專利名稱：：A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片及使用方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片及使用方法，屬于生物芯片領域。
背景技術：
：流行性感冒(Influenza)簡稱流感，是由流行性感冒病毒(Influenzavirus)引起的一種急性呼吸道傳染病。長期以來，流感一直是危害人類健康和公眾安全的嚴重傳染病，每年由此造成的經(jīng)濟損失也十分巨大。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，每年全球流感患者約為6-12億，其中約有3-5百萬是重癥流感患者，每年約有30-50萬人死于流感。流感病毒在分類上屬于正粘病毒科，根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MP)抗原性的不同，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。A型流感病毒可以感染多種動物，是人類流感和動物流感的主要病原。A型流感病毒根據(jù)其表面蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的抗原性差異，可分為不同的亞型，目前在水禽中已發(fā)現(xiàn)16種HA亞型和9種M亞型。在過去的一個世紀里，A型流感病毒引發(fā)4次人類流感大流行。A型流感病毒不僅血清型復雜，遺傳變異也十分活躍，變異的方式主要有核苷酸點突變積累引起的抗原漂移和不同毒株基因節(jié)段重配引起的抗原轉(zhuǎn)換兩種。研究表明，每1-2年，H1和H3流感病毒在人群免疫壓力下都會發(fā)生一次大的抗原漂移，使疫苗接種預防效果和血清學診斷結(jié)果大打折扣。近十多年來，禽流感病毒，包括H5N1、H9N2和H7N7亞型，特別是H5N1亞型病毒，在全球家禽中持續(xù)爆發(fā)流行。在一般認為流感病毒具有宿主限制性，即禽流感病毒一般不易突破宿主種間屏障直接感染人。但近年來發(fā)生了多起禽流感病毒感染人并引致疾病乃至死亡的事例，越來越多的證據(jù)表明禽流感病毒，特別是H5N1病毒，已經(jīng)逐步獲得直接感染人的能力。自1997年香港禽流感事件，截止2008年3月，全球已有366例感染了H5N1病毒，其中死亡232例。根據(jù)以往大流感的經(jīng)驗和當前高致病性禽流感肆虐的嚴峻現(xiàn)實，H5N1病毒一旦7獲得在人際間傳播的能力或與現(xiàn)在流行的人病毒基因重配，就可能引發(fā)新的流感大流行。因此必須面對的問題是應該釆取何種策略和技術儲備來應對可能到來的大流感。流感病毒的有效檢測技術對于指導臨床預防和治療流感具有重要意義，同時也是流感監(jiān)測和控制世界性流感大流行的重要技術支撐。除了流感病毒，臨床上引致人呼吸道疾病的病原體還有很多，包括某些病毒、細菌、支原體、螺旋體、寄生蟲等，因此輕型流感及散發(fā)流感在臨床上與普通感冒及其它病原引起的呼吸道疾病較難鑒別，對流感的確診主要依靠實驗室檢測手段。自1933年流感病毒被第一次分離以來，發(fā)展出了許多不同的診斷方法，這些方法各有優(yōu)缺點。目前流感的實驗室診斷方法有病毒分離培養(yǎng)、檢測抗體的血清學方法、檢測抗原的免疫學方法和基于PCR的分子生物學方法。用雞胚或細胞分離培養(yǎng)病毒是流感病毒鑒定的"黃金標準"，敏感性強，但需要3-7天時間，不適合早期診斷。血清學方法可以檢測抗體，主要包括血凝抑制試驗(HI)、補體結(jié)合試驗(CF)、酶免疫試驗(EIA)和間接免疫熒光法(IF)等。血清學檢測需要采集患者急性期和康復期雙份血清，屬于回顧性診斷，具有流行病學意義，但對于急性早期診斷意義不大，且敏感性低。直接檢測抗原方法有直接或間接熒光試驗、酶聯(lián)免疫試驗等，時間為2小時-l天，適合早期快速診斷，但敏感性低，且不能進行大樣本檢測。分子生物學方法是針對病原核酸分子檢測的一系列試驗手段，主要包括RT-PCR、多重PCR、real-timePCR、NASBA等,這些方法都具有靈敏度高、特異性強、快速的特點，可以對病毒進行定量和分型鑒定，但缺點是不能對大量臨床標本進行同時平行檢測和篩查。針對流感病毒亞型眾多、血清型復雜和遺傳變異迅速的特點，迫切需要建立一種敏感、特異的快速檢測方法，能夠在同一時間平行地對大量樣品進行檢測，同時能對檢測病毒進行分型鑒定。近年來發(fā)展起來的基因芯片技術將為流感病毒的檢測帶來重大突破，完全能夠滿足對流感病毒檢測的上述要求?；蛐酒?，又叫DNA微陣列(DNAMicroarray),自誕生之日起經(jīng)過科學家們十多年的努力，技術逐漸成熟完善，已廣泛應用于醫(yī)學的多個領域，包括基因表達的監(jiān)測、基因功能的評價、疾病的分子診斷、藥物篩選等。與傳統(tǒng)方法相比，在傳染性疾病的診斷上，基因芯片顯示了無可比擬的優(yōu)越性。基因芯片具有快速、敏感、特異、高通量的特點，可以平行地對大量病原和同一病原的多基因位點進行同時檢測，在實際應用中能夠?qū)崿F(xiàn)微型化、集成化和自動化。近幾年來許多病原微生物的檢測都涉及到了基因芯片的研究并取得了令人振奮的進展，有些已經(jīng)或正在實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，顯示了廣闊的應用前景?；蛐酒瑱z測技術特別適合流感病毒宿主范圍廣、血清型多、變異快的特點。2001年Li等首次設計24對平均長度約500nt的探針制備芯片，結(jié)合多重PCR方法制備熒光標記耙DNA，通過與探針雜交結(jié)果表明可以對H1、H3、Nl、N2和B型流感進行鑒定。之后少數(shù)學者運用不同的基因芯片制備策略對流感病毒的分型檢測進行了深入研究，但現(xiàn)有研究成果普遍存在雜交時間較長，熒光標記效率低，雜交信號弱，檢出率低的缺點，另外由于流感病毒本身基因變異很快，很難保證其保守序列永遠不變，而目前的芯片的探針數(shù)目太少，一旦在其檢測位點發(fā)生變異，則很可能導致檢測結(jié)果的錯誤。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種用于A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片及其制備方法和使用方法，它可以成功建立了一整套快速、特異、靈敏的用于A型流感病毒流行毒株檢測分型的基因芯片，該芯片能同時對包括人源、禽源、豬源等不同種屬來源的A型流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H9N2亞型進行檢測和分型。本發(fā)明釆用了以下技術方案一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片，它包括對H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四種亞型進行檢測和分型的79條特異性寡核苷酸探針、兩條質(zhì)控探針和載體，兩條質(zhì)控探針為質(zhì)控探針I(yè)和質(zhì)控探針I(yè)I，其中特異性寡核苷酸探針和質(zhì)控探針I(yè)分布在載體上，對H1N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>36H3N2-NA-12gaggcttgtagatagtattggttca37H3N2-NA-13catagttgscagaggteataggtcc對H5N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列38H5N1-HA-1cgacagagcaggttgacaca39眼1-HA-2tc犯g肌3ggggactcagcaa40H5Nl-HA-3aaggcaatagatggagtcacc41H5N1-HA-4gccgttggaagggaatttaataac42H5N1-HA-53ac肌g肪gatggaagacggatt43H5N1-HA-6cggaatggtcttacatagtggag44H5N1-HA-7ccagccaatgacctctgttac45H5N1-HA-8gctacaataataccaaccaagaaga46H5N1-HA-9cctaatgatgcggcagagc47H5N1-HA-10tgccattccacaacatacacc48H5N1-HA-llaagtgaattggaatatggtaactgc49H5N1-HA-12ccgcagtattcagaagaagcaa50眼l-HA-13ttattcaacagtggcgagttcc51H5N1-HA-14aag肌ctg犯3C3cctattgEigca52H5N1-NA-1tggaggaacaacatactgagaac53H5N1-NA-2ggcataataacagacactatcaaga54H5N1-NA-3agcactaattccaggagcgg55H5N1-NA-4ccagaactgacaggattagattgc56H5N1-NA-5attggtcaggatatagcgggag57H5N1-NA-6gccgttcatctcatgctcc58H5Nl-NA-7ttgactcagggagccttgc59H5Nl-NA-8tggaggaacaacatactgagaac60H5N1-NA-9ttactgtaatgactgatggaccaag61H5N1-NA-10ttcggagacaatccacgcc62眼l-NA-lltggcatggctcaaatcggc63H5N1-NA-12agcactaattccaggagcgg64H5N1-NA-13ggtggactggaacggacag對H9N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列65H9N2-HA-1gcatcggctaccaatcaacaa1166H9N2-HA-2tgttcctgtgacacatgcca67H9N2-HA-3atgccaaagaattactccacaca68隨2-HA-4agaattgctagtgctgcttgaa69H9N2-HA-5caggtcagacattgcgagtg70H9N2-HA-6atggtatggacacattctttcagg71H9N2-HA-73c幼gg3ctgacacaacaacaa72H9N2-HA-8aggtcagacattgcgagtaaga73H9N2-HA-9tctatggcaatccttcctgtga74H9N2-HA-10tcggattcattctacaggagca75H9N2-HA-11aataccacattgccattccaca76H9N2-NA-1ggtattctggtatcttctctgttga77H9N2-NA-2ccacggctaattccaagtcac78H9N2-NA-3aagtggcagaatacaagaattggt79H9N2-NA-4gtcaaattacagggttcgctcc兩條質(zhì)控探針的序列80Icgtatataaaacggaacgtcgaagg81IIccttcgacgttccgttttatatacg所述的載體為醛基化修飾玻璃基片或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。本發(fā)明一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟一，探針的設計根據(jù)NCBI中的InfluenzaVirusResource數(shù)據(jù)庫，對大量A型流感病毒序列進行比對，找到其絕對或相對保守序列，然后設計79條特異性寡核苷酸探針以及兩條質(zhì)控探針；步驟二，探針的合成，每條探針的5'端加C6氨基修飾，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上;步驟三，芯片的制備將合成后的探針用純水稀釋成40uM,取15ul，和等體積2x芯片點樣液混勻，使探針濃度達到20uM，裝于384孔板，用芯片點樣儀將探針點于載體上，點樣完成后將芯片置于芯片雜交盒，同時在雜交盒底部放300ul純水用于保持濕度，將雜交盒密封，37°C反應18h，使探針和芯片表面醛基共價結(jié)合，水合完成后用0.2。/。SDS清洗并用NaBH4封閉，離心干燥，貼上四樣品型圍欄，4°C密封保存。在本發(fā)明制備方法步驟一中79條特異性寡核苷酸探針以及兩條質(zhì)控探針，探針長度在19-25bp，每條探針之間Tm值相差在5°C之內(nèi)。在本發(fā)明制備方法步驟二中所述的載體為醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。本發(fā)明一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片的使用方法，其特征是它包括以下步驟步驟一，流感病毒RNA的提取，使用TRIZOL常規(guī)方法提取病毒RNA;步驟二，RT—PCR:首先用Unil2引物將流感病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再使用通用引物分別PCR擴增流感病毒的HA、NA基因片段全長，擴增后的PCR產(chǎn)物用QIAGENPCRPurificationKit對進行純化;步驟三，熒光標記取純化后的PCR產(chǎn)物，使用Klenowminus酶在PCR產(chǎn)物上進行熒光標記，將帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物用QIAGENPCRPurificationKit純化；步驟四，雜交將純化后的帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物和雜交液混勻，在基因芯片上蓋上四樣品型蓋片，將12ul雜交體系加于蓋片加樣孔使其自動覆蓋于陣列表面，將基因芯片放入雜交盒內(nèi)在20-45°C雜交1-5H;步驟五，雜交后清洗基因芯片基因芯片雜交完成后，將芯片依次在洗液0.l°/。SDS+2xSSC、0.1%SDS+0.2xSSC和0.2xSSC中各清洗l-5min，最后將基因芯片放入離心管中離心以去除表面液體；步驟六，掃描將步驟五中清洗后的基因芯片通過芯片掃描儀進行掃描，同時保存掃描圖像數(shù)據(jù)；步驟七，數(shù)據(jù)分析根據(jù)掃描圖像，確定出現(xiàn)熒光信號區(qū)域，以此來確定所檢測樣本中流感病毒的有無及亞型。本發(fā)明使用方法的步驟三中的熒光標記釆用cy3熒光染料。本發(fā)明使用方法的步驟四中雜交體系組分為去離子甲酰胺1.8ul,20xSSPE2.4ul，Denhardt，s0.6ul，質(zhì)控探針I(yè)Ilul,帶有熒光標記PCR產(chǎn)物3ul，純水3.2ul。本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的探針覆蓋面廣，克服了某些芯片僅僅只設計一對或少數(shù)幾對探針的缺點，對四個亞型都設計了多對探針，可有效避免由于流感病毒變異迅速而導致的漏檢。本發(fā)明中所使用的熒光標記方法效率高，且在熒光標記過程中就可對待檢測產(chǎn)物進行有效片段化，使得雜交反應效率得到極大提高，提高芯片檢測敏感度。本發(fā)明可以檢測不同種屬來源的A型流感病毒，包括人、禽、豬等，具有很高的廣譜性。圖1為本發(fā)明A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片的陣列結(jié)構示意圖，每張芯片上分布有四個相同陣列。圖2所示為每個陣列上各探針排列布局。圖3所示為典型的A型流感病毒H1N1亞型芯片檢測結(jié)果。圖4所示為典型的A型流感病毒H3N2亞型芯片檢測結(jié)果。圖5所示為典型的A型流感病毒H5N1亞型芯片檢測結(jié)果。圖6所示為典型的A型流感病毒H9N2亞型芯片檢測結(jié)果。具體實施例方式實施例一根據(jù)圖1和圖2所示，本發(fā)明提供了一種用于對A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片，它包括對H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四種亞型進行檢測和分型的79條特異性寡核苷酸探針、兩條質(zhì)控探針和載體，兩條質(zhì)控探針為質(zhì)控探針I(yè)和質(zhì)控探針n，特異性寡核苷酸探針和質(zhì)控探針I(yè)分布在載體上，載體為醛基化玻璃修飾基片，載體也可以為硅片、聚苯乙烯基片或尼龍基片，對H1N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列見表1,對H3N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列見表2，對H5N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列見表3，對H9N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列見表4，兩條質(zhì)控探針的序列見表5。表1對H1N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列編號名稱序列1H1N1-HA-1atgccaacaactcaaccgac2H1N1-HA-2acttgagaagaatgtgacagtgac3■1-HA-33cacagsatgccattg3Cgg4H1N1-HA-4gaaattggaaatggctgctttga5證1-HA-5ctatatgagaaagtaagaagccagc6H1N1-NA-1ctagtgggagcagcatttcttt7H1N1-M-2ttgtggcgttgatagtgatactg148H1N1-NA-3attcatctctttgttctatcagtgga9H1N1-NA-4atacacaaaagacaacagcataagaat10H1N1-M-5ctaatggatggacagataccgatag11H1N1-NA-6gattggtcaggatacagtggaag表2對H3N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列12H3N2-HA-1ctgttacccttatgatgtgccg13H3N2-HA-2g肌cgcagca肌gcctacag14謹2-HA-3attaacagcacagggaatctaattg15H3N2-HA-4caataatgagatcagatgcaccca16H3N2-HA-5gaacaaagaagcaactgaggga17H3N2-HA-6gctgaggatatgggcaatgg18謂2-HA-7atgacaacagc3cggcaac19H3N2-HA-8caacaggtagaatatgcgacagt20謹2-HA-9ctgttacccttatgatgtgccg21H3N2-HA-10ttatgcctcccttaggtcactag22H3N2-HA-11ggatgcggaatgtaccagaga23H3N2-HA-12aactagaggcatattcggcg24H3N2-HA-13gggtcaatcagaaatggaacttatg25H3N2-NA-1tgaccaacaccaccatagagaa26固2-NA-2agcagaatacagaaattggtcaaag27H3N2-NA-3atgcgatcctgacaagtgttatc28H3N2-NA-4ggacagggaacaacactaaacaa29H3N2-NA-5atggagtgaaaggctgggc30H3N2-NA-6tcctggtaactactgtaacattgc31謂2-NA-7gccacaatatgcttccttatgc15<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>表5兩條質(zhì)控探針的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本發(fā)明還提供了A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟一，探針的設計根據(jù)NCBI中的InfluenzaVirusResource數(shù)據(jù)庫，運用Clustalx軟件對大量A型流感病毒序列進行比對，找到其絕對或相對保守序列，然后運用ArrayDesigner4設計79條特異性寡核苷酸探針以及兩條質(zhì)控探針，每條探針的長度在19-25bP,每條探針之間Tm值相差在5°C之內(nèi)，79條特異性寡核苷酸探針的序列以及兩條質(zhì)控探針的序列見表1、表2、表3、表4和表5;步驟二，探針的合成，在合成的同時在每條探針的5'端加C6氨基修飾，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；步驟三，芯片的制備將合成后的探針用純水稀釋成40uM，取15ul,加2x芯片點樣液15ul于PCR管，用槍混勻，使探針濃度達到20uM,裝于384孔板，用芯片點樣儀將探針點于載體上，每點兩個重復，每個陣列上橫向14個點，縱向13個點，每塊芯片上點制4個重復陣列，點樣完成后將芯片放置于芯片雜交盒，同時在雜交盒底部放300ul純水用于保持濕度，將雜交盒密封，37°C反應18h，使探針和芯片表面醛基共價結(jié)合，水合完成后用0.2y。SDS清洗并用NaBH4封閉，離心干燥，貼上四樣品型圍欄，4°C密封保存。根據(jù)圖3，圖4，圖5和圖6，本發(fā)明還公開了一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片的使用方法，它包括以下步驟步驟一，流感病毒RNA的提取，使用TRIZOL常規(guī)方法提取病毒RNA;步驟二，RT—PCR:首先用Unil2引物將流感病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再使用通用引物分別PCR擴增流感病毒的HA、NA基因片段全長，擴增后的PCR產(chǎn)物用QIAGENPCRPurificationKit對進行純化；步驟三，熒光標記取純化后的PCR產(chǎn)物，使用Klenowminus酶在PCR產(chǎn)物上進行熒光標記，熒光標記釆用cy3熒光染料，將帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物用QIAGENPCRPurificationKit純化；步驟四，雜交將純化后的帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物和雜交液混勻，在基因芯片上蓋上四樣品型蓋片，將12ul雜交體系加于蓋片加樣孔使其自動覆蓋于陣列表面，雜交體系組份為去離子甲酰胺1，8ul,20xSSPE2.4ul，50xDenhardt，s0.6ul,質(zhì)控探針I(yè)Ilul,帶有熒光標記PCR產(chǎn)物3ul,純水3.2ul，將基因芯片放入雜交盒內(nèi)在20-45°C雜交1-5H;步驟五，雜交后清洗基因芯片基因芯片雜交完成后，將芯片依次在洗液0.1%SDS+2xSSC、0.1%SDS+0.2xSSC和0.2xSSC中各清洗l-5min，最后將基因芯片放入離心管中離心以去除表面液體；步驟六，掃描將步驟五中清洗后的基因芯片通過芯片掃描儀進行掃描，同時保存掃描圖像數(shù)據(jù)；步驟七，數(shù)據(jù)分析根據(jù)掃描圖像，確定出現(xiàn)熒光信號區(qū)域，以此來確定所檢測樣本中流感病毒的有無及亞型。19核苷酸序列表〈110〉泰州親和力生物技術有限公司〈120>A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片及使用方法〈160>81〈210〉1<211>20(212>DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221>miscjeature〈贈1atgccaacaactcaaccgac〈210〉2〈211〉24<22〉鵬〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉邁isc一feature(400〉23cttgagaagaatgtg3cagtg8c〈210〉3<211>20〈212〉DM〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220)〈221》misc—feature〈400〉3acacagaatgccattgacgg〈210》4(211〉23〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220〉〈221〉邁isc一feature〈贈4gaaattggaaatggctgctttga〈210)5〈211〉25(212〉DNA<213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221>misc_feature〈400〉5ctatatgagaaagtaagaagccagc〈210〉6〈211》22〈212>■〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)《220〉〈221〉misc_feature〈贈6ctagtgggagcagcatttcttt(210〉7<211〉23〈212>DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉邁isc一feature(400〉7—ttgtggcgttgatagtgatsctg〈210〉8〈211》26〈212〉DNA(213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220>〈221〉邁isc一feature(贈8_attcatctctttgttctatcagtgga咖〉9〈211〉27〈212〉DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220〉<221>misc_feature〈400〉9_核苷酸序列表atacacaaaagacaacagcataagaat〈210>10〈211〉25〈212》DNA〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)<220>〈221〉misc—feature〈働10ctaatggatggacagataccgatag〈210>11〈211》23〈212〉DM〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221》misc_feature〈細11gaUggtc柳3tacBgtgga3g〈210〉12〈211>22〈212》DM〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220〉〈221》邁isc一feature〈400〉12ctgttacccttatgatgtgccg〈210〉13〈211〉20〈212》DM〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》<221>misc一feature〈400》13g3acgcagC83agcctacsg〈210>14<211〉25〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc_feature〈400〉14attaacagcacagggaatctaattg〈2〗0〉15〈211〉24〈212〉DNA〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc_feature<400>15caatsatgagatcagstgcaccca〈210〉16〈211》22〈212》DNA〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221》misc_feature〈贈16gaacaaagaagcaactgaggga〈210>17〈211>20〈212》DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc_feature〈400》17gctgaggatatgggcaatgg〈210》18〈211〉19〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221〉misc—feature〈贈18atgacaacagcacggcaac〈210》19〈211>2321核苷酸序列表〈212〉DNA(213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221>misc一feature〈400〉19ca3C3ggtagastatgcgacagt〈210〉20<211>22(212〉DNA(213〉A型流感病毒(InnuenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc一feature〈400》20ctgttacccttatgatgtgccg(210〉21〈211》23〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc一feature<贈21ttatgcctcccttaggtcactag〈210〉22〈211〉21(212〉DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc一feature〈贈22ggatgcggaatgtaccagaga(210〉23〈211》20〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc一feature〈400》23aactagaggcatattcggcg〈210》24〈211》25〈212〉腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉邁isc一feature〈400》24gggtcsatcagsaatggaacttatg〈210〉25〈211〉22〈212〉腿(213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220>〈221〉misc_feature(細25tgaccaacaccaccatagagaa〈210》26〈211〉25(212〉DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220〉〈221》misc_feature<贈26agcagaatacagaaattggtcaBag〈210>27〈211〉23(212》DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc一feature(400〉27atgcgatcctgacaagtgttatc〈210》28〈211》23〈212〉DNA〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉<formula>formulaseeoriginaldocumentpage23</formula>核苷酸序列表〈210〉38〈211〉20〈212〉腿〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221〉misc一feature〈贈38—Cg3C3g3gC3ggttg3Caca〈210》39〈211》21〈212〉腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc_feature〈細39tcaagaa8gggg3ctc3gcsa〈210〉40〈211〉21〈212》DNA〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc_feature〈贈403aggcsat3g3tggagtcacc〈210〉41〈211>24〈212》DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221》misc一feature〈400》41gccgttgg肌gggeiatttaatBac〈210〉42〈211〉23〈212〉DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉(221〉misc—feature〈400〉42犯C犯ga3gEltggEl3gaCgg3tt<210>43〈211〉23〈212>DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉邁isc—feature〈400>43cggaatggtcttacatagtggag〈210〉44(211〉21〈212》DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc_feature(400》44ccagcca3tg3cctctgtt3c〈210〉45(211》25〈212》腿(213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221》misc一feature〈400〉45gctacaataataccaaccaagaaga〈210》46〈211》19〈212》腿〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221〉misc_feature〈400〉46cctsatgstgcggcagagc〈210〉47〈211>21(212》DNA24核苷酸序列表〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221〉misc一feature〈400〉47tgccattccacaacatacacc〈210>48〈211〉25〈212>DNA〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc_feature〈贈4833gtg3attgg3at3tggtsactgc〈210〉49(211〉22(212>DNA(213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220>〈221〉niisc_fea/ture〈贈49CCgCBgtattC3gaBg33gC38〈210>50〈211〉22〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉邁isc一feature〈細50tt3ttcaetc3gtggcg3gttcc〈210>51(211》24〈212>DNA(213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》<221>misc—feature〈400》51aagaactgaaacacctattgagca〈210〉52〈211〉23〈212〉DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉邁isc—feature〈400〉52tgg3gga3caacatactgag3ac〈210〉53〈211》25<212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221》misc_feature〈400〉53ggcataataacagacactatcaaga〈210)54〈211》20〈212》DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉<221>misc_feature〈400》54agcact幼ttccaggagcgg〈210》55〈211》24〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc_feature〈婦55ccagsactgacaggattagattgc〈210〉56〈211》22〈212〉艦〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc一feature核苷酸序列表〈400〉56attggtcaggatatagcgggag〈210〉57〈211〉19〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)<220>〈221>niisc_feature〈400〉57gccgttcatctcatgctcc〈210>58〈211〉19〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221>misc_feature〈贈58ttgactcagggagccttgc〈210〉59〈211〉23〈212>DM〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221>邁isc一feature〈贈59tgg3ggaac33C3tactgagaac〈210〉60〈211〉25〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc_feature〈贈60ttactgtaatgactgatggaccaag〈210〉61〈211〉19〈212》腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc一feature〈細61ttcggsgacaatccacgcc〈210〉62〈211>19〈212〉DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221>misc_feature〈400〉62tggcatggctcaaatcggc〈210》63〈211〉20〈212>DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc一feature〈■》63agcactaattccaggagcgg〈210〉64〈211〉19〈212》DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc_feature〈400〉64ggtggactggaacggacag〈210》65〈211〉21〈212>DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221>misc_feature〈贈65gcatcggctaccaatcaacaa〈210〉6626核苷酸序列表〈211>20〈212〉醒〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc_feature〈400〉66tgttcctgtg3cacatgcc3〈210〉67〈211〉23〈212》DNA〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉〈221〉misc—feature〈贈67atgccsaagaattactccacacs〈210〉68〈211〉22〈212>DNA—〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉邁isc一feature〈400〉68agaattgctagtgctgcttgaa〈210>69〈211》20〈212》DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221》misc—feature〈贈69C3ggtc3gacattgcg3gtg〈210》70〈211>24〈212》DNA〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc_feature〈贈70_atggtatggacacattctttcagg〈210〉71〈211》22〈212》■〈213》A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220>〈221〉misc—feature〈400〉71ac3agg3ctg3cac83ca3C幼<210》72〈211〉22<212>DNA<213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220〉<221〉misc一feature〈細72aggtcagacattgcgagtaaga〈210〉73〈211》22〈212〉腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220〉(221》邁isc一feature(贈73tct8tggcaatccttcctgtga<210》74<211》22〈212〉腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220>〈221〉misc_feature〈贈74tcggattcattctacaggagca〈210〉75〈211》22〈212〉DNA<213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)核苷酸序列表〈220》〈221〉m:isc_feature〈400>75aataccacattgccattccaca〈210>76〈211》25〈212>腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220〉(221>misc一feature<贈76ggtattctggtatcttctctgttga〈210〉77〈211〉21<212》DM〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc—feature〈400〉77ccacggctaattccaagtcac〈210〉78〈211〉24〈212>■〈213>A型流感病毒(InfluenzaAvirus)〈220》〈221〉misc—feature〈贈78—aagtggcagaatacaagaattggt〈210》79〈211〉22〈212》腿〈213〉A型流感病毒(InfluenzaAvirus)(220>〈221》misc_feature〈贈79gtcaaattacagggttcgctcc(210〉80〈211>25〈212》DM〈213)人工序列<220>〈223>根據(jù)堿基互補配對而設計，以用作芯片雜交陽性參照?！促?0cgtstatEia幼cggaacgtcg8agg〈210》81(211》25〈212》腿〈213〉人工序列〈220》〈223〉根據(jù)堿基互補配對而設計，以用作芯片雜交陽性參照?！?00)81ccttcgacgttccgttttatatacg權利要求1、一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片，其特征是它包括對H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四種亞型進行檢測和分型的79條特異性寡核苷酸探針、兩條質(zhì)控探針和載體，兩條質(zhì)控探針為質(zhì)控探針I(yè)和質(zhì)控探針I(yè)I，其中特異性寡核苷酸探針和質(zhì)控探針I(yè)分布在載體上，對H1N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列編號名稱序列1H1N1-HA-1atgccaacaactcaaccgac2H1N1-HA-2acttgagaagaatgtgacagtgac3H1N1-HA-3acacagaatgccattgacgg4H1N1-HA-4gaaattggaaatggctgctttga5H1N1-HA-5ctatatgagaaagtaagaagccagc6H1N1-NA-1ctagtgggagcagcatttcttt7H1N1-NA-2ttgtggcgttgatagtgatactg8H1N1-NA-3attcatctctttgttctatcagtgga9H1N1-NA-4atacacaaaagacaacagcataagaat10H1N1-NA-5ctaatggatggacagataccgatag11H1N1-NA-6gattggtcaggatacagtggaag對H3N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列12H3N2-HA-1ctgttacccttatgatgtgccg13H3N2-HA-2gaacgcagcaaagcctacag14H3N2-HA-3attaacagcacagggaatctaattg15H3N2-HA-4caataatgagatcagatgcaccca16H3N2-HA-5gaacaaagaagcaactgaggga17H3N2-HA-6gctgaggatatgggcaatgg18H3N2-HA-7atgacaacagcacggcaac19H3N2-HA-8caacaggtagaatatgcgacagt20H3N2-HA-9ctgttacccttatgatgtgccg21H3N2-HA-10ttatgcctcccttaggtcactag22H3N2-HA-11ggatgcggaatgtaccagaga23H3N2-HA-12aactagaggcatattcggcg24H3N2-HA-13gggtcaatcagaaatggaacttatg25H3N2-NA-1tgaccaacaccaccatagagaa26H3N2-NA-2agcagaatacagaaattggtcaaag27H3N2-NA-3atgcgatcctgacaagtgttatc28H3N2-NA-4ggacagggaacaacactaaacaa29H3N2-NA-5atggagtgaaaggctgggc30H3N2-NA-6tcctggtaactactgtaacattgc31H3N2-NA-7gccacaatatgcttccttatgc32H3N2-NA-8gtatctgaccaacaccaccatag33H3N2-NA-9ctgtgtgaaccaacaataatagaaa34H3N2-NA-10gctcaagttgtcacgatggaa35H3N2-NA-11cctattgatgaatgagttgggtgt36H3N2-NA-12gaggcttgtagatagtattggttca37H3N2-NA-13catagttgacagaggtaataggtcc對H5N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列38H5N1-HA-1cgacagagcaggttgacaca39H5N1-HA-2tcaagaaaggggactcagcaa40H5N1-HA-3aaggcaatagatggagtcacc41H5N1-HA-4gccgttggaagggaatttaataac42H5N1-HA-5aacaagaagatggaagacggatt43H5N1-HA-6cggaatggtcttacatagtggag44H5N1-HA-7ccagccaatgacctctgttac45H5N1-HA-8gctacaataataccaaccaagaaga46H5N1-HA-9cctaatgatgcggcagagc47H5N1-HA-10tgccattccacaacatacacc48H5N1-HA-11aagtgaattggaatatggtaactgc49H5N1-HA-12ccgcagtattcagaagaagcaa50H5N1-HA-13ttattcaacagtggcgagttcc51H5N1-HA-14aagaactgaaacacctattgagca52H5N1-NA-1tggaggaacaacatactgagaac53H5N1-NA-2ggcataataacagacactatcaaga54H5N1-NA-3agcactaattccaggagcgg55H5N1-NA-4ccagaactgacaggattagattgc56H5N1-NA-5attggtcaggatatagcgggag57H5N1-NA-6gccgttcatctcatgctcc58H5N1-NA-7ttgactcagggagccttgc59H5N1-NA-8tggaggaacaacatactgagaac60H5N1-NA-9ttactgtaatgactgatggaccaag61H5N1-NA-10ttcggagacaatccacgcc62H5N1-NA-11tggcatggctcaaatcggc63H5N1-NA-12agcactaattccaggagcgg64H5N1-NA-13ggtggactggaacggacag對H9N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列65H9N2-HA-1gcatcggctaccaatcaacaa66H9N2-HA-2tgttcctgtgacacatgcca67H9N2-HA-3atgccaaagaattactccacaca68H9N2-HA-4agaattgctagtgctgcttgaa69H9N2-HA-5caggtcagacattgcgagtg70H9N2-HA-6atggtatggacacattctttcagg71H9N2-HA-7acaaggactgacacaacaacaa72H9N2-HA-8aggtcagacattgcgagtaaga73H9N2-HA-9tctatggcaatccttcctgtga74H9N2-HA-10tcggattcattctacaggagca75H9N2-HA-11aataccacattgccattccaca76H9N2-NA-1ggtattctggtatcttctctgttga77H9N2-NA-2ccacggctaattccaagtcac78H9N2-NA-3aagtggcagaatacaagaattggt79H9N2-NA-4gtcaaattacagggttcgctcc兩條質(zhì)控探針的序列80Icgtatataaaacggaacgtcgaagg81IIccttcgacgttccgttttatatacg2.對H1N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>對H3N2進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>對H5N1進行檢測和分型的特異性寡核苷酸探針的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>其特征是所述的載體為醛基化修飾玻璃基片或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。3、一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟一，探針的設計根據(jù)NCBI中的InfluenzaVirusResource數(shù)據(jù)庫，對大量A型流感病毒序列進行比對，找到其絕對或相對保守序列，然后設計79條特異性寡核苷酸探針以及兩條質(zhì)控探針；步驟二，探針的合成，每條探針的5'端加C6氨基修飾，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；步驟三，芯片的制備將合成后的探針用純水稀釋成40uM，取15ul，和等體積2x芯片點樣液混勻，使探針濃度達到20uM，裝于384孔板，用芯片點樣儀將探針點于載體上，點樣完成后將芯片置于芯片雜交盒，同時在雜交盒底部放300ul純水用于保持濕度，將雜交盒密封，37°C反應18h,使探針和芯片表面醛基共價結(jié)合，水合完成后用0.2"/。SDS清洗并用NaBH4封閉，離心干燥，貼上四樣品型圍欄，4°C密封保存。4、根據(jù)權利要求3所述的A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片的制備方法，其特征是步驟一中79條特異性寡核苷酸探針以及兩條質(zhì)控探針，探針長度在19-25bp，每條探針之間Tm值相差在5。C之內(nèi)。5、根據(jù)權利要求3所述的A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片的制備方法，其特征是步驟二中所述的載體為醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。6、一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片的使用方法，其特征是它包括以下步驟步驟一，流感病毒RNA的提取，使用TRIZOL常規(guī)方法提取病毒RM;步驟二，RT—PCR:首先用Unil2引物將流感病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDM，再使用通用引物分別PCR擴增流感病毒的HA、NA基因片段全長，擴增后的PCR產(chǎn)物用QIAGENPCRPurificationKit對進行純化；步驟三，熒光標記取純化后的PCR產(chǎn)物，使用Klenowminus酶在PCR產(chǎn)物上進行熒光標記，將帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物用QIAGENPCRPurificationKit純化；步驟四，雜交將純化后的帶有熒光標記的PCR產(chǎn)物和雜交液混勻，在基因芯片上蓋上四樣品型蓋片，將12ul雜交體系加于蓋片加樣孔使其自動覆蓋于陣列表面，將基因芯片放入雜交盒內(nèi)在20-45°C雜交1-5H;步驟五，雜交后清洗基因芯片基因芯片雜交完成后，將芯片依次在洗液0.1%SDS+2xSSC、0.1%SDS+0.2xSSC和0.2xSSC中各清洗l-5min，最后將基因芯片放入離心管中離心以去除表面液體；步驟六，掃描將步驟五中清洗后的基因芯片通過芯片掃描儀進行掃描，同時保存掃描圖像數(shù)據(jù)；步驟七，數(shù)據(jù)分析根據(jù)掃描圖像，確定出現(xiàn)熒光信號區(qū)域，以此來確定所檢測樣本中流感病毒的有無及亞型。7、根據(jù)權利要求6所述的A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片的使用方法，其特征是步驟三中的熒光標記采用cy3熒光染料。8、根據(jù)權利要求6所述的A型流感病毒流行毒株檢測和分型基因芯片的使用方法，其特征是步驟四中雜交體系組分為去離子甲酰胺1.8ul，20xSSPE2.4ul,50xDenhardt，s0.6ul，質(zhì)控探針I(yè)Ilul,帶有熒光標記PCR產(chǎn)物3ul,純水3.2ul。全文摘要本發(fā)明公開一種A型流感病毒流行毒株檢測和分型的基因芯片，它包括對H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四種亞型進行檢測和分型的79條特異性寡核苷酸探針、兩條質(zhì)控探針和載體，兩條質(zhì)控探針為質(zhì)控探針I(yè)和質(zhì)控探針I(yè)I，其中特異性寡核苷酸探針和質(zhì)控探針I(yè)分布在載體上，本發(fā)明還公開了基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟一，探針的設計；步驟二，探針的合成；步驟三，芯片的制備。本發(fā)明公開基因芯片的使用方法，其特征是它包括以下步驟步驟一，流感病毒RNA的提取；步驟二HA和NA基因PCR擴增；步驟三，熒光標記；步驟四，雜交；步驟五，雜交后清洗基因芯片；步驟六，掃描；步驟七，數(shù)據(jù)分析。文檔編號C12Q1/70GK101487061SQ20081019482公開日2009年7月22日申請日期2008年11月10日優(yōu)先權日2008年11月10日發(fā)明者劉奮勇,李稀罕申請人:泰州親和力生物技術有限公司