòng)子、SV40晚期 啟動(dòng)子等)。表達(dá)載體的制備，可使用限制酶及/或連接酶等根據(jù)常用的方法 進(jìn)行。通過表達(dá)載體的宿主的轉(zhuǎn)化也根據(jù)常用的方法進(jìn)行。
將使用上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主進(jìn)行培養(yǎng)、栽培或詞育后，可從培養(yǎng)物 等中根據(jù)常用的方法(例如，過濾、離心分離、細(xì)胞破碎、凝膠過濾色譜法、 離子交換色譜法等)，回收、純化目的蛋白質(zhì)。
表達(dá)載體優(yōu)選含有至少1個(gè)選擇標(biāo)記。此種標(biāo)記，真核生物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí) 可例舉為二氫葉酸還原酶或新霉素抗性遺伝子及大腸桿菌(E. coli)、及其他 細(xì)菌中的培養(yǎng)時(shí)可例舉為四環(huán)素抗性基因或氨芐青霉素抗性基因。
只要使用上述選擇性標(biāo)記，即可確認(rèn)宿主細(xì)胞中是否導(dǎo)入了本發(fā)明所涉 及的多核苷酸，且可進(jìn)一步確認(rèn)在宿主細(xì)胞中是否確實(shí)進(jìn)行了表達(dá)?；蛞部?將本發(fā)明所涉及的多肽作為融合多肽使其表達(dá)，例如，也可將來自碗水母
24(Aequorea coerulescens)的綠色熒光多肽GFP (Green Fluorescent
Protein)作為標(biāo)記使用，將本發(fā)明所涉及的多肽作為GFP融合多肽使其表達(dá)。 上述的宿主細(xì)胞無特別限定，可優(yōu)選使用以往公知的各種細(xì)胞。具體地 說，例如，可例舉為大腸桿菌(Escherichia coli)等的細(xì)菌、酵母(釀酒
酵母Saccharomyces cerevisiae、 裂殖酵母SchizoSaccharomyces pombe)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)
的卵母細(xì)胞等，但無特別限定。用于上述宿主細(xì)胞的適合的培養(yǎng)基及條件為 本領(lǐng)域所公知。
將上述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法即轉(zhuǎn)化法也無特別限定，可優(yōu)選使 用電穿孔法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、DEAE葡聚糖法等以往公知的方法。此外， 例如，用昆蟲轉(zhuǎn)移表達(dá)本發(fā)明所涉及的多肽時(shí)，可利用使用了桿狀病毒的表 達(dá)系統(tǒng)。
如使用本發(fā)明所涉及的載體、將上述多核苷酸導(dǎo)入生物或細(xì)胞中，即可 使該生物或細(xì)胞中具有木脂素羥基化活性的多肽表達(dá)。且只要將本發(fā)明所涉 及的載體用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，即可合成具有木脂素羥基化活性的多
如此可以說，本發(fā)明所涉及的載體至少含有編碼本發(fā)明所涉及的多肽的 多核苷酸即可。即應(yīng)注意的是，表達(dá)載體以外的載體也包含于本發(fā)明的技術(shù) 范圍中。
即本發(fā)明的目的在于，提供含有編碼本發(fā)明所涉及的多肽的多核苷酸的 載體，而不在于本說明書中具體記載的各個(gè)載體種類及細(xì)胞種類、以及載體 制備方法及細(xì)胞導(dǎo)入方法。因此，必須注意的是，使用上述以外的載體種及 載體制備方法制得的載體，也屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。 (B)轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞
本發(fā)明提供導(dǎo)入了如上所述的編碼具有木脂素羥基化活性的多肽的多核 苷酸的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞。在本說明書中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化體"不僅包括組織 或器官，還包括生物個(gè)體。
轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞的制備方法(生產(chǎn)方法)無特別限定，例如，可例舉將上述重組載體導(dǎo)入宿主后轉(zhuǎn)化的方法。此外，成為轉(zhuǎn)化對(duì)象的生物也無特別限 定，可以是在上述宿主細(xì)胞中例舉的各種微生物、植物或動(dòng)物。
本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，其特征在于，上述轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞中天然 具有的木脂素及/或羥基化木脂素的組成已被改變。本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體 或細(xì)胞，優(yōu)選來自植物或其后代或來自植物或其后代的組織，特別優(yōu)選為芝 麻、連翹或亞麻。此種轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，可通過使用控制本發(fā)明所涉及的羥基 化木脂素含量的方法，增加或減少產(chǎn)生木脂素的生物中的羥基化木脂素含量。
在實(shí)施方式之一中，本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體可以是植物轉(zhuǎn)化體。本實(shí)施 方式所涉及的植物轉(zhuǎn)化體，可通過將含有本發(fā)明所涉及的多核苷酸的重組載 體導(dǎo)入植物中，使該多核苷酸編碼的多肽可表達(dá)，從而得到該植物轉(zhuǎn)化體。
使用重組表達(dá)載體時(shí)，用于植物體轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)載體，只要是可使本 發(fā)明所涉及的多核苷酸在該植物內(nèi)表達(dá)的載體，無特別限定。此種載體，例 如，可例舉為具有在植物細(xì)胞內(nèi)使多核苷酸組成型表達(dá)的啟動(dòng)子(例如，花 椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子)的載體或具有通過外界刺激而被誘導(dǎo)性地激活 的啟動(dòng)子(例如，金屬硫蛋白啟動(dòng)子)的載體。
本發(fā)明中成為轉(zhuǎn)化對(duì)象的植物，可以指植物體全株、植物器官(例如葉、 花瓣、莖、根、種子等)、植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組織、木質(zhì)部、 維管束、柵狀組織、海綿組織等)或植物培養(yǎng)細(xì)胞或各種形態(tài)的植物細(xì)胞(例 如，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞)、原生質(zhì)體、葉片切片、愈傷組織等的任一個(gè)。用于轉(zhuǎn)化 的植物無特別限定，可屬于單子葉植物綱或雙子葉植物綱的植物的任一個(gè)。
向植物內(nèi)導(dǎo)入基因，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的轉(zhuǎn)化方法(例如，土
壤桿菌法、基因槍法、PEG法、電穿孔法等)。例如，土壤桿菌介導(dǎo)的方法和 直接向植物細(xì)胞導(dǎo)入的方法為眾所周知。使用土壤桿菌法時(shí)，將構(gòu)建的植物 用表達(dá)載體導(dǎo)入適合的土壤桿菌[例如，根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)]，此菌株根據(jù)葉盤法(內(nèi)宮博文著，植物基因操作手冊(cè)，1990， 27 31頁(yè)，講談社scientific,東京)(日語(yǔ)原名「內(nèi)宮博文著，植物遺伝 子操作7 二 二 7 >， 1990， 27 31頁(yè)，講談社廿 < 工 > 于< 7 < 7夕，東京」)
等感染無菌培養(yǎng)葉片，可獲得轉(zhuǎn)化植物。還可使用Nagel等的方法
26[Micribiol.Lett. ，67，325 (1990)]。此方法為如下方法，首先，例如將表 達(dá)載體導(dǎo)入土壤桿菌，然后將經(jīng)轉(zhuǎn)化的土壤桿菌用Plant Molecular Biology Manual (S.B. Gelvin等、Academic Press Publishers)中記載的方法導(dǎo)入 植物細(xì)胞或植物組織。此處，"植物組織"包括通過植物細(xì)胞培養(yǎng)而得到的愈 傷組織。使用土壤桿菌法進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，可使用雙元載體(pBI121或pPZP202 等)。
將基因直接導(dǎo)入植物細(xì)胞或植物組織的方法，已知有電穿孔法、基因槍 法。使用基因槍時(shí)，可直接使用植物體、植物器官、植物組織自身，可在制 備切片后使用，也可制備原生質(zhì)體后使用。可將如此制備的樣品使用基因?qū)?入裝置[例如PDS — IOOO (BIO-RAD公司)等]處理。處理?xiàng)l件因植物或樣品不 同而不同，通常用450 2000psi左右的壓力、4 12cm左右的距離進(jìn)行。
導(dǎo)入了基因的細(xì)胞或植物組織，首先使用潮霉素抗性等的抗藥性選擇， 其次通過常規(guī)方法使植物體再生。由轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行的植物體的再生，可用與 植物細(xì)胞的種類相應(yīng)的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行。
將植物培養(yǎng)細(xì)胞作為宿主使用時(shí)，轉(zhuǎn)化是將重組載體用基因槍、電穿孔 法等導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。作為轉(zhuǎn)化結(jié)果而得到的愈傷組織、芽條、須根等可直接 用于細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)或器官培養(yǎng)，還可使用以往已知的植物組織培養(yǎng)法， 通過投入適當(dāng)濃度的植物激素(生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素、脫落酸、乙 烯、油菜素內(nèi)酯等)使植物體再生。
確認(rèn)基因是否被導(dǎo)入，可通過PCR法、Southern雜交法、Northern雜交法 等進(jìn)行。例如，從轉(zhuǎn)化植物中制備DNA，設(shè)計(jì)DNA特異性引物以進(jìn)行PCR。 PCR 可用與制備上述質(zhì)粒時(shí)所使用的條件同樣的條件進(jìn)行。之后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳或毛細(xì)管電泳等，用溴化乙錠、SYBR Green液等染色，且通過檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的l條擴(kuò)增帶，可確認(rèn)進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。此 外，使用預(yù)先通過熒光色素等標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR，也可檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。而且 也可采用在酶標(biāo)板等的固相上結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物，通過熒光或酶反應(yīng)等確認(rèn)擴(kuò)增 產(chǎn)物的方法。
一旦獲得本發(fā)明所涉及的多核苷酸整合進(jìn)基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)化體，即可通過
27該植物體的有性生殖或無性生殖得到其后代。從該植物體或其后代或這些的 克隆中，例如可得到種子、果實(shí)、切穂、塊莖、塊根、植株、愈傷組織、原 生質(zhì)體等，以這些為基礎(chǔ)可進(jìn)行該植物體的量產(chǎn)。因此，本發(fā)明中也包括可 表達(dá)地導(dǎo)入本發(fā)明所涉及的多核苷酸的植物體或與該植物體具有同源特性的 該植物體的后代或來自它們的組織。
此外，已報(bào)到了各種植物的轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體植物，例 如，可例舉為芝麻、稻子、煙草、大麥、小麥、菜籽、馬鈴薯、番茄、楊樹、 香蕉、桉樹、甘薯、黃豆、紫花苜蓿、羽扇豆、玉米、菜花、月季、菊花、 香石竹、金魚草、仙客來、蘭花、洋桔梗、小蒼蘭、非洲菊、唐菖蒲、霞阜:、 長(zhǎng)壽花、百合、天竺葵、老鸛草、矮牽牛、藍(lán)豬耳、郁金香、連翹、擬南芥 及百脈根等，但并不限于此。
在優(yōu)選實(shí)施形態(tài)中，可使用芝麻制備與本發(fā)明有關(guān)的轉(zhuǎn)化體。芝麻轉(zhuǎn)化
體的帝U備方法，例如，可例舉T, Asamizu:Transformation of sesame plants using MAT vector system:introduction of fatty acid desaturase genes. Sesame Newsletter 16:22 25 (2002)中記載的公知的方法。連翹的 轉(zhuǎn)化，可例舉Carlo Rosati， et al. :Regeneration and Agrobacterium-mediated transuformation of ForsytiaXintermedia "Spring Glory"中記載的公知的方法。
因使用上述得到的轉(zhuǎn)化芝麻及連翹，可在該芝麻內(nèi)生產(chǎn)羥基化木脂素， 所以，可用低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的生產(chǎn)流程生產(chǎn)羥基化木脂素(羥基胡椒 醇及/或羥基松脂醇)。
在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體可優(yōu)選用于煙草。煙草 與矮牽牛等均是容易轉(zhuǎn)化的代表性植物，由l個(gè)去除了細(xì)胞壁的細(xì)胞(原生 質(zhì)體)即可再生l個(gè)植物個(gè)體。此再生的l個(gè)植物個(gè)體，因與來自多細(xì)胞的 l個(gè)體不同，不會(huì)形成嵌合狀，所以可高效制備轉(zhuǎn)化體。
煙草轉(zhuǎn)化的優(yōu)選方法可例舉葉盤法。此方法是操作簡(jiǎn)便，且從1枚葉切 片可得到多個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的方法。轉(zhuǎn)化的方法，如"新生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)3核 酸的分離■分析和基因?qū)嶒?yàn)法化學(xué)同人1996年"(日語(yǔ)原名「新生物化學(xué)実験0手引含3 核酸O分離'分析S遺伝子実験法化學(xué)同人1996年」) 中記載。
具體地說，在無菌培養(yǎng)皿上從無菌培育的煙草的葉上切取葉盤，將切取 的葉盤在NB培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。然后，將預(yù)培養(yǎng)后的葉盤浸入土壤桿菌的 感染菌液中共培養(yǎng)，將葉盤植入補(bǔ)充了羧芐青霉素和卡那霉素的NB培養(yǎng)基 中，由葉盤開始繼代培養(yǎng)形成愈傷組織直至產(chǎn)生芽條后，可得到芽條。芽條 生長(zhǎng)到與莖葉部的區(qū)別很明確時(shí)，從莖部切取，移入不含抗生物質(zhì)及激素的 MS培養(yǎng)基中。切取的芽條生根后，將其在溫室培養(yǎng)。將芽條移入含有激素的 培養(yǎng)基中促其發(fā)根，同時(shí)從此芽條上切取葉子的一部分，移植到補(bǔ)充了羧芐 青霉素及卡那霉素的檢驗(yàn)培養(yǎng)基。移植約IO天后，產(chǎn)生愈傷組織的葉子看成 是卡那霉素抗性個(gè)體而回收，發(fā)生褐變的葉子看成是卡那霉素敏感性個(gè)體而 廢棄。
因使用如上所述得到的轉(zhuǎn)化煙草可在該煙草內(nèi)生產(chǎn)羥基化木脂素，所以， 可用低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的生產(chǎn)流程生產(chǎn)羥基化木脂素(羥基胡椒醇及/ 或羥基松脂醇)。
在其他優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體可優(yōu)選使用稻子。制備 稻子轉(zhuǎn)化體地實(shí)施方式之一如以下所述。
將本發(fā)明所涉及的多核苷酸導(dǎo)入含有潮霉素抗性基因的雙元載體 pPZP202中，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體。本發(fā)明所涉及的多核苷酸可與啟動(dòng)子CaMV35S
在框內(nèi)起作用地連接。
使用所得到的轉(zhuǎn)化載體，通過電穿孔法，在50mg/ 1的卡那霉素及潮霉 素的選擇下轉(zhuǎn)化根癌土壤桿菌EHA101株(Agrobacterium tumefaciens EHA101株)。所得到的土壤桿菌株到使用之前可冷凍保存。
除去野生型種子的穎片作為糙米，將其用70%乙醇?xì)⒕?分鐘，用滅菌 蒸餾水洗滌3次后，再用50%的次氯酸鈉溶液殺菌30分鐘，然后用滅菌蒸餾 水洗滌5次。將此糙米置于添加30g/l蔗糖、0.3g/l酪蛋白水解物、2.8g/l 的脯氨酸、2. 0mg/1的2， 4-滴(2， 4-D)的、含有用4. 0g/1的Gel Lyte固化 的N6培養(yǎng)基(Chu等、1975、 Sci.Sinica、 18、 659-668)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。且培養(yǎng)基pH在放入高壓滅菌器前調(diào)整到pH5. 8。使糙米在28r下 明處生長(zhǎng)4星期，得到約5mm大小的愈傷組織。此愈傷組織用于感染土壤桿 菌。
使在甘油中冷凍保存的上述土壤桿菌在含有20mg/l的卡那霉素、50mg/1 的潮霉素、lOOmg/1的壯觀霉素、調(diào)整到pH7.2的、用15g/l的瓊脂固化的 AB培養(yǎng)基(Chilton等、1974、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 71、 3672-3676) 上暗處、28t:下培養(yǎng)3天。收集土壤桿菌菌體，在含有l(wèi)Omg/1的乙酰丁香酮 (Hiei等、1994、 Plant J. 、 6、 271-282)的液體MM培養(yǎng)基(Hiei等、1994) 中懸浮。在所得到的懸浮液中將上述的愈傷組織浸漬2分鐘后，用殺菌紙巾 吸除多余的水分，將其置于含有10mg/l乙酰丁香酮的上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中，暗處28T:下進(jìn)行3天的共培養(yǎng)，以感染土壤桿菌。將所得到的感染愈 傷組織用滅菌蒸餾水洗滌10次，最后用含有500mg/l羧芐青霉素的滅菌蒸餾 水洗滌1次后，用殺菌紙巾吸除多余的水分。將此愈傷組織在含有l(wèi)Omg/1 乙酰丁香酮、50mg/l潮霉素、300mg/l羧芐青霉素的上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中28'C下培養(yǎng)2星期，再在含有50mg/l潮霉素、100mg/l羧芐青霉素的愈 傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)4星期。選擇潮霉素抗性愈傷組織，移入含有30g/l 的蔗糖、30g/l的山梨糖醇、2g/l的酪蛋白水解物、2.2mg/l的細(xì)胞分裂素、 l.Omg/1的萘乙酸(NAA) 、 lOOmg/1的羧芐青霉素、50mg/l的潮霉素及4g/l 的Gel Lyte的pH5. 8的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Murashige及Skoog、 1962、 Physiol. Plant. 、 15、 473-497)的再生培養(yǎng)基中。
如此得到轉(zhuǎn)化體可在含有潮霉素的再生培養(yǎng)基中容易地再生后，移入土 壤栽培。
因使用如上所述得到的轉(zhuǎn)化稻，可在該稻子內(nèi)生產(chǎn)羥基化木脂素，所以， 可用低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的生產(chǎn)流程生產(chǎn)羥基化木脂素(羥基胡椒醇及/ 或羥基松脂醇)。
本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇) 的生物，不論生物種是什么，均可通過導(dǎo)入上述多核苷酸生產(chǎn)該木脂素的羥 基化物。
30因使用導(dǎo)入了含有編碼本發(fā)明所涉及的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體 的轉(zhuǎn)化體，可催化將植物等的生物內(nèi)源的木脂素羥基化的反應(yīng)，所以，可用 低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的生產(chǎn)流程大量制備羥基化木脂素。且本發(fā)明可通過 大量制備羥基化木脂素，提供廉價(jià)的食品或工業(yè)產(chǎn)品。
只要使用本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體，即可在低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的條件 下提供催化木脂素羥基化反應(yīng)的多肽。
在實(shí)施方式之一中，本發(fā)明所涉及的細(xì)胞可以是各種細(xì)菌宿主。本實(shí)施 方式所涉及的細(xì)胞，可通過將含有本發(fā)明所涉及的多核苷酸的重組載體導(dǎo)入 細(xì)胞中，使該多核苷酸編碼的多肽可表達(dá)，從而來獲得。
宿主可使用原核生物或真核生物。原核生物宿主，可使用例如屬于埃希
氏菌屬(Escherichia)的細(xì)菌[例如大腸桿菌(Escherichia coli)等]、例 如屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的細(xì)菌(例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等。真核生物宿主，可使用低等真核生物(例如，酵母或絲狀菌 等的真核生物微生物)。酵母，例如可例舉為酵母屬(Saccharomyces)微生 物，[例如，酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等]，絲狀菌可例舉為， 曲霉屬(Aspergillus)微生物[例如，米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑 曲霉(Aspergillus niger)等]及青霉屬(Penicillium)微生物。此外，動(dòng) 物細(xì)胞或植物細(xì)胞也可作為宿主使用。動(dòng)物細(xì)胞可例舉為小鼠、倉(cāng)鼠、猴、 人等的細(xì)胞。而且昆蟲細(xì)胞(例如，蠶細(xì)胞或蠶的成蟲)也可作為宿主使用。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解為，根據(jù)本說明書中的記載，只要導(dǎo)入含 有編碼具有木脂素羥基化活性的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體，即可賦予 從細(xì)菌到高等植物的大范圍的生物以木脂素羥基化的能力。
本發(fā)明所涉及的細(xì)胞，只要是含有木脂素(特別是松脂醇或胡椒醇)的 生物，不論生物種是什么，均可通過導(dǎo)入上述多核苷酸生產(chǎn)該羥基木脂素。
因使用導(dǎo)入了含有編碼本發(fā)明所涉及的多肽的多核苷酸的重組表達(dá)載體 的細(xì)胞，可催化該細(xì)胞內(nèi)的木脂素羥基化反應(yīng)，所以，可用低成本且對(duì)環(huán)境 負(fù)荷低的生產(chǎn)流程大量制備羥基化木脂素。且本發(fā)明還可通過大量制備羥基 化木脂素，提供廉價(jià)的食品或工業(yè)產(chǎn)品。只要使用本發(fā)明所涉及的細(xì)胞，即可在低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的條件下 提供催化木脂素羥基化反應(yīng)的多肽。
如上所述，可以說本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，至少導(dǎo)入編碼本發(fā)明 所涉及的多肽的多核苷酸即可。即應(yīng)注意的是，通過重組表達(dá)載體以外的手 段生成的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞也包含于本發(fā)明的技術(shù)范圍。
且如上所述，本發(fā)明所涉及的多肽，該多肽除具有對(duì)松脂醇進(jìn)行羥基化 的活性以外，還具有對(duì)胡椒醇進(jìn)行羥基化的活性，所以，本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn) 化體或細(xì)胞的用途不只限定于對(duì)松脂醇進(jìn)行羥基化、生成這些的羥基化物。
即本發(fā)明的目的在于，提供其特征為導(dǎo)入編碼本發(fā)明所涉及的多肽的多 核苷酸的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，而不在于本說明書中具體記載的各個(gè)載體種及導(dǎo)入 方法。因此，必須注意的是，使用上述以外的載體種類及細(xì)胞種類、以及載 體制備方法及細(xì)胞導(dǎo)入方法得到的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞也屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。 (C)多肽的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明所涉及的多肽的方法。使用本發(fā)明所涉及的多肽 的生產(chǎn)方法，可在低成本且對(duì)環(huán)境負(fù)荷低的條件下提供催化木脂素羥基化反 應(yīng)的多肽。此外，使用本發(fā)明所涉及的多肽的生產(chǎn)方法，可容易地生產(chǎn)催化 木脂素羥基化反應(yīng)的多肽。
本發(fā)明的實(shí)施方式之一所涉及的多肽的生產(chǎn)方法中，使用含有編碼本發(fā) 明的多肽的多核苷酸的載體。
本發(fā)明的實(shí)施方式之一所涉及的多肽的生產(chǎn)方法中，優(yōu)選將上述載體用 于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。使用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)時(shí)，可使用各種市售 的試劑盒。本實(shí)施方式所涉及的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu)選包含將上述載體與無 細(xì)胞蛋白質(zhì)合成液同時(shí)溫育的工序。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式所涉及的多肽的生產(chǎn)方法中，優(yōu)選使用重組表達(dá) 系統(tǒng)。使用重組表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可采用將本發(fā)明所涉及的多核苷酸整合進(jìn)重組 表達(dá)載體后，通過公知方法使其可表達(dá)地導(dǎo)入宿主，并將在宿主內(nèi)翻譯后得 到的上述多肽純化的方法等。重組表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒也可以不是，只要
32在宿主中導(dǎo)入目的多核苷酸即可。本實(shí)施方式所涉及的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu) 選包含將上述載體導(dǎo)入宿主的工序。
如此在宿主中導(dǎo)入外源多核苷酸時(shí)，為使外源多核苷酸可表達(dá)，表達(dá)載 體優(yōu)選整合了能在宿主中起作用的啟動(dòng)子。純化重組產(chǎn)生的多肽的方法，因 使用的宿主、多肽的性質(zhì)不同而不同，但通過標(biāo)簽的利用等，可比較容易地 純化目的多肽。
本實(shí)施方式中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法，優(yōu)選進(jìn)一步包含從含有本發(fā)明 所涉及的多肽的細(xì)胞或組織的提取液中純化該多肽的工序。純化多肽的工序 優(yōu)選用公知的方法(例如，破壞細(xì)胞或組織后離心分離，回收可溶性組分的 方法)從細(xì)胞、組織中制備細(xì)胞提取液后，再?gòu)拇思?xì)胞提取液中利用公知的 方法(例如，硫酸銨沉淀或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換色譜法、 磷酸纖維素色譜法、疏水相互作用色譜法、親和層析法、羥基磷灰石色譜法 及外源凝集素色譜法)純化的工序，但不限于此。最優(yōu)選使用高效液相色譜
法("HPLC")進(jìn)行純化。
本發(fā)明的其他實(shí)施方式所涉及的多肽的生產(chǎn)方法，為從天然表達(dá)本發(fā)明 所涉及的多肽的細(xì)胞或組織中純化該多肽。本實(shí)施方式中所涉及的多肽的生 產(chǎn)方法，優(yōu)選包含使用或寡核苷酸，鑒定天然表達(dá)本發(fā)明所涉及的多肽的細(xì) 胞或組織的工序。且本實(shí)施方式中所涉及的多肽的生產(chǎn)方法還優(yōu)選進(jìn)一步包 含純化上述多肽的工序。
且在其他實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的多肽的生產(chǎn)方法的特征在于，化 學(xué)合成本發(fā)明所涉及的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理解，如基于本說明書 中所述的本發(fā)明所涉及的多肽氨基酸序列，應(yīng)用公知的化學(xué)合成技術(shù)，即可 化學(xué)合成本發(fā)明所涉及的多肽。
如上所述，根據(jù)生產(chǎn)本發(fā)明所涉及的多肽的方法而獲得的多肽，可以是 天然存在的突變多肽，也可以是人工制備的突變多肽。
制備突變多肽的方法也無特別限定。例如，可通過使用利用定點(diǎn)誘變法、 PCR法在堿基序列中 導(dǎo)入點(diǎn)突變以制備突變多肽的方法或通過插入轉(zhuǎn)座子的突變株制備法等的公
33知的突變多肽制備法，制備突變多肽。突變多肽的制備可使用市售的試劑盒。
如此可以說，本發(fā)明所涉及的多肽的生產(chǎn)方法，至少使用基于具有木脂 素羥基化活性的多肽氨基酸序列或編碼具有木脂素羥基化活性的多肽的多核 苷酸的堿基序列的公知常用技術(shù)即可。
也就是說，本發(fā)明的目的在于，提供具有木脂素羥基化活性的多肽的生 產(chǎn)方法，必須注意的是，包含上述各種工序以外的工序的生產(chǎn)方法也屬于本 發(fā)明的技術(shù)范圍。
(D)羥基化木脂素的生產(chǎn)方法
到目前為止，木脂素及羥基化木脂素的生產(chǎn)是通過從植物中提取來進(jìn)行 的，具有不能大量生產(chǎn)等的問題，但根據(jù)本發(fā)明，可用低成本大量生產(chǎn)木脂 素及羥基化木脂素。
本發(fā)明提供使用表達(dá)本發(fā)明所涉及的多肽的生物體或細(xì)胞來生產(chǎn)羥基化 木脂素的方法。上述生物體，可為天然的未改造生物體，也可為使用重組表 達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，可高效生產(chǎn)木脂 素(特別是松脂醇或胡椒醇)。
本發(fā)明的實(shí)施方式之一所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，其特征在于， 使用由編碼本發(fā)明所涉及的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化的生物體或其組織來生產(chǎn)羥 基化木脂素。上述生物體優(yōu)選為上述轉(zhuǎn)化體植物或細(xì)菌，特別優(yōu)選為大腸桿 菌、芝麻、連翹或亞麻。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，包含將編碼本 發(fā)明所涉及的多肽的多核苷酸導(dǎo)入上述生物體的工序。將多核苷酸導(dǎo)入上述 生物體的工序，可使用上述各種基因?qū)敕椒?。本?shí)施方式的此種情況下， 上述生物體在轉(zhuǎn)化前產(chǎn)生的羥基化木脂素與轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生的羥基化木脂素之間 的組成不同。具體地說，從上述生物體中得到的木脂素及其羥基化物，其含 有率增加了。本實(shí)施方式的此情況所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，優(yōu)選進(jìn) 一步包含從上述生物體中提取羥基化木脂素的工序。
在其他的實(shí)施方式中，本發(fā)明所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，包含在 天然表達(dá)本發(fā)明所涉及的多肽的生物體中，將本發(fā)明所涉及的寡核苷酸作為反義寡核苷酸導(dǎo)入的工序。將寡核苷酸導(dǎo)入上述生物體的工序，可使用上述 反義RNA技術(shù)。本實(shí)施方式所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，還優(yōu)選進(jìn)一步 包含使用或寡核苷酸、鑒定天然表達(dá)本發(fā)明所涉及的多肽的生物體的工序。 本實(shí)施方式的此情況所涉及的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，還優(yōu)選進(jìn)一步包含從 上述生物體中提取羥基化木脂素的工序。
本實(shí)施方式中，上述生物體在導(dǎo)入上述寡核苷酸前產(chǎn)生的羥基化木脂素 與導(dǎo)入后產(chǎn)生的羥基化木脂素之間的組成不同。具體地說，從上述生物體中 得到的木脂素及其羥基化物，其含有率減少了。
如此可以說，本發(fā)明所涉及的羥基化木脂素的生產(chǎn)方法，至少使用表達(dá) 本發(fā)明所涉及的多肽的生物體即可。
即本發(fā)明的目的在于，提供基于通過本發(fā)明所涉及的多肽其羥基化木脂 素的組成改變了的生物體的羥基化木脂素生產(chǎn)方法，必須注意的是，上述生 物體使用動(dòng)物、植物或各種細(xì)胞的生產(chǎn)方法也屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。
(E)食品及工業(yè)產(chǎn)品
本發(fā)明提供使用通過上述羥基化木脂素的生產(chǎn)方法制得的羥基化木脂素 而制造的食品及工業(yè)產(chǎn)品。本項(xiàng)中所述的食品，可以是上述轉(zhuǎn)化植物體的種 子、果實(shí)、切穂、塊莖及/或塊根，也可以是使用從上述轉(zhuǎn)化植物體中提取 的羥基化木脂素而制造的食品(例如，芝麻、連翹或亞麻或這些的加工食品)。 本發(fā)明所涉及的食品或工業(yè)產(chǎn)品，可含有所需量的木脂素(特別是松脂醇或 胡椒醇)。
例如，從如上所述的羥基化木脂素含量增加了的本發(fā)明所涉及的轉(zhuǎn)化植 物中提取的羥基化木脂素提取液，被作為羥基化木脂素含量高的食品提供。 且不限于提取的羥基化木脂素，上述轉(zhuǎn)化植物體的種子、果實(shí)、切穂、塊莖 及/或塊根等也可被作為大量含有羥基化木脂素的食品提供。改變羥基化木 脂素組成的對(duì)象無特別限定，除植物以外，還可以動(dòng)物、細(xì)菌或酵母等所有 的生物為對(duì)象。此外，基于木脂素及羥基化木脂素的獨(dú)特物性，本發(fā)明所涉及的多肽或 多核苷酸可作為工業(yè)產(chǎn)品(例如，實(shí)驗(yàn)用試劑、薄膜、生物分解性塑料、功 能性纖維、潤(rùn)滑油或洗滌劑等的工業(yè)產(chǎn)品)的原料利用。
本發(fā)明涉及具有木脂素羥基化活性的全部多肽及其利用，這一點(diǎn)本領(lǐng)域 技術(shù)人員應(yīng)明白。木脂素羥化酶可來自植物、動(dòng)物或微生物的任一種，只要 具有木脂素羥化酶活性，即可控制木脂素量。且本發(fā)明涉及通過導(dǎo)入編碼木 脂素羥化酶的多核苷酸而制備的木脂素量得到調(diào)節(jié)的植物、其后代或它們的 組織，其形態(tài)也可為切花。如使用本發(fā)明所涉及的木脂素羥基化多肽，即可 促進(jìn)或抑制羥基化木脂素的生成。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易理解，使用 常用的方法，在植物中導(dǎo)入上述多核苷酸使該多核苷酸組成型或組織特異性 表達(dá)，從而使目的多肽的表達(dá)增加，以及通過使用反義法、同時(shí)使用抑制法 及RNAi法等，即可抑制目的多肽的表達(dá)。
實(shí)施例
基于以下實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實(shí)施例。此外，
實(shí)施例中使用的分子生物學(xué)的方法，只要無其他詳述，均根據(jù)Molecular Cloning (Sambrook等，Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989)
中記載的方法。
(實(shí)施例l:芝麻cDNA文庫(kù)的制備) 根據(jù)制造商推薦的方法使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)，從芝 麻的種子中提取總RNA。然后，使用Oligotex MAGmRNA純化試劑盒(TaKaRa)， 得到poly A ( + ) RNA 5 u g。根據(jù)制造商推薦的方法使用ZAP Express cDNA Synthesis Kit and Zap Express cDNA Gigapack 3 Gold Cloning Kit (Stratagene)，由此poly A ( + ) RNA制備cDNA文庫(kù)。制備的文庫(kù)為 lX107pfu/ml (參考文獻(xiàn)0no et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10116-10121. 2006)。
36(實(shí)施例2:雜交探針的制備)
使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)，從十字花科擬南芥中提取總 RNA的后，根據(jù)制造商推薦的條件使用S叩erScriptTM Firtst — Strand Synthesis System for RT—PCR (Invitrogen)，由1 P g總RNA合成cDNA。 將擬南芥的2 —酮戊二酸依賴性雙加氧酶(以下20G—雙加氧酶)樣基因 At3gl3610使用At3gl3610-Fw (序列號(hào)l)及At3gl3610-Rv引物(序列號(hào)2)，
將擴(kuò)增片段作為篩選探針。
序列號(hào)l: At3gl3610-Fw: 5， -ATG GCT CCA ACA CTC TTG ACA ACC CAA-3， 序列號(hào)2: At3gl3610-Rv: 5， -TCA GAT CTT GGC GTA ATC GAC GGT TTT-3' 將非放射性同位素的DIG—核酸檢測(cè)系統(tǒng)(Roche公司)按照制造者推薦 的PCR條件使用，在通過RT—PCR得到的片段(fragment)中導(dǎo)入DIG標(biāo)記。 具體地說，PCR反應(yīng)液(50ul)的組成為各cDNA lul、 lXTaq緩沖液 (TaKaRa)、 0. 2nM dTPs、引物(序列號(hào)1及2)各O. 4pmol/ul、 rTaq聚合 酶2. 5U。 PCR反應(yīng)在94t:、反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C 1分鐘、 53'C1分鐘、72匸2分鐘的反應(yīng)的擴(kuò)增。將此DIG標(biāo)記化片段作為雜交用探 針用于以下的實(shí)驗(yàn)。
(實(shí)施例3:芝麻20G-雙加氧酶基因的篩選)
將非放射性同位素的DIG—核酸檢測(cè)系統(tǒng)(Roche公司)(roche-diagnostics)按照制造者推薦的方法使用，將實(shí)施例1中得到的cDNA文庫(kù) 用實(shí)施例2中得到的探針進(jìn)行篩選。
使用雜交緩沖液[5XSSC、 30%甲酰胺、50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)、 1%SDS、 2%封閉試劑(Roche公司)、0. 1%十二烷基肌氨酸、80g/ml鮭魚精 子DNA) ， 37匸下進(jìn)行2小時(shí)預(yù)雜交后，添加實(shí)施例2中得到的探針，保溫 過夜。將膜在含有1。/。SDS的5XSSC洗滌液中55"C下洗滌30分鐘。篩選約 lX10Vfu的噬菌斑，得到約200個(gè)陽(yáng)性克隆。
按照制造者推薦的方法使用cDNA文庫(kù)合成試劑盒，將上述500個(gè)的克隆 插入pBK—CMV質(zhì)粒(Stratagene)。使用M13RV及M13M4 (—20)的引物對(duì)，確定插入物的部分DNA序列。使用基于所得到的DNA序列得到的推定氨基酸 序列，通過Blast x進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，得到來自芝麻的20G-雙加氧酶(以下、 SiD)的部分序歹!j。使用DNA Sequencer model 3100 (Appllied Biosystems)， 使用合成寡核苷酸引物通過引物步查法確定堿基序列。通過Clustal—W分析 得到最終的7種SiD樣基因(SiD1 7)。除SiD4及SiD7以外的SiD基因， 因通過文庫(kù)篩選所得到的克隆不包含推測(cè)0RF的5'或3'端區(qū)域，所以，將 Gene Racer kit (Invitorogen)按照制造者推薦的方法進(jìn)行cDNA末端快速 擴(kuò)增[Rapid Amplification of cDNA End(以下、RACE)],擴(kuò)增各自的Sid 基因的5'及3'端區(qū)域。RACE使用如以所示的各SiD基因特異性引物對(duì)(序 列號(hào)3 15及46)。將各擴(kuò)增產(chǎn)物使用合成寡核苷酸引物通過引物步査法確 定堿基序列，得到含有全長(zhǎng)0RF的SiD序列。
序列號(hào)3: GR-SiDl-Fw3: 5， -GGG GAA CGG GCG CAG CTT GCG GGA AGA
TT
序列號(hào)4: GR-SiD1-Rv3: 5， -GGC ATC ACC ATC GGT TCC CCC ACC GTG AAA 序列號(hào)5: SiD1-nest-Fw2: 5， -TGA TCT CGT GCT GGG GTT GAA 序列號(hào)6: SiD1-nest-Rv: 5， -TGC TCA TAA TCT CCA TTT GGT 序列號(hào)7: GR-SiD2-Fw: 5' —GGT CGA CAC AAG GAC GGC GGG GCG TTA 序列號(hào)8: GR—SiD2-Rv: 5， -ACG CCC CGC CGT CCT TGT GTC GAC CTA 序列號(hào)9: SiD2-nest-Fw: 5， -ACT GAT GGC GAA TGG ATT CTT 序列號(hào)10: SiD2-nest -Rv2: 5， -TTC CTT CCA GTC CCT GAC ATT 序列號(hào)11: GR-SiD3-Rv: 5， -GGG GTT CGG ACA CTT GGG GTA GTA GA 序列號(hào)12: SiD3-nest-Rv: 5' -CAA GGC GGA TTC TTT GAC CTT 序列號(hào)13: GR-SiD5-Rv: 5， -TGA TCC ACT TCT CGC CCC GCC GGA CTT 序列號(hào)14: SiD5-nest-Rv: 5， -TGA GGG CAT TTT GGG TAA TAG 序列號(hào)15: GR-SiD6-Rv: 5， -TGC GGG TCA GGT GGA TGA GGG GCC ATT 序列號(hào)46: SiD6-nest-Rv: 5， -CAT TAC ACA AGT GAT AGT AT 所得到的含有全長(zhǎng)ORF的各SiD基因的氨基酸序列與DNA序列如下所示 (序列號(hào)16 19)。
38<formula>formula see original document page 39</formula>ATTTCTTTTG
序列號(hào)18: Sid2蛋白質(zhì)
RSNYKKLDVENIQIHHF麗氺 序列號(hào)19: Sid2 DNA<formula>formula see original document page 41</formula>序列號(hào)22: Sid4蛋白質(zhì)
IGVTQYLKELFSRELMGKSYLDLMRI* 序列號(hào)23: Sid4 DNA
AAAAAAAMAAAAAAAMM
序列號(hào)24: Sid5蛋白質(zhì)<formula>formula see original document page 43</formula>LSGMHHAANRAGIVSRVKEACEKWGFFQIINHEMPLRVMDEMIAGVRRFHEQDAEVKKKYYGRDVT
TEEEPAIYRETTYKDYERFYFANCDDGTTKLPYFRLGT* 序列號(hào)27: Sid6 DNA
TGGCAGCTTGTCAAGTACTGGATAGTTGTGAACTGACCTTCTTCACCA 序列號(hào)28: Sid7蛋白質(zhì)EDNPPKYRATTMKEYVNYYNAKGLDGTSALLHFRV*
序列號(hào)29: Sid7 DNA ATGGCCTGGAGATCTCAGACAGAAGCAAACTACGACAGAGCAAGCGAACTAAAAGCTTTTGATGAC
CTTTCACTTTAAA嵐AAAAAAAAAAA
(實(shí)施例4:芝麻20G-雙加氧酶(SiD)的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建)設(shè)計(jì)在各SiD的cDNA的起始蛋氨酸密碼子(ATG)的上游具有BamHI或 Bglll位點(diǎn)、在終止密碼子的下游具有Xhol位點(diǎn)的引物(序列號(hào)30 序列號(hào) 43)，將含有各SiD基因ORF的片段通過PCR擴(kuò)增。
序列號(hào)30: Bgl2Nco1-SiDl-Fw: 5， -TTT AGA TCT TCC ATG GCT GGA GTT GCA TCC CCA
序列號(hào)31: Sidl-endXhoI-Rv: 5， -TTG ACA TAT AAT TGA T丁T AGA TCT 序列號(hào)32: BamNco-SiD2-Fw: 5， -MA GGA TCC ATG GGA GAA GTC GAC CCT GCA TT
序列號(hào)33: SiD2-KpnXho- Rv: 5， -AAA CTC GAG GTA CCC AAC CTT CAG TAG TTC TTG AAG T
序列號(hào)34: Bgl2-SiD3-Fw: 5， -TTT AGA TCT ATG TCT GAA CTA CTC TCG GAA .
序列號(hào)35: SiD3-KpnXho-Rv: 5， -MA CTC GAG GTA CCA ACA CGT CAT ATT TTC GCA TA
序列號(hào)36: BamNco-SiD4-Fw: 5， -AAA GGA TCC ATG GAA CCA AAA TTA ACA AAG CTA
序列號(hào)37: SiD4-KpnXho-Rv: 5， -AAA CTC GAG GTA CCT ACT ACA CCC TAA ATC CTC ATA A
序列號(hào)38: BamHI-SiD5-Fw: 5， -AAA GGA TCC ATG AGC TGC TTG CAG AGC
T
序列號(hào)39: SiD5-KpnXho-Rv: 5， -AAA CTC GAG GTA CCT TAA TTA AGT TAT TGA AGT GAT TT
序列號(hào)40: Bgl2Nco-SiD6-Fw: 5， — AAA GAT CTT CCA TGG AAG TTC AGA CAA TGA M
序列號(hào)41: SiD6-KpnXho-Rv: 5， -MA CTC GAG GTA CCT GAT CAG GTG CCC AGC CTG AAA TA
序列號(hào)42: BamNco-SiD7-Fw: 5， -AAA GGA TCC ATG GCC TGG AGA TCT CAG ACA GAA序列號(hào)43: SiD7-KpnXho-Rv: 5， -MA CTC GAG GTA CCT TCA ATT CAA ACG CGG AAA TGT AA
PCR反應(yīng)液(25 ul),由作為模板的芝麻種子cDNA、各引物0. 2 pmol / ul、 lXKODplus緩沖液(T0Y0B0) 、 0. 2mMdNTPs、 lmMMgS04、 1U KODplus 聚合酶組成。94匸反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)94°C 1分鐘、55°C 1分鐘、 72°C 2分鐘的反應(yīng)的PCR擴(kuò)增后，72"C保持3分鐘。將所得到的各PCR產(chǎn) 物根據(jù)制造者推薦的方法插入pCR4 Blunt-T0P0 vector (Invitrogen)的多 克隆位點(diǎn)。確認(rèn)通過序列分析插入的PCR產(chǎn)物無錯(cuò)誤。
將亞克隆上述7種SiD后的質(zhì)粒用BamHI或BglII及Xhol或Kpnl酶切 后所得到的含有全長(zhǎng)SiD的約1. lkb的DNA片段，插入作為大腸桿菌表達(dá)載 體的pET-30a載體(Novagen)的BamHI和Xhol或Kpnl位點(diǎn)，得到7種的 SiD大腸桿菌表達(dá)載體。
(實(shí)施例5:芝麻中SiD基因的表達(dá)分析) 將7種SiD基因的芝麻植物體中的基因表達(dá)模式用RT-PCR法分析。根據(jù) 先行文獻(xiàn)
將芝麻分為成熟葉、花瓣、莖、蒴果、種子(級(jí)別1 6)、幼芽 (發(fā)芽誘導(dǎo)后1日和7日)。從lg分離器官中使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)提取RNA。以所得到的RNA 1 u g為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。 cDNA合成使用Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (GIBC0BRL)，合成條件根據(jù)本系統(tǒng)制造商推薦的條件。以所得到的各級(jí)別 cDNA為模板，使用實(shí)施例4中記載的SiD基因特異性引物(序列號(hào)30 43) 進(jìn)行PCR反應(yīng)。并且為了比較SiD基因和內(nèi)源基因表達(dá)量，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)基因使 用芝麻的18S核糖體RNA，為了擴(kuò)增本基因，合成Sil8S-Fw (序列號(hào)44)及 Sil8S-Rv引物(序列號(hào)45)。
序列號(hào)44: Sil8S-Fw: 5， -TAT GCT TGT CTC AM GAT TAA 序列號(hào)45: Sil8D—Rv: 5， — AAC ATC TAA GGG CAT CAC AGA
47由cDNA In 1、 lXEx—Taq緩沖液(TaKaRa) 、 0. 2nM dNTPs、引物各 0. 2pmo1 / p 1、 Ex—Taq聚合酶 1. 25U組成。94。C反應(yīng)5分鐘后，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)94匸l分鐘、55°C l分鐘、72°C 2分鐘的反應(yīng)的PCR擴(kuò)增后，72°C 保持7分鐘。將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過溴化乙錠染色檢 測(cè)擴(kuò)增片段。其結(jié)果顯示，雖然7種SiD基因有不同的表達(dá)模式，但全部在 積累了木脂素的芝麻種子中表達(dá)(圖l)。
(實(shí)施例6:通過大腸桿菌的SiD重組蛋白質(zhì)的表達(dá)) 將用實(shí)施例4構(gòu)建的SiD基因的大腸桿菌表達(dá)載體通過規(guī)定方法轉(zhuǎn)化到 大腸桿菌BL21 (DE3)株。將這些重組大腸桿菌在含有最終濃度為20" g / ml 的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37i:下進(jìn)行一夜預(yù)培養(yǎng)。將預(yù)培養(yǎng)液的一部分 添加在含有氨芐青霉素50ug/ml、酪蛋白水解物O. 5。/。的M9培養(yǎng)基(10ml) 中，振蕩培養(yǎng)到^(,。=0.6 1.0。其次，在培養(yǎng)液中加入最終濃度0. 5mM的 IPTG (異丙基-D-硫代半乳糖苷)，進(jìn)一步在3(TC下振蕩培養(yǎng)一夜后， 3000rpm、4。C下離心分離10分鐘進(jìn)行集菌。將菌體懸浮于10ml的緩沖液[30mM Tris-HCl (pH7. 5) 、 30mMNaCl]中后，進(jìn)行超音波処理以破碎大腸桿菌，之 后，15，000rpm、 4"離心分離10分鐘，將所得到的上清作為粗酶液用于測(cè) 定以下的活性。
(實(shí)施例7: SiD重組蛋白質(zhì)的酶分析)
松脂醇等的木脂素，例如，可根據(jù)公知的方法[日本農(nóng)藝化學(xué)會(huì)志67: 1693 (1993)](日語(yǔ)原名:「日本農(nóng)蕓化學(xué)學(xué)會(huì)誌67 : 1693 (1993)」)從芝 麻中提取及純化。底物溶解在少量的DMSO中后再溶解在70°/。乙醇中作為底物 溶液(lmg/ml)。將此底物溶液5ul、在大腸桿菌表達(dá)的各SiD的上述粗 酶液145 p 1、 0. 1M抗壞血酸鈉10 u 1、 0. 1M 2-酮戊二酸(20G) 10 yl及l(fā)OmM FeS04l0iil在反應(yīng)管中混合后，3(TC下反應(yīng)1小時(shí)。
通過將100%乙腈(150p1)添加到反應(yīng)管中，使酶反應(yīng)停止。將反應(yīng)管 用旋渦混合器劇烈攪拌后，15,000rpm、 4匸下離心分離5分鐘，將所得到的上清用過濾器(孔徑0.45匪、4腿Millex-LH, Millipore)凈化后，用高效 液相色譜法(以下HPLC)分析此上清。木脂素及其羥基化物的分析條件如下 所示。
使用O30色譜柱(野村化學(xué)C30-UG-5、 4. 6腿X150mm)進(jìn)行液相色譜 法[Lc一2010C (島津制作所)]。流動(dòng)相中A液使用O. 1%TFA， B液使用含有 0. 1%TFA的90%乙腈。使用A液65%: B液35%的混合液平衡色譜柱(20分鐘) 后，用直線濃度梯度(A液65。/。 B液35。/。一A液Oy。 B液100。/。)洗脫20分鐘
(流速0.6ml/分鐘)，用B液100。/。洗脫7分鐘。測(cè)定287nm的吸收，檢測(cè)樣 品中含有的化合物。將化合物的各譜峰用SPD—10AV (島津制作所)觀啶 190nm 400nm的光譜，尋找具有木脂素特征性2個(gè)最大吸收(230nm及280nm) 的物質(zhì)。在此條件下，在約8. 7分鐘檢測(cè)出松脂醇標(biāo)準(zhǔn)品、在約12. 8分鐘檢 測(cè)出胡椒醇標(biāo)準(zhǔn)品、在保留時(shí)間約7.9分鐘檢測(cè)出丁香脂素標(biāo)準(zhǔn)品、及在約 6.2分鐘檢測(cè)出開環(huán)異落葉松脂素標(biāo)準(zhǔn)品(圖2)。
酶反應(yīng)液的HPLC分析的結(jié)果，僅在Sid6重組蛋白質(zhì)和松脂醇的反應(yīng)液 中，得到具有木脂素的光譜的生成物P1 (保留時(shí)間約6.2分鐘)及生成物P2
(保留時(shí)間約4.3分鐘)(圖2)。而且還在Sid6重組蛋白質(zhì)和胡椒醇的反 應(yīng)液中，新得到具有木脂素的吸收光譜(保留時(shí)間約9.7分鐘)的生成物P3
(圖2)。此外，還在SiD6和丁香脂素的反應(yīng)液中，新得到具有木脂素的吸 收光譜的生成物P4(保留時(shí)間約5.8分鐘)及生成物P5 (保留時(shí)間約4.2分 鐘)(圖2)。另外，在與開環(huán)異落葉松脂素的反應(yīng)液中，未發(fā)現(xiàn)新的生成 物(圖2)。且不僅未發(fā)現(xiàn)芝麻素、芝麻素酚(sesaminol)及芝麻林酚
(sesamolin)的生成物，也未發(fā)現(xiàn)為類黃酮之一的柚皮素的生成物。由以上 結(jié)果可知，SiD6與具有呋喃環(huán)、且在苯環(huán)上至少具有相鄰的羥基和甲氧基 的木脂素反應(yīng)。(圖2)。
將來自表達(dá)SiD6的大腸桿菌的粗提取液10 u 1用于SDS-PAGE， CBB染色， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)了來自轉(zhuǎn)化pET-30a載體的大腸桿菌的粗提取液中未曾發(fā)現(xiàn)的約 45kDa左右的顯著的條帶(圖3)。此條帶大小與SiD6的推測(cè)分子量39. lkDa、 來自pET—30a載體的His-Tag、凝血酶識(shí)別位點(diǎn)、腸激酶識(shí)別位點(diǎn)及S-Tag
49200810185269.6
說明書第45/75頁(yè)
加在一起的條帶大小一致，所以，結(jié)論是表達(dá)的45kDa的條帶是重組SiD6 蛋白質(zhì)。因從酶反應(yīng)液中除去20G時(shí)，未發(fā)現(xiàn)新的生成物(圖2)，所以強(qiáng) 烈支持了反應(yīng)液中發(fā)現(xiàn)的生成物是由SiD6生成的木脂素的結(jié)論。
通過Blastx軟件檢索同源性的結(jié)果，SiD6與長(zhǎng)春花的吲哚生物堿的羥 化酶Desacetoxyvindoline 4-hydroxylase有最高47%的序列同源性，而至 今為止還沒有關(guān)于芝麻中本生物堿的報(bào)道，且用20G雙加氧酶的家族的酶對(duì) 木脂素進(jìn)行羥基化的活性為新發(fā)現(xiàn)。
(實(shí)施例8: SiD6的生成物的LC-MS分析) 通過LC-MS分析，進(jìn)行了實(shí)施例7中SiD6的生成物Pl及P3的分子量的 分析。
將充填了 lml DIAION SEPABEADS HP20樹脂(三菱化學(xué))的色譜柱用10ml 的50%丙酮洗滌后，用10ml的蒸餾水平衡。然后，將含有實(shí)施例7的SiD6 的生成物的酶反應(yīng)液200 u 1用蒸餾水分別定量到lml后的產(chǎn)物加入色譜柱， 用5ml的蒸餾水洗滌，除去蛋白質(zhì)及鹽類。其后，將用2ml的80%丙酮洗脫
木脂素后的產(chǎn)物用蒸發(fā)器干燥。
將DIAI0NHP-20樹脂(三菱化學(xué))lml充填的色譜柱用50%丙酮5ml洗滌 后，用水10ml平衡。將含有實(shí)施例7的松脂醇生成物Pl的酶反應(yīng)液加入色 譜柱，用5ml水洗滌雜質(zhì)后，用80。/。丙酮2ml洗脫反應(yīng)生成物。用蒸發(fā)器干 固洗脫液后，在含有1%甲酸的50%乙腈(100ul)中溶解，作為L(zhǎng)C-MS分析 樣品。LC條件如下所示。
使用Develosil C30-UG-3色譜柱[野村化學(xué)(株)、3.0鵬X150mm]， 流動(dòng)相中A液使用含有l(wèi)OmM乙酸銨的水、B液使用100%乙腈。用10分鐘的 直線濃度梯度(A液70。/。 B液30。/。一A液309&: B液70%)洗脫，其后，用A 液30%: B液70。/。進(jìn)行5分鐘等度洗脫。(流速0. 2ml/分鐘)。
檢測(cè)用光電二極管陣列檢測(cè)器[SPD-M10A、株式會(huì)社島津制作所]收集 230-500nm的數(shù)據(jù)，測(cè)定A280nm的色譜。且在PDA檢測(cè)器之后，連接TOF-MS 檢測(cè)器(LCMS-IT-TOF株式會(huì)社島津制作所)，進(jìn)行分子量的測(cè)定。MS的測(cè)定條件，在陰性及陽(yáng)性的兩種模式下、測(cè)定分子量范圍為100-1000Da、接口 電壓分別為4. 5KV及一3. 5KV。
在此條件下，松脂醇及松脂醇反應(yīng)生成物P1在10. l分鐘、7.9分鐘分 別被洗脫。且胡椒醇及胡椒醇生成物P3在13. 3分鐘、10. 9分鐘分別被洗脫。 LC-MS分析的結(jié)果，Pl為陽(yáng)性模式時(shí),提供m/z 375. 13 [M+H] + ，為陰性模式 時(shí)提供m/z 373.13 [M+H]—的分子離子，推測(cè)為在松脂醇上附加了羥基。且 P3為陽(yáng)性模式時(shí)，提供m/z 373.12 [M+H]+，為陰性模式時(shí)，提供m/z371.11 [M+H]—的分子離子，推測(cè)為在胡椒醇上附加了羥基。
由以上結(jié)果可知，來自芝麻的SiD6基因編碼對(duì)松脂醇及胡椒醇具有羥基 化活性的木脂素羥化酶。
(實(shí)施例9: SiD6的生成物的純化及麗R分析)
為了鑒定松脂醇的羥基化生成物Pl及P2、胡椒醇的羥基化生成物P3的 羥基化位點(diǎn)，進(jìn)行各自的純化及麗R分析。對(duì)松脂醇反應(yīng)液，將充填了 lOOnil 的DIAI0N SEPABEADS HP20樹脂(三菱化學(xué))的色譜柱用200ml的50。/。丙酮 洗滌后，用500ml的蒸餾水平衡。之后，將含有實(shí)施例7的SiD6的生成物 Pl及P2的酶反應(yīng)液100ml裝入色譜柱，進(jìn)一步用200ml的蒸餾水洗滌，以 除去蛋白質(zhì)。最后將用200ml的50。/。丙酮洗脫P(yáng)1、 P2的產(chǎn)物用蒸發(fā)器減壓濃 縮后，進(jìn)行冷凍干燥。對(duì)胡椒醇羥基化生成物P3同樣進(jìn)行純化。之后，將其 用色譜柱DevelosilC30-UG-5 (20X250 mm，野村化學(xué))、A液蒸餾水，B 液90%乙腈，洗脫條件松脂醇羥基化物(Pl 'P2) : 20%—70%B液(60min)、 胡椒醇羥基化物(P3) : 60 —100。/。B液(60min)、流速6 ml/min、檢測(cè)波 長(zhǎng)280 nm進(jìn)行分離純化?；厥丈傻闹鞣宓慕M分，制備冷凍干燥標(biāo)準(zhǔn)品。 將其用麗R (BRUKER公司、750MHz)分析的結(jié)果，可如下鑒定。
Pl:9—羥基松脂醇(洗脫時(shí)間31.0min組分)麗R : S ppm (DMS0-d6); 2.47 (1H，dd),3.08 (1H，t),3.62 (1H， ddd) ， 3.66 (1H，t)，3.76 (6H， s) ， 4.40 (1H， d) ， 5.30 (1H' d) ， 5.45 (1H， s) ， 6.74 (2H' brs) , 6.75 (2H, brs) ， 6.89 (2H， brs)。P2: 9, 9， 一二羥基松脂醇(洗脫時(shí)間22.9min組分)麗R: S卯m (DMS0—d6) ; 2.77 (2H， d) , 3.76 (6H， s) , 4.75 (2H， d) ， 5.39 (2H， d) ， 6.60 (2H， d) ， 6.73 (2H, d) ， 6.85 (2H, dd) ， 7.13 (2H， d)。
對(duì)于P3，進(jìn)行各信號(hào)的歸屬確認(rèn)(圖4)的結(jié)果，確認(rèn)其為9-羥基胡椒 醇(圖5) 。 9一羥基胡椒醇是新型化合物。從芝麻素代謝物分析來看，本新 型木脂素在生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)換為兒茶酚型的木脂素，發(fā)揮抗氧化性[先行文 獻(xiàn)Nakai， M. , et al. J. Agric. Food. Chem. 51， 1666-1670. (2003)]。
由以上結(jié)果可知，本酶是具有呋喃駢呋喃型木脂素的9位羥基化活性的 酶(圖6)。從松脂醇及胡椒醇的羥基化位置類推，與丁香脂素反應(yīng)的反應(yīng) 物P4及P5 ，其9位或9，9'位也同樣被羥基化。
本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，可在權(quán)利要求所示范圍內(nèi)作種種變更。即 對(duì)于在權(quán)利要求所示范圍內(nèi)組合適宜變更的技術(shù)手段后所得到的實(shí)施方式， 也包含于本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
如上所述，本發(fā)明所涉及的多肽及多核苷酸對(duì)木脂素的羥基化有用。且 可表達(dá)地導(dǎo)入本發(fā)明所涉及的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，在食品領(lǐng)域、各種 工業(yè)領(lǐng)域中，在木脂素羥基化或生產(chǎn)使用該物質(zhì)的產(chǎn)品上極為有用。因上述 轉(zhuǎn)化體為植物體時(shí)，可將植物體自身作為食品使用，所以，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域等中 也非常有用。
并且，通過將本發(fā)明所涉及的多肽及多核苷酸與本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)的其他酶 (合成胡椒醇及芝麻素的酶SiP189)組合，可確定特定的木脂素分子種的生 產(chǎn)體系，其結(jié)果，可擴(kuò)大特定的木脂素分子種的生產(chǎn)量。因此，本發(fā)明可廣 泛用于農(nóng)業(yè)、食品產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥品產(chǎn)業(yè)及與與上述產(chǎn)業(yè)相關(guān)聯(lián)的產(chǎn)業(yè)。序列表(SEQUENCE LISTING)
<110> 三得利株式會(huì)社(SUNTORY LTD.)
<120> 木脂素羥化酶(LIGNAN HYDROXYRASE)
<130> PIF083480C
<150> JP 2007-339510
<151> 2007-12-28
<160〉 46
<170> Peitentln version 3. 4
<210> 1
<211〉 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) 〈220〉
<223> 引物(Primer) At3gl3610-F沐
<400> 1
atggctccaa cactcttgac aacccaa 27
<210〉 2
<211〉 27
<212> DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 引物(Primer) At3gl3610-Rv
<400〉 2
tcagatcttg gcgtaatcga cggtttt 27
<210〉 3
<211> 29
<212〉 廳
<213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物(Primer) GR-SiDl-Fw3
<400〉 3
ggggaacggg cgcagcttgc ggg犯gatt 29
<210> 4 <211〉 30
53<formula>formula see original document page 54</formula><400〉 8
acgccccgcc gtccttgtgt cgaccta
<210〉 9
<211> 21
<212〉 DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 引物(Primer) SiD2-nest-Fw
<400〉 9
actgatggcg aatggattct t
<210> 10
<211> 21
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
〈223〉 引物(Priroer) SiD2—nest -Rv2
〈400〉 10
ttccttccag tccctgacat t
<210> 11
<211> 26
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 引物(Primer) GR-SiD3—Rv
<400> 11
ggggttcgga cacttggggt agtaga
<210> 12
<211〉 21
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物(Primer) SiD3—nest—Rv
<400〉 12
caaggcggat tctttgacct t
<210〉 13 <211> 27
27
21
21
26
21
55<formula>formula see original document page 56</formula>Cys Arg Asn Asp Asp Asp Asn Gly Glu Leu Asp 'Ala Thr Thr Glu Asn 35 40 45
Ser Pro lie Pro Val Val Asn lie Gly His Phe Leu Ser Gly Lys Trp 50 55 60
Ser Asp Asp Glu Ser Val Gin Glu Leu Lys Lys Leu His Ser Ala Leu 65 70 75 80
Ser Thr Trp Gly Cys Phe Gin Gly lie Gly His Gly lie Pro Ser Cys 85 90 95
Phe Leu Asp Glu Val Arg Arg Val Gly Arg Glu Phe Phe Glu Gin Pro 100 105 110
Met Glu Glu Lys Asn Lys Tyr Gly Lys Thr Val Thr Glu Phe Gin Gly 115 120 125
Tyr Gly Ala Asp Pro Val Pro Glu Glu Gly Gin Ser Leu Asp Trp Ser 130 135 140
Asp Arg Leu Phe Leu Glu Leu Val Pro Glu Asp Gin Arg Asn Tyr Arg 145 150 155 160
Phe Trp Pro Gin Asn Pro Ser Ser Phe Lys Gly Thr Leu Glu Glu Tyr 165 170 175
Ser Glu Lys Met Lys Thr Val Thr Glu lie lie Ser Lys Ser Met Ala 180 185 190
Arg Ser Leu His Leu Glu Glu Thr Cys Phe Leu Lys Gin Phe Gly Glu 195 200 205
Arg Ala Gin Leu Ala Gly Arg Phe Asn Tyr Tyr Ser Pro Cys Arg Arg 210 215 220
Pro Asp Leu Val Leu Gly Leu Lys Pro His Ala Asp Gly Ser Gly Tyr 225 230 235 240
Thr Val lie Leu Gin Asp Glu Pro Gly Leu Gin Val Leu Asn His Gly 245 250 255
57Lys Trp Tyr Thr Val Pro Lys Asn Pro Asp Ala Leu Leu Val Leu Met 260 265 270
Gly A印Gin Met Glu lie Met Ser Asn Gly Val Phe Arg Ser Pro Val 275 280 285
His Arg Val Leu Ser Asn Gly Glu Arg Asp Arg lie Ser Val Ala Val 290 295 300
Phe Tyr Thr Pro Glu Val Gly Lys Glu lie Gly Pro Glu Glu Gly Leu 305 310 315 320
lie Ser Ala Glu Ala Pro Arg Val Phe Lys Met Val Lys Asp Tyr Ala 325 330 335
Asp lie His Val Gly Tyr Tyr Gin Arg Gly Met Arg Ser Leu His Thr 340 345 350
Val Arg Val 355
<210> 17
<211〉 1330
<212〉 DNA
<213〉 芝麻(Sesamum indic咖)
<220>
<221〉 misc—feature
<223〉 Sidl DNA
<220>
<221〉 misc一feature
<222〉 (1264) . . (1264)
<223> n is a, c, g, or t
<220>
<221〉 misc一feature
<222> (1271) . . (1271)
<223> n is a， c, g， or t
<400〉 17
atggctggag ttgcatcccc acccgctgaa gtattgctgt ccaaaagagt ccaagaattg 60 gtcatcaccg gtgaggaccc gtcggggcca tacgtgtgta g咖cgacga cgac紛cggg 120<formula>formula see original document page 59</formula><400〉 18
Met Gly Glu Val Asp Pro Ala Phe lie Gin Ala Leu Glu His Arg Pro 15 10 15
Lys Pro His Ser Val Glu Ala Gin Gly lie Pro Leu lie Asp Leu Ser 20 25 30
Pro Ala Asn Ser Pro Asp Pro Asp Pro Gly Ser Leu Ser Ala Leu Ala 35 40 45
Ala Glu lie Gly Asp Ala Cys Glu Lys Trp Gly Phe Phe Gin Val lie 50 55 60
Asn His Gly Val Pro Leu His Val Arg Glu Lys lie Asp Leu Val Ser 65 70 75 80
Arg Lys Phe Phe Ala Leu Pro Lys Glu Glu Lys Lys Lys Val Ser Arg 85 90 95
Asp Glu Val Asn Pro Ser Gly Tyr Tyr Asp Thr Glu His Thr Lys Asn 100 105 110
Val Arg Asp T卬Lys Glu Val Phe Asp Phe Thr Val Gly Glu Pro Met 115 120 125
Yal Met Pro Ala Ser His Glu Pro Asp Asp Arg Glu Leu Lys Glu Val 130 135 140
lie Asn Gin T卬Pro Glu Asn Pro Ser Glu Met Arg Glu Val Cys Glu 145 150 155 160
Glu Tyr Gly Ala Glu Met Gin Lys Leu Gly His Lys Leu Leu Glu Leu 165 170 175
lie Ala Leu Ser Leu Gly Leu Ala Arg Asp Arg Phe Asn Gly Phe Phe 180 185 190
Lys Asp Gin Thr Thr Phe lie Arg Uu Asn Tyr Tyr Ala Pro Cys Pro 195 200 205
60lie Pro Asp Leu Ala Leu Gly Val Gly Arg His Lys Asp Gly Gly Ala 210 215 220
Leu Thr lie Uu Ala Gin Asp Asp Val Gly Gly Leu Glu Val Lys Arg 225 230 235 240
Lys Thr Asp Gly Glu Trp lie Leu Val Lys Pro Thr Pro Asp Ala Tyr 245 250 255
lie lie Asn Val Gly Asp lie lie Gin Val Trp Ser Asn Asp Lys Tyr
260
265 270
Glu Ser Val Glu His Arg Val Lys Val Asn Ser Glu Arg Glu Arg Phe
275
280 285
Ser lie Pro Phe Phe Leu Asn Pro Ala His Tyr Thr Met Val Glu Pro 290 295 300
Leu Glu Glu Leu Val Asn Lys Gin Asn Pro Ala Asn Tyr Asn Pro Tyr
305
310
315 320
Asn Trp Gly Lys Phe Phe Ser Thr Arg Lys Arg Ser Asn Tyr Lys Lys
325
330 335
Leu Asp Val Glu Asn lie Gin lie His His Phe Lys Asn Tyr
<210> <211〉 <212〉 <213>
<220> <221> <223>
340
19
1191 DNA
芝麻(Sesamum indicum)
misc—feature Sid2 DNA
345 350
<400> 19
atgggag犯g tcgaccctgc attcatccaa gcgctcgaac acaggcctaa accccacagc 60
gtcgaggccc aaggcatccc gttaatcgat ctctcccccg ccaactcccc ggaccccgat 120
ccgggttccc tgtcagctct cgccgccgaa attggtgatg cgtgcg柳a atggggattt 180
ttccaggtga tcaaccacgg ggtgccgUg catgttcggg agaaaattga cctggtttcc 240aggaaatttt ccgtcggggt gatttcacgg ctga犯gaag
g組3Cggtg
ctaggcttgg ctgaattact gacggcgggg aaaactga/tg ggtgacatta gtgaattcag atggtagaac aactgggg犯
acattctcaa tatgaataaa
ttgctctgcc attacgacac tggggg咖c tgatcaatca cagaaatgca cgag,tcg atgcgccatg cgttaacaat gcgaatggat
t3C3ggtttg
卿gag卿g
agttcttctc tacatcactt tgattatgct taattacttt
ga^gaggag tgagcacact gatggtgatg gtggcctgag
attcaatggg cccgatccct tcttgctcaa tcttgtgaaa gagc犯cgat attttcgatt gctggtgaac
CELCCCg犯a^
caagaactac tacagactga agatatatta
犯ga卿agg 犯gaatgtca ccggcttcgc aatccttcag cacaagttgc tttttcaagg gatctagctc
cctactcctg 犯gtacg3ga cccttcttcc
cgcagtaact tg犯ggttgc tggatttggc
<210〉 20
<211> 356
〈212〉 PRT
<213〉 芝麻(Sesamum indicum)
〈220〉
〈221〉 mi sc—f eature
〈223〉 Sid3蛋白(protein)
<400〉 20
Met Ser Glu Leu Leu Ser Glu Pro Asp Asn Leu 1 5 10
tttccaggga tgaggtgaac gggactggaa gg犯gtgttt atgagcctga tgacagggag aaatg鄉(xiāng)ga agtgtgtgaa tggaactcat agccctgagc
ttggcgt鄉(xiāng) gggggctgga
tcaaccctgc ctgccaacta aca^g犯gct ccttttgggc tctcttgact
cttcattcgg tcgacacaag ggtgs,gg aatcaatgtt cagagtgaaa acattatact caatccttac tgatgtggag ctaagtgttc gtgcatgtat
lie Asp Phe Met Leu 15
300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1191
Asn Lys Gly Asn Gly Val Lys Gly Leu Ser Gin lie Asn Leu Lys Gin
20 25
30
62lie Pro Asp Arg Phe lie Gin Pro Pro Glu Glu Arg Leu Asp His lie 35 40 45
Gin lie Ala Thr Gin Glu Ser Val Pro Val lie Asp Val Ser Arg Trp 50 55 60
Asp Asp Pro Gly lie Ala Glu Ser lie Cys Glu Ala Ala Ala Lys Trp 65 70 75 80
Gly Phe Phe Gin lie lie Asn His Gly lie Pro Asp Glu Val Leu Glu 85 90 95
Asn Val Lys Arg Ala Ala His Asp Phe Phe Glu Leu Pro Val Glu Glu 100 105 110
Arg Arg Arg Tyr Leu Lys Glu Asn Ser Pro Thr His Thr Val Met Leu 115 120 125
Lys Thr Ser Phe Ser Pro Leu Ala Glu Lys lie Leu Glu Trp Lys Asp 130 135 140
Tyr Uu Met His Tyr Cys Asp Gly Gin Glu Asn Glu His Ser Lys Phe 145 150 155 160
Trp Pro Pro Leu Ser Arg Asp Gin Val Leu Asp Tyr Val Asn Trp lie 165 170 175
Lys Pro lie lie Arg Lys Leu Leu Thr Val Leu Leu Asn Gly lie Lys 180 185 190
Val Glu Gin lie Asp Lys Val Lys Glu Ser Ala Leu Met Gly Ser Pro 195 200 205
Val Val Thr Uu Leu Tyr Tyr Pro Lys Cys Pro Asn Pro Asn Val Ma 210 215 220
Ala Gly Ala Gly Arg His Ser Asp Val Ser Ser lie Thr lie Leu Leu 225 230 235 240
Gin Asp A印Val Gly Gly Leu Tyr Val Arg Ala Thr Glu Gly A印Gin 245 250 255
63Trp lie His lie Ala Pro Thr Lys Gly Ala Leu Val Val Asn lie Gly
260 265
270
Asp Val Leu Gin lie Met Ser Asn Asp Arg Tyr Lys Ser lie Glu His 275 280 285
Arg Val Phe Val Asn Gly Ser Lys Asn Arg Val Ser Val Pro Val Phe 290 295 300
Val Asn Pro Ser Ser Asp Ala lie lie Gly Pro Leu Pro Glu Val Leu
305
310 315
320
Lys Ala Gly Glu Lys Pro lie Tyr Lys His Val Val Phe Ser Asp Tyr
325 330
335
Phe Asn Tyr Phe Phe Ser Lys Gly His Asp Gly Lys Arg Ser Leu Asp
340 345
350
Tyr Ala Lys lie 355
<210> 21
<211> 1161
<212〉 DNA
<213> 芝麻
<220〉
<221〉 misc— <223> Sid3
(Sesamum indicum)
feature 藤
<400> 21
atgtctgaac tactctcgga acccgacaac ctcatagatt ggagtgaagg gtctctctca gataaacctt犯acaaatcc cctgaagaaa gattggacca tatccaaatt gcgacccaag gtgtccagat gggatgaccc gggaattgca gaatcaatct ggtttctttc agatcatcaa tcatggaatc ccagatgagg gctgctcatg atttctttga gttgcctgtt gaggag兆ga tctcccactc acactgtgat gttgaagact agctttagtc
ttatgctgaa caaaggaaat 60
cagatcgatt catccagccc 120
aatccgtacc cgttatcgat 180
gcgaggcagc agccaagtgg 240
ttcttgaaaa tgtgaagagg 300
ggaggtattt gaaggagaat 360
ctcttgctga gaagattttg 420gagtggaaag actatcttat tggccacctt tgtctagaga agaaagctac tgacagtgtt gaatccgcct tgatgggctc cccaatgttg cagctggagc caagacgacg taggtggact gcaccaacca aaggagctct gacaggtacgL aaagcatcga gtgcccgtct ttgtcaaccc aaggccggag ag犯acc犯t tttagt犯ag gtcatgatgg gttttgtagg atagcttatc atactcacag atttatctcc
〈210> 22
〈211〉 356
<212> PRT
〈213〉 芝麻
gcactactgt tcaagttttg gctcaatggt accagttgtc tggccgtcac ctacgtacga tgttgt犯ac gcatcgtgta ttc犯gtgac
ttcacaagtc g
gatggccaag aaaatgagca ttccaagttc 480
gactacgtaa actggataaa gcccattatc 540
attaaggtgg aacaaattga caaggtc犯a 600
acccttctct actaccccaa gtgtccgaac 660
tctgatgtgt catcaatcac catcctccta 720
gcaactgaag gcgaccagtg gatccatata 780
atcggagatg tgctgcagat catgagc犯c 840
tttgtgaatg ggagcaagaa cagggtttcc 900
gccatcattg gccctctgcc ggaagtgctg 960
gttgtcttct cggattactt caattacttc 1020
ctggattatg cga犯atatg acgtgtttgt 1080
tttgctgtct tcttgcatag gctgtgtcat 1140
1161
〈220〉
〈221〉 misc— 〈223〉 Sid4
〈400〉 22
Met Glu Pro 1
(Sesamum indicunO
feature
蛋白(protein)
Lys Leu Thr Lys Leu Gly Ser Ser Leu Pro Val Pro lie 5 10 15
Val Gin Glu Leu Ala Lys Glu Lys Leu Ala Thr Val Pro Pro Arg Tyr 20 25 30
Val Arg Pro Asp Gin His Gin His Thr lie Leu Ser Ala Leu Asn Ser
35
40 45
Ser Phe Pro Gin lie Pro Val lie Asp Met Gin Lys Phe Ser Asp lie
50
55 60
65Tyr lie Met Asp Ser Glu Leu Gin Ala Leu His Asn Ala Cys Gin Glu 65 70 75 80
Trp Gly Phe Phe Gin Leu lie Asn His Gly Val Asp Ser Ala Val Met 85 90 95
Glu Lys Met Lys lie Glu lie Gin Glu Phe Phe Asn Leu Pro lie Glu 100 105 110
Glu Lys Lys Lys Phe Lys His Glu Glu Gly Asp lie Gin Gly Tyr Gly 115 120 125
Gin Ala Phe Val Val Ser Glu Asp Gin Lys Leu Asp T卬Gly Asp Val 130 135 140
Phe Ala lie Val Thr Ser Pro lie Tyr Leu Arg Lys Pro His Leu lie 145 150 155 160
Ala Lys Leu Pro Ala Thr Phe Arg Asp Ala Thr Glu Val Tyr Ala Ser 165 170 175
Glu Leu Lys Val Leu Ala Met Lys lie Leu Lys Leu Met Ala Lys Ala 180 185 190
Leu Asp Met Lys Ala Glu Glu Met Glu Thr Leu Phe Ala Glu Gly Met 195 200 205
His Ser Met Arg Met Asn Tyr Tyr Pro Pro Cys Pro Gin Pro Glu Leu 210 215 220
Val Thr Gly Leu Cys Pro His Ser Asp Ala Asp Gly Leu Thr lie Leu 225 230 235 240
Leu Gin Val Asn Glu Met Asp Gly Leu Gin lie Lys Lys Asp Gly Val 245 250 255
Trp lie Pro Val Ser Pro Leu Pro Asn Ala Phe Thr lie Asn lie Gly 260 265 270
66<formula>formula see original document page 67</formula>g犯3Cgctat tcgcagaagg gatgcattcc atgaggatga actactatcc tccgtgtccc cagcccgagc tcgtcacggg cctctgccct cactccgatg cagatgggct caccattctc ctccaagtga atgaaatgga
tctccactcc ctaatgcctt ggtgcttata ggagcattga attgccacat ttctgggcgc actcctcaga ctccggcaaa
tggcctccag atcaagaaag atggagtctg gattcccgtt caccatcaatt attggagata gLcttggagat tctgaca犯c gcatagagca actgtcaaca aggagaaaga aagaatctcc gaatctagat ggtgatatgg gtccgtcgcc aagcctcgtc attcaagagg atcggggtga ctcaatattt gaaggaacta
ttctcgcggg aactcatggg gaaatcatat ctagacctta tgaggattta gggtgtagta ctggggtatg gtaataacac caacatgagt ttgtacctaa taagttatca accattagat tac3aat3at sctatgatca tgtgtaaa^a犯a犯aaaaa aaaa^犯aaa a^犯aa犯a
660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1208
<210〉 24
<211〉 359
<212〉 PRT
<213> 芝麻
(Sesamum indicum)
<220>
<221> misc-
<223> Sid5
<400> 24
—feature
蛋白(protein)
Met Met Ser Cys Leu Gin Ser Trp Pro Glu Pro Val Val Arg Val Gin 1 5 10 15 ■
His Leu Ser Asp Ser Gly lie Arg Val lie Pro Glu Arg Tyr Val Lys 20 25 30
Lys Leu Ser Asp Arg Pro Ser Phe Cys Asp Ser Leu Ser Gly Glu Val 35 40 45
Asn lie Pro Val lie Asp Met Lys Gly Leu Tyr Ser Asp Asp Ala Ser 50 55 60
Val Arg Lys Lys Thr Ala Gly Met lie Ser Gly Ala Cys Arg Glu Trp 65 70 75 80
68Gly Phe Phe Gin Val Val Asn His Gly Val Arg Gin Glu Val Met Gly 85 90 95
Arg Ala Arg Glu Ala Trp Arg Glu Phe Phe Lys Leu Pro Leu Glu Glu 100 105 110
Lys Gin Lys Tyr Ala Asn Ser Pro Ser Thr Tyr Glu Gly Tyr Gly Ser 115 120 125
Arg Leu Gly Val Glu Lys Gly lie Ser Leu Asp Trp Ser Asp Tyr Phe 130 135 140
Phe Leu Asn Tyr Leu Pro Leu Ala Leu Arg Asp Gin Asn Lys Trp Pro 145 150 155 160
Ala Leu Pro Leu Ser Cys Arg Glu Met Val Gly Glu Tyr Cys Arg Glu 165 170 175
Val Val Glu Leu Gly Gly Arg Leu Met Lys lie Leu Ser Ser Asn Leu 180 185 190
Gly Leu Glu Glu Glu Tyr Leu Gin Glu Ala Phe Gly Gly Glu Glu Phe 195 200 205
Gly Ala Cys Met Arg Val Asn Tyr Tyr Pro Lys Cys Pro Gin Pro Asp 210 215 220
Leu Thr Leu Gly Leu Ser Pro His Ser Asp Pro Gly Gly Met Thr Leu 225 230 235 240
Leu Phe Pro Asp Glu Asn Val Ser Gly Leu Gin Val Arg Arg Gly Glu 245 250 255
Lys Trp lie Thr Val Asp Pro Val Pro Asn Ala Phe lie Val Asn lie 260 265 270
Gly Asp Gin Leu Glu Val Leu Ser Asn Gly Asn Tyr Lys Ser Val Glu 275 280 285
69His Arg Val lie Val Asn Ser Glu Lys Glu Arg Val Ser lie Ala Leu 290 295 300
Phe Tyr Asn Pro Arg Gly Asp Met Leu lie Lys Pro Ala Asp Glu Leu 305 310 315 320
Val Thr Glu Asp Arg Pro Pro Leu Tyr Pro Pro Thr Val Tyr Asp Glu 325 330 335
Tyr Arg Leu Tyr Met Arg Thr Arg Gly Pro Arg Gly Lys Ser Gin Val 340 345 350
His Ser Leu Lys Ser Leu Gin 355
〈210〉 25
〈211〉 1242
〈212〉 DNA
〈213〉 芝麻(Sesamum indicum)
〈220〉
<221〉 misc—feature 〈223〉 Sid5 DNA
〈400〉 25
3tgat靴Ct gCttgC卿g
agcgggattc gggtaatccc tgcgactccc tctccggcga gacgacgcct cagtccggaa gggttcUcc aggtggtgaa gcgtggcgcg agttuttaa agcacgtatg aggggtacgg agtgactact ttttcctgaa gcacttcctc tttcatgcag ggtgg卿at tgatgaagat gaagcatttg gagg卿gga cctcaaccgg acctcacact
70
ctggcccgaa cccgttgtca gggtccaaca cctctccgac 60
cgaacgctac gtgaagaaac tctcagacag gccgagcttt 120
agttaacatt ccagtcatcg acatgaaggg gttgtactcg 180
gaagacggcc gggatgatca gcggggcatg ccgcgagtgg 240
ccacggggtg agacaggagg tgatggggcg ggccagggag 300
gctgccgctg gaggag犯gc agaagtacgc g犯ttcgccg 360
cagccgcctg ggtgtgg柳aggg組atc actggattgg 420
ttaccttcct ctcgcactca gagaccagaa taagtggcct 480
ggaaatggtg ggagagtact gtagagaagt ggttgaactt 540
tctgtcgagc aatcttgggc tggaagaaga gtatcttcaa 600
gtttggggca tgcatgaggg tt犯ctatta ccca肪atgc 660
cggcctttct cctcattccg acccgggtgg gatgaccctt 720<formula>formula see original document page 71</formula>Asn His Glu Met Pro Leu Arg Val Met Asp Glu Met lie Ala Gly Val 100 105 110
Arg Arg Phe His Glu Gin Asp Ala Glu Val Lys Lys Lys Tyr Tyr Gly 115 120 125
Arg Asp Val Thr Lys Lys Phe Gin Tyr Asn Ser Asn Phe Asp 'Leu Tyi 130 135 140
Lys Thr Arg Ala Ala Met Trp Arg Asp Thr lie Thr Cys Val Met Ala 145 150 155 160
Pro His Pro Pro Asp Pro Gin Glu Leu Pro Asp Val Cys Arg Asp lie 165 170 175
Met Phe Glu Tyr Ser Lys His Val Met Arg Val Gly His Thr Val Tyr 180 185 190
Glu Leu Leu Ser Glu Ala Leu Gly Leu Asn Pro Ser Tyr Leu Arg Asp 195 200 205
lie Gly Cys lie Glu Ser Asn Phe lie Val Gly His Tyr Ser Pro Ala 210 215 220
Cys Pro Glu Pro Glu Leu Thr Phe Gly lie Arg Ser His Val Asp Phe 225 230 235 240
Gly Leu Leu Thr lie Leu Leu Gin Asp Gin lie Gly Gly Leu Gin Val 245 250 255
Leu His Gin Asn Gin Trp Val Asp Val Ser Pro Leu Pro Gly Ser Leu 260 265 270
lie lie Asn Val Gly Asp Phe lie Gin Leu lie Ser Asn Asp Lys Phe 275 280 285
Lys Ser Val Lys His Arg Ala Leu Ser Lys Arg Val Gly Pro Arg lie 290 295 300
72Ser Val Gly Val Phe lie Lys Pro Tyr Tyr Ala Asp Gly Asp Asn Leu 305 310 315 320
Arg Val Tyr Gly Pro lie Lys Glu Leu Leu Thr Glu Glu Glu Pro Ala 325 330 335
lie Tyr Arg Glu Thr Thr Tyr Lys Asp Tyr Glu Arg Phe Tyr Phe Ala 340 345 350
Asn Cys Asp Asp Gly Thr Thr Lys Leu Pro Tyr Phe Arg Leu Gly Thr 355 360 365
〈210〉 27
〈211〉 1170
<212〉 DNA
〈213〉 芝麻(Sesammn indicum) 〈220〉
〈221〉 rnisc_f eature
〈223〉 Sid6 DNA
〈400〉 27
atggaagttc agacaatgaa g3tg3ttca^ aMca^gcgt ttcttcstta atgataatga atctttccag tcatagattt agc卿gtga aagaggcatg ccgctgcgag tgatggatga gaggttaaga agaaatacta ttcgatcttt 3caaaacacg cctcatccac ctgacccgca tctaagcatg tcatgagagt ctcaatccca gctacctgag tattctccgg cttgcccaga ggcttgctca caatactctt cagtgggtcg acgtttctcc
73
agttcatgca tacgatcgac t犯gtgaact aa犯gcattc 60
gaagggactt gttgatgctg gtgttacgaa gatcccacgc 120
tatgcctgga tccgaaccgt gcaacttcaa ctcagaagcc 180
atcaggcatg caccatgctg caaaccgtgc tggaattgtc 240
tgagaagtgg ggattctttc agataatcaa tcatgagatg 300
aatgattgca ggggttcgaa gatttcacga gcaagatgct 360
cggtcgtgat gtcacgaaaa agtttcagta caatagcaat 420
ggcggccatg tggsgggata ctatcacttg tgtaatggcc 480
ggaattgcca gatgtatgca gagacatcat gtttgaatac 540
ggggcatacc gtgtatg組tgctgtcgga ggctttgggc 600
agacattggc tgtattgagt cgaatttcat cgtgggccat 660
accagaactg acctttggca tcagaagcca cgtcgacttc 720
gcaggaccag attggcggtc tccaggtgct tcaccagaat 780
cttgcctgga agtctaataa taaatgttgg ggactttata 84<formula>formula see original document page 74</formula>Val Arg Lys Phe Tyr Glu Gin Asp Pro Glu Glu Arg Lys Lys Trp Tyr 115 120 125
Thr Arg Asp Arg Lys Arg Ser Val Val Tyr Asn Ser Asn Phe Asp Leu 130 135 140
Tyr Ser Ala Pro Ala Ala Asn Trp Arg Asp Thr Phe Phe Cys Lys Met 145 150 155 160
Ala Pro His Pro Pro Ser Pro Glu Glu Leu Pro Ala Val Cys Arg Asp 165 170 175
lie Met Phe Glu Tyr Thr Lys Gin Val Leu Lys Leu Gly Thr Ser Leu 180 185 190
Phe Lys Leu Leu Ser Glu Ala Leu Gly Leu Asp Ala Asn His Leu Gly 195 200 205
Asp Met Lys Cys Ala Asp Gly Leu Ala Leu Leu Cys His Tyr Tyr Pro 210 215 220
Phe Cys Pro Gin Pro Glu Leu Thr Met Gly Ala Ser Gin His Ala Asp 225 230 235 240
Ser Asp Phe Leu Thr Val Leu Leu Asn Asp Asn Val Thr Gly Leu Gin 245 250 255
Val Leu Tyr Gin Asn Gin Trp Phe Asp Val Pro Ser Val Pro Gly Ser 260 265 270
Leu Val Val Asn Val Gly Asp Leu Leu Gin Leu lie Ser Asn Asp Arg 275 280 285
Leu lie Ser Ser Glu His Arg Val Leu Ala Asn Asn Val Arg Ser Arg 290 295 300
Val Ser Val Ala Cys Phe Phe Arg Ser Asp lie Asp Lys Ser Asp Glu 305 310 315 320
Leu Tyr Gly Pro lie Gin Glu Leu Leu Ser Glu Asp Asn Pro Pro Lys 325 330 335
75Tyr Arg Ala Thr Thr Met Lys Glu Tyr Val Asn Tyr Tyr Asn Ala Lys 340 345 350
Gly Leu Asp Gly Thr Ser Ala Leu Leu His Phe Arg Val
355 360
<210〉 29
〈211〉 1281
〈212〉 DNA
〈213〉 芝麻(Sesamum indicum)
〈220〉
<221〉 mi sc一f eature 〈223〉 Sid7 DNA
365
<400〉 29 atggcctgga
gatgacacca
atcttceitca
aaattcccaeL
gtggscga^gg
attccgggtt
aactttgatt gctcctcatc
ggtctggatg cattactacc agtgacttcc aaccagtggt ctacagctta gttcgttcaa ctctacggac
gatctcagac aaactggtgt ccccacgaaa taattgacct ttcgagatgc ctgttttgga ggaaa卿tg tgtatagtgc ctccaagccc aagttttgaa ccaaccacct ccttctgccc tgacggtgct ttgatgttcc
gggtstcagt caatccagga
ag犯gcaaac ca犯ggctta tgattcagac cgaaaacatc ttcagggaca gg,tgcta gtacax:aagg accagcagct tg鄉(xiāng)兆ttg actgggMca tggggacatg tc柳cggag cctaaatgac ctcagtgccc taggttgatt cgcatgtttc actcttgtct
tacgacagag caagcgaact gttgacagtg gtataaccca aagaacctta aaccttccga gatgaagatc caatcaggtt tggggtttxt tccaggtgat gatggggtcc gg犯attcta gatagaaaaa gaagtgttgt aattggaggg acactttctt cccgctgtgt gcagagatat agtttgttta組tgttgtc aaatgtgctg acgggcttgc ttaactatgg gcgccagcca aatgtaaccg gcctgcaagt ggatctctgg tggt犯atgt agttcggagc atagagtact tttagaagcg acatagataa gaagataatc caccaaaata
aaaagctttt agtcccgaga ttcacaactc taagaaggtc caatcatggg tgaacaagat ttacaatagc ctgtaaaatg a^tgtttgsg cgaggccctt tctcctgtgc gcacgcggac tctttaccaa tggagatctt
gtCgg3Cg3g
cagggca3cc
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020
76<formula>formula see original document page 77</formula><223> 引物(Primer) SiD2-KpnXho- Rv
<400〉 33
aaactcgagg tacccaacct tcagtagttc ttgaagt
<210〉 34
<211> 30
<212〉 DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223> 引物(Primer) Bgl2-SiD3-Fw
<400〉 34
tttagatcta tgtctgaact actctcggaa 30
<210〉 35
<211〉 35
<212> 醒
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223〉 引物(Primer) SiD3—KpnXho-Rv
<210> 36
<211〉 33
<212> 腿
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 引物(Primer) BamNco-SiD4-Fw
<400〉 36
aaaggatcca tggaaccaaa attaacaaag cta 33
<210〉 37
<211〉 37
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> 引物(Primer) SiD4-KpnXho-Rv
<400> 35
aaactcgagg taccaacacg tcatattttc gcata
<400> : aaactcg;
37
:agg tacctactac accctaaatc ctcataa<210〉 38
<211〉 28
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物(Primer) BamHI-SiD5-Fw
<400> 38
333ggatccei tgeigctgctt gc3gagct 28
<210> 39
<211〉 38
<212> DNA
<213〉 人工序列(Artificial)
<220>
<223〉 引物(Primer) SiD5-KpnXho-Rv <柳〉39
aaactcgagg taccttaatt aagttattga agtgattt 38
<210〉 40
〈211〉 32
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial)
〈220〉
<223〉 引物(Primer) Bgl2Nco—SiD6—Fw 〈400〉 40
aaagatcttc catggaagtt cagacaatga aa 32
〈210〉 41
<211〉 38
<212〉 DNA
<213〉 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 引物(Primer) SiD6—KpnXho-Rv
<400〉 41
aaactcgagg tacctgatca ggtgcccagc .ctga組a 38
<210〉 42
<211〉 33
<212〉 DNA
<213〉 人工序列(Artificial)
<220〉<223〉 引物(Primer) BamNco-SiD7-Fw
<400〉 42
aaaggatcca tggcctggag atctcagaca gaa
<210> 43
<211〉 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> 引物(Primer) SiD7—KpnXho-Rv
<400> 43
aaactcgagg taccttcaat tcaaacgcgg aaatgtaa 38
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223〉 引物(Primer) Sil8S-Fw
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220>
<223> 引物(Primer) Sil8D-Rv
〈400〉 45
aacatctaag ggcatxacag a 21
<210〉 46
<211〉 20
<212〉 DNA
<213> 人工序列(Artificial) <220〉
<223> 弓l物(Primer) SiD6-nest-Rv
<400> ' tatgctti
44
.gtc tcaaagatta a
〈400〉 46
cattacacaa gtgatagtat
權(quán)利要求
1. 多肽，其為具有木脂素羥基化活性的多肽，含有(a)序列號(hào)26的氨基酸序列；(b)序列號(hào)26的氨基酸序列中，1～15個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、插入、取代及/或附加的氨基酸序列；或(c)與序列號(hào)26的氨基酸序列有至少80％同源性的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有木脂素羥基化活性的多肽，含有 (a)序列號(hào)26的氨基酸序列；或(b')序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 多個(gè)氨基酸發(fā)生缺失、插入、取代及/或附加的氨基酸序列。
3. 多核苷酸，其特征在于，是下述的(a) (e)的任一個(gè)(a) 多核苷酸，其含有序列號(hào)27的堿基序列；(b) 多核苷酸，其編碼含有序列號(hào)26的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(c) 多核苷酸，其編碼在序列號(hào)26的氨基酸序列中，1 15個(gè)氨基酸 發(fā)生缺失、取代、插入及/或附加的多肽，且具有木脂素羥基化活性的多肽；(d) 多核苷酸，其編碼與序列號(hào)26的氨基酸序列有至少80%同源性的 多肽，且具有木脂素羥基化活性的多肽；或(e) 多核苷酸，其與序列號(hào)27的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的 多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，且編碼具有木脂素羥基化活性的多肽。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其編碼具有木脂素羥基化活性的多 肽，且是下述(f) (i)中的任一個(gè)(f) 多核苷酸，其由序列號(hào)27的堿基序列組成；(g) 多核苷酸，其與序列號(hào)27的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列所組成的多核苷酸在嚴(yán)謹(jǐn)條件雜交；(h) 多核苷酸，其由與序列號(hào)27的堿基序列至少90%同源的堿基序列組成；或(i)多核苷酸，其是序列號(hào)27的堿基序列中，1 多個(gè)堿基發(fā)生缺失、 插入、取代及/或附加的多核苷酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其由序列號(hào)27的堿基序列組成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其中，所述木脂素羥 基化活性是對(duì)木脂素的9位的羥基化。
7. 寡核苷酸，其特征在于，其由權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的多核苷 酸的片段或其互補(bǔ)序列組成。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的寡核苷酸，其特征在于，其抑制權(quán)利要求l 或2所述的多肽的表達(dá)。
9. 載體，其特征在于，其包含權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
10. 多肽的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求9所述的載體。
11. 轉(zhuǎn)化體，其特征在于，導(dǎo)入了權(quán)利要求3 6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。
12. 根據(jù)權(quán)利要求ll所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，通過導(dǎo)入木脂素及權(quán) 利要求3 6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，可改變羥基化木脂素的含有比率。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其是生物或其 后代或來自生物或其后代的組織。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述生物是植物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述植物是芝麻、連 翹或亞麻。
16. 用于制造多肽的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求11 15中任一項(xiàng) 所述的轉(zhuǎn)化體。
17. 羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求11 15中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的羥基化木脂素的制造方法，其特征在-丁，所述羥基化木脂素的底物為胡椒醇或松脂醇。
19. 細(xì)胞，其特征在于，含有權(quán)利要求9中所述的載體。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的細(xì)胞，其特征在于，其是來自芝麻、連翹或亞麻的細(xì)胞。
21. 用于制造多肽的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求19或20所述的 細(xì)胞。
22. 羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求19或20所 述的細(xì)胞。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，所述羥基化木脂素的底物為胡椒醇、松脂醇。
24. 羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1或2所述 的多肽。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的羥基化木脂素的制造方法，其特征在于，上述羥基化木脂素的底物為胡椒醇或松脂醇。
26. 食品或工業(yè)產(chǎn)品，其特征在于，含有通過權(quán)利要求17、 22或24中任一項(xiàng)所述的制造方法得到的羥基化木脂素。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的食品或工業(yè)產(chǎn)品，其特征在于，上述羥基化木脂素的底物為胡椒醇或松脂醇。
28. 增加生物中羥基化木脂素含量的方法，其特征在于，包含將權(quán)利要 求3 6中任一項(xiàng)所述的多核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)生木脂素的生物中的工序。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生所述木脂素的生物 為芝麻、連翹或亞麻。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的方法，其特征在于，所述木脂素為胡 椒醇或松脂醇。
31. 減少生物中羥基化木脂素含量的方法，其特征在于，包含將權(quán)利要 求8中所述的寡核苷酸導(dǎo)入產(chǎn)生木脂素的生物的工序。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生所述木脂素的生物 為芝麻、連翹或亞麻。
33. 根據(jù)權(quán)利要求31或32所述的方法，其特征在于，所述木脂素為胡 椒醇或松脂醇。
34 化合物，其具有下式通式<formula>formula see original document page 5</formula>
全文摘要
本發(fā)明提供具有木脂素羥基化活性的酶，特別是提供催化向木脂素類引入羥基的反應(yīng)的酶，優(yōu)選催化由胡椒醇向9-羥基胡椒醇、由松脂醇向9-羥基松脂醇進(jìn)行的羥基化反應(yīng)的酶。本發(fā)明涉及具有木脂素羥基化活性的多肽、編碼該多肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體或轉(zhuǎn)化體、使用該轉(zhuǎn)化體制造具有木脂素羥基化活性的多肽的方法等。使本發(fā)明所涉及的多核苷酸可表達(dá)地導(dǎo)入的轉(zhuǎn)化體，在食品領(lǐng)域、各種工業(yè)領(lǐng)域中，在木脂素羥基化或生產(chǎn)利用該木脂素羥基化的產(chǎn)品上有用。
文檔編號(hào)C12N9/02GK101469324SQ200810185269
公開日2009年7月1日 申請(qǐng)日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月28日
發(fā)明者岡田亞砂子, 小野榮一郎, 福井祐子 申請(qǐng)人:三得利株式會(huì)社