專利名稱：：與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的分子標(biāo)記克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于豬的分子標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與肉質(zhì)性狀中系水力相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。豬經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳基礎(chǔ)十分復(fù)雜，國際上動物遺傳育種領(lǐng)域的科學(xué)家和研究人員已經(jīng)開展了大量的研究工作，但功能基因的鑒定及能用于育種實踐的分子標(biāo)記還十分有限；20世紀(jì)80年代以來，分子標(biāo)記研究取得飛速發(fā)展，形成了以分子標(biāo)記為核心的分子標(biāo)記輔助選擇和滲入等分子育種技術(shù)，這些技術(shù)與常規(guī)育種方法相結(jié)合，大大提高了豬的育種效率。肉質(zhì)性狀主要包括肌肉pH值、肌內(nèi)脂肪含量、大理石紋、系水力、剪切力、肉色、嫩度、肌纖維直徑等指標(biāo)。其中系水力是指當(dāng)肌肉受到外力作用時保持其原有水分和添加水分的能力，常用滴水損失或失水率來衡量肌肉的系水力。肌肉系水力不僅關(guān)系到肉品的質(zhì)地、風(fēng)味和組織狀態(tài)，而且具有重要的經(jīng)濟(jì)價值。例如，2000年我國豬肉產(chǎn)量4031.4萬噸，如果因系水力不良造成多損失1%重量，則將損失40,31萬噸食肉。據(jù)報道，美國僅肌肉系水力下降一項每年約損失l萬噸肉，因此，無論養(yǎng)豬生產(chǎn)者、屠宰廠、加工業(yè)、貯存、運輸和銷售業(yè)都非常重視這類性狀。但是由丁-系水力等肉質(zhì)性狀是一類活體難丁-度量的性狀，因此對這類性狀的改良一直是遺傳改良T.作的難點，若通過尋找可用的分子標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，將會加快肉質(zhì)性狀的改良速度。目前發(fā)現(xiàn)與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的的QTL兒乎分布于豬的所有染色體上，通過功能候選基因法或位置克隆的策略篩選了一些與肌肉品質(zhì)相關(guān)的分子標(biāo)記。目前已發(fā)現(xiàn)許多與肌肉品質(zhì)存在顯著相關(guān)的基因，如/I77基因(Fujii,J等,Identificationofamutationinporcineryanodinereceptorassociatedwithmalignanthyperthermia.&;ece，1991，253:448-451)，研究表明該基因的C1843T錯義突變可以導(dǎo)致豬產(chǎn)生應(yīng)激綜合癥而發(fā)生肌肉品質(zhì)的下降。(2)il脇GJ基因(Milan,D等，AmutationinPRKAG3associatedw他excessglycogencontentinpigskeletalmuscle.Scfe"ce,2000,288:1248-1251)，研究表明該基丙的一個突變是導(dǎo)致漢普夏豬產(chǎn)生"酸肉"的主要原因。目前已有多個與肉質(zhì)性狀緊密連鎖的功能基因分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)并申請專利Rothschild等發(fā)現(xiàn)基因與肉質(zhì)性狀中的嫩度關(guān)聯(lián)并在豬肉質(zhì)性狀改良中進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用(專利號US,WO2003060151-A2);Rothschild等檢測了與肌肉生長和肉質(zhì)性狀相關(guān)的C/QW，SCJW"/p/w,ZZW沖to三個基因的變異，為豬育種提供了分子標(biāo)記(專利號US,WO2004081194-A2);Gerbens等發(fā)現(xiàn)//-MM基因的變異與肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)(專利號EP,W09735878-A);Kojima等發(fā)現(xiàn)pi五/，i基因的變異能提高豬的產(chǎn)肉量(專利號US,WO2005017204-A2)等。M45Ti是Creemers等人在2006年研究Myocardin(MTOCD)基因的功能時發(fā)現(xiàn)的'DNA分子中含有SAP結(jié)構(gòu)域和MEF2結(jié)合序列，其中SAP結(jié)構(gòu)域是一個由33個氨基酸殘基形成的保守模序；MEF2結(jié)合序列是MEF2的共激活物，和Myocardin家族同屬于含SAP結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族。目前對該基因的研究主要集中在非洲蟾蜍屬和小鼠，Esther等(2006)研究發(fā)現(xiàn)雄S77基因可以通過增加內(nèi)源性MEF2的活性
背景技術(shù)：
：進(jìn)而增強肌形成(Esther等CoactivationofMEF2bytheSAPDomainProteinsMyocardinandMASTR.Mo/CW/.2006,23(1):83-96)。在非洲蟾蜍屬中，M4S77在早期骨骼肌中呈特異性表達(dá)，MASTR和MYOD、MYF5共表達(dá)協(xié)同激活一些肌肉分化(marker)基因的表達(dá)，是胚胎期肌肉基因表達(dá)所必須的(Stiyder等Themyocardin-relatedtranscriptionfactor,MASTR,cooperateswithMyoDtoactivateskeletalmusclegeneexpression.TW^S,2008,105(5):1545-1550)。另外，MASTR基因參與MRF4、MEF2D和myocardin蛋白的功能，這些蛋白在調(diào)控肌肉發(fā)育和生理學(xué)中起著重要作用。本專利申請者將豬M4SJK基因定位于豬6號染色體上SSC6qll-q21。目前報道豬的6號染色體上存在有多個與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL，其中與系水力相關(guān)的QTL有6個(G.Yue等LinkageandQTLmappingforSusscrofachromosome6.JAnimBreedGenet.,2003,120(1);45-55)。另外，EllenMarkljung等研究發(fā)現(xiàn)，在6號染色體的51-69cM區(qū)域存在有影響滴水損失的QTL(EllenMarkljung等，Genome-wideidentificationofquantitativetraitlociinacrossbetweenHampshireandLandraceII:Meatqualitytraits.SMCGe""!'".2008，9:22。通過以上研究結(jié)果我們可以得出M4S7K基因在肌肉發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。尋找基因中的變異位點，通過與性狀間的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)基因與性狀間的關(guān)系是研究基因功能的一個重要手段，也是進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)。為此開展了豬M4S77基因的克隆和SNP篩査、基因型檢測及與性狀關(guān)聯(lián)分析。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆一種作為豬標(biāo)記輔助選擇的與肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的分子標(biāo)記，為豬標(biāo)記輔助選擇提供有用的分子標(biāo)記。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)利用比較基因組方法根據(jù)人的MASTR基因序列信息克隆豬MASTR基因，獲得其編碼區(qū)序列，在編碼區(qū)篩査SNP并建立檢測方法，在已經(jīng)建立的試驗群體中檢測MASTR基因型并進(jìn)行基因型-性狀間關(guān)聯(lián)分析，得到SNP與性狀間的關(guān)聯(lián)結(jié)果。申請人通過克隆得到一種與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的MASTR基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所述。序列表SEQIDNO:1的400bp處有1個C400-T400的堿基突變，導(dǎo)致MspARFLP多態(tài)性。制備了檢測上述序列表SEQIDNO:1基因片段突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5'-CCTCACTTTCCCGCATCTTC-3',反向引物為5'-GCTCCCTATTCTTCCTTTCCAG-3'。利用上述制備的與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的分子標(biāo)記對外來豬和中國地方豬進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，從而完成了本發(fā)明。(1)豬M45TR基因片段cDNA序列的獲得。禾擁人M4Sri基因mRNA為信息探針,作同源序列篩選，獲得同源性80。/o以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST);然后拼接豬EST-重疊群，與人同源比對，根據(jù)表達(dá)序列標(biāo)簽-重疊群設(shè)計引物；用成年大白豬(外來豬)組織樣提取總RNA，RT-PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和克隆測序'進(jìn)行序列分析。申請人設(shè)計了一對克隆豬旭S77基因的cDNA序列(CDS)引物'該引物擴(kuò)增的CDS如SEQIDNO:1所述(它包括完整CDS區(qū))。(2)SNP發(fā)現(xiàn)與檢測方法建立。利用不同豬品種的RNA進(jìn)行RT-PCR，通過混合池測序篩査存在于編碼區(qū)的SNP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在于序列表SEQIDNO:1所示的第400位堿基處有一個C400-T400的堿基突變，該突變位于第4外顯子內(nèi)，且引起絲氨酸-脯氨酸的改變，導(dǎo)致My/-RFLP多態(tài)性。申請人設(shè)計了擴(kuò)增包含該SNP引物，該基因擴(kuò)增片段有221bp，當(dāng)?shù)?45bp位置是T145時，則該/酶切位點不存在，/酶切后檢測結(jié)果只有1個片段，長度是221bp(定為等位基因T);當(dāng)存在C145—T145的轉(zhuǎn)換時，其結(jié)果導(dǎo)致第145bp處一個jl^p/酶切位點的產(chǎn)生，得到2個片段，長度分別為145bp和77bp(定為等位基因C),三種基因型CC,CT,TT如圖4所述。(3)基因型-肉質(zhì)性狀間關(guān)聯(lián)結(jié)果。根據(jù)方差分析中的最小二乘法原理，使用SAS(視窗V8版)軟件中的一般線性模型(GeneralLinearModel,GLM)程序?qū)蛐团c性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，具體模型如下y,jk=p+G,+Cj+Pk+Bj+%。其中，yijk是性狀觀察值，p為總體均數(shù)，Gi為基因型效應(yīng)，Cj為品種效應(yīng)，Pk為父本效應(yīng)，Bj為批次效應(yīng)，Ew為隨機誤差，假定E;jk相互獨立，服從N(0，a2)分布。性狀關(guān)聯(lián)分析表明M4S77基因SNP位點對失水率和滴水損失有顯著影響(P<0.05)，此位點對其它肉質(zhì)性狀沒有顯著影響。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實施方式》。SEQIDNO:1是本發(fā)明克隆的與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的M4S77基因片段的核苷酸序列(cDNA序列)；圖l:是本發(fā)明的技術(shù)流程圖2:是本發(fā)明中豬M4S77基因用于克隆的CDS片段。下劃線為引物，英文字母Y后的括號內(nèi)為堿基突變；圖3:是本發(fā)明中豬M4S77基因用于PCR-RFLP檢測的DNA片段。下劃線為引物，英文字母Y后的括號內(nèi)為堿基突變；圖4:是本發(fā)明中豬，577基因^^/-1^1^的三種基因型(<:(:<:丁11:)電泳結(jié)果。圖中m:dna分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000ladder)。具體實施例方式實施例l、iW^s37基因的克隆1、引物設(shè)計用人M4S77基因cDNA(GenBank收錄號NM—001130915)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為80<>/。以上的ESTs(片段長度大于100bp)，將這些ESTs的收錄號在NCB〖中用ENTREZ(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov八Veb/Search/index.html)査詢相應(yīng)序列，然后用GeneTool中的ASSEMBLY程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)EST拼接序列設(shè)計一對引物M-F和M-R，序列如下M-F5;-CCCAAGGGGAATCTGACATAC-3'M-R5'-GCTCCCTATTCTTCCTTTCCAG-3z2、PCR產(chǎn)物的克隆和測序?qū)⒓兓蟮腜CR產(chǎn)物與pGEM-T載體在4'C水浴過夜連接；無菌狀態(tài)下取100~120nl感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中，將5nl的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min,42°C熱激卯s，后冰浴3~4min，加入400nl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37。C振蕩培養(yǎng)45min。取100pl涂布于IPTG(Isopropy他io-P-D-galactoside,中文名稱為異丙基硫代一P-D—半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37'C平放1h后倒置培養(yǎng)。挑取平板上的單菌落，接種于2—3mlLB中，37'C300r/min培養(yǎng)過夜。用1.5mlEP管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體進(jìn)行制備少量的質(zhì)粒。驗證后的重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動測序儀上進(jìn)行測序，序列測定由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成。用GeneTooll.O軟件中的ASSEMBLY程序進(jìn)行拼接，得到一條長度為827bp的CDS序列(見SEQIDNO:1所述)。DNA序列同源性檢索鑒定通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI,NationalCenterforBiotechnologyInformation,http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)軟件，將測序后獲得的DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。檢索結(jié)果表明所測序列與人M4S77基因DNA(GenBank收錄號NM—001130915)的部分序列同源性達(dá)83%。實施例2、SNP的篩査和PCR-RFLP診斷方法的^):1、SNP的篩査運用M-F和M-R引物分離豬基因組片段，通過在不同豬種的基因組中擴(kuò)增，回收進(jìn)行pool產(chǎn)物送公司測序，發(fā)現(xiàn)在該基因片段的第400位堿基處有一個C-T的堿基突變，并且引起絲氨酸-脯氨酸的改變，導(dǎo)致^/^/-1;11>多態(tài)性?；蚪M測序的弓嫩序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、PCR-RFLP診斷方法的ji5！1、引物序列<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、PCR擴(kuò)增條件PCR反應(yīng)總體積20^1,其中豬基因組DNA約100ng,含1Xbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150nmol/L，引物終濃度為0.4nmol/L'2UT辨DNA聚合酶(Promega)。PCR擴(kuò)增程序是94'C3min，循環(huán)35次94。C30s，59°C30s，然后72。C20s，最后72。C延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3、PCR-RFLP檢測條件PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是101，其中l(wèi)xbufferlpl，PCR產(chǎn)物3~5pl，限制性內(nèi)切酶Msp/為0.3^1(10U)，用H2O補足10nl，將樣品混勻后離心'37。C水浴4h'用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果'記錄基因型'在紫外燈下拍照。對該位點兩個純合子的測序結(jié)果顯述'在該221bp片段中存在一個i4^/酶切位點(GTCTCi)，其中第145bp處為多態(tài)性切點，位于外顯子4中。當(dāng)?shù)?45bp位置是T145時'則該/酶切位點不存在，Afep/酶切后檢測結(jié)果只有1個片段，長度是221bp(定為等位基因T);但存在C145—T145的替換時，其結(jié)果導(dǎo)致第145bp處一個A&p/酶切位點的產(chǎn)生，得到2個片段，長度分別為145bp和77bp(定為等位基因C)，三種基因型CC，CT,TT如圖4所述。4、PCR—RFLP—Msp/多態(tài)性在各豬品種中的分布情況利用PCR-RFLP-A&;7/檢測了6個不同中外豬品種其中國外豬品種有大白，長白和杜洛克，中國地方豬品種有通城豬、榮昌豬和二花臉豬。該突變位點在不同豬種中的基因型和基因頻率如表1所示，結(jié)果顯示M4S77基因各基因型在榮昌豬、人白豬、大白豬和杜洛克豬都有分布，在通城豬和二花臉豬中只有TT基因型。^檢驗6個不同中外豬品種間基因型頻率差異如表2所示，結(jié)果顯示國內(nèi)外不同品種間基因頻率分布存在著極顯著差異。表l:幾個豬品種M4SZR基因M印/多態(tài)性的基因型和基因頻率<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:豬^4577基因]^77/-1^0>多態(tài)性位點在不同品種中分布的差異性檢驗結(jié)，<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表示"PO.Ol,豐表示P0.05。5、本發(fā)明的分子標(biāo)記在豬肉質(zhì)性狀標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用試驗共檢測了169個豬個體中國地方豬通城純種34頭，外來豬大白純種23頭，長白純種25頭，中國地方豬與外來豬的雜交豬大長通(大白X(長白X通城))37頭、長大通(長白X(大白X通城))47頭，確定其基因型，并進(jìn)行基因型與生產(chǎn)性狀(出生至上市平均日增重、胴體直長、胴體斜長、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率、皮脂重、失水率、滴水損失、肌肉pH值、肌內(nèi)脂肪含量、肉色、眼肌面積、臀部膘厚)的關(guān)聯(lián)分析。建立如下所述的最小二乘模型yijk=H+Gi+Cj+Pk+Bj+sljk其中，y砂是性狀觀察值，^為總體均數(shù)，Gi為基因型效應(yīng)，Cj為品種效應(yīng)'Pk為父本效應(yīng)'Bj為批次效應(yīng)，&化為隨機誤差，假定e欣相互獨立，服從N(0，cj2)分布。基因型檢測結(jié)果表明在169個個體中CC基因型，有43個，CT基因型有72個個體，TT基因型有50個個體?；蛐团c性狀關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果是M4S77基因與失水率和滴水損失呈顯著相關(guān)。由表3可知，M4S77基因SNP位點對失水率和滴水損失有顯著影響(P<0.05),此位點對其它肉質(zhì)性狀沒有顯著影響。表3ikL45r及基因M^/-RFLP多態(tài)不同基因型與部分肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析肉質(zhì)性狀__肉質(zhì)性狀P值肉色0.504失水率0.04"pH值0.093滴水損失0.0174大理石紋0.986肌內(nèi)脂肪含量0.336剪切力0.358對失水率和滴水損失有顯著影響(PO.05)的M4S77基因的SNP位點基因型的最小二乘均數(shù)如表3所示=表4:SNP位點(AL4S2K)基因型滴水損失和失水率的最小二乘均數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注"表示PO.Ol,表示P0.05。表3表明，CC基因型個體的滴水損失和失水率都顯著高于TT基因個體的對應(yīng)值，CT基因型個體居中。肉此可以看出TT基因型個體的滴水損失和失水率較低。<110><120><130〉<141><160><170>〈210><211〉<212〉〈213><220〉<221><222><223〉<220〉<221〉<222><223〉<220><221〉<222〉<223〉<220〉<221>〈222><223><220><221〉<222><223><400>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的分子標(biāo)記克隆及應(yīng)用2008-10-132Patentlnversion3.11827廳豬(Susscrofa)gene(l)..(827)primer—bind(806)..(827)primer—bind(l)..(21)mutation(400)(400)CDS(31)..(801)1ccc卿ggga3tctg織teicc3cc3gtac3tgcctccagagcca卿c肌gggMetProProGluProArgGinGly54acgagggcagacccccaggetgaaThrArgAlaAspProGinAlaGlu1015ccacctctgtgggaagggacacacProProLeuTrpGluGlyThrHis2530犯gcccLysProccccctProPro8CggtcThrValtctgggSerGly90ccccgcProArg105ccctggProTrpggatcgGlySercatgccHisAlaacgacgThrThr170actThrteaSerteaSer75acgThrg&gGluProttcPhegcgAla155getAlacccProC3CHis60gagGlu肌gLyseggArgcgcArg卿Lys140g犯GluccgProttcPhe45LysetcLeutcgSerProttcPhe125ccgProaccThrgetAlaactThrttgLeucgaArgatgMet犯gLys110郷ArgagtSergttValcca>ProtecSerg朋Gluc服GinetcLeu95ccgProgccAlaccaProstgMetgcgAla175tecSercttLeucagGin80ctgLeueggArgaaaLysThratgMet160ccgProgggGlyteaSerPro卿Gin65ctgLeugagGlucgcArggetAlacctPro145getAlaatelietcggccSerAlacagcagGinGin35Pro503CCThrcgcArgcgcArggagGluttgLeu130HisccgProcctPro卿GlyetcLeuctgLeuatgMetgeicAsp115ggaGlytcgSergetAlattcPhettgggtLeuGly20cca_cctProProgtcValaaaLyseggArgcgcArg100agtSergccAlacctProccgProteaSer180cccProctgLeuggcGly85ggcGlycccProtecSercctProgetAla165gcaAlaccccctggaProProGlycctaggatgProArgMet40cccPro55102150ggtGlytcgSer眺Glu70etcLeuggtGlyctgLeueggArgcctPro150ccgProCC￡lPro卿GluccgProgccAlagatAspaggArg135cctProcctProgccAlactgLeugtgValycgX犯getAla120cccProProgcgAlatcgSer198246294342390438486534582gCCCtg3C3ctggaggagThrAlaLeuThrLeuGluGlu185190cagctgcttccgaaceggggcGinLeuLeuProAsnArgGly205gaacctgagggtaagagecgaGluProGluGlyLysSerArg220gettctgggtctgagggagggAlaSerGlySerGluGlyGly235etaagg鄉(xiāng)agtgggctggatLeuArgArgSerGlyLeuAsp250255<210>2<211>256<212>PRT<213>豬(Susscrofa)<220><221>misc—feature<222>(104)..(104)<223>The'Xaa'at<400〉2MetProProGluPro15GlySerAlaLeuGly20SerGinGinProPro35ProProGlyValPro50gagGluatelieactThrseaThr2403CCThrctgLeuAspctgLeu225ggtGlyt33gcgatecgcAlalieArgetag肌gatLeuGluAspgggctgaggGlyLeuArg230tggtgtctgaattectgggtcTrpCysLeuAsnSerTrpVal2458CttCtgg833gg33g38t3ggg3gCC3gGingacAsp2103gCSerg肌Glu195atelietttPhe卿gcgArgAla200casgtgGinVal215ttctggPheTrp630location104standsforPro,orSer.ArgGinGlyThrArgAlaAsp10ProProGlyProProLeuTrp25ProArgMetLysProThrPro40GlyProSerProProSerHis5560ProGinAlaGlu15GluGlyThrHis30PheThrSerSer45LysLeuGluLeu678726774827GinThrLeuLysLeu65LeuArgGluGluLeuThrVal70LeuProValLeuArgGlyLeuProValSerGly8590GluArgMetArgGlyGlyAlaXaaProArg100105ArgGluAspSerProLeuAspAlaProTrp115120AlaLeuGlyAlaSerArgArgProGlySer130135ProProHisAlaProHisSerProPro145AlaProAlaProPro150ProProAlaThrAla165AlaProAlaSerlieProPheSer180AlalieArgArgLeuGinGlu195lieLeuGluAspThr185GinAspAsp210SerPheGlyLeuLeu225GlyTrpCysLeuAsn245Arg230SerTrpValLeuThr170AlaLeuAla200ValGluProGin215PheTrpAlaSerArg250SerGluLeuArgGinGin7580ThrLysSerMetLeuLeu95GluArgProLysProArg110ProArgPheArgAlaLys125PheLysProSerProThr140AlaGluThrValMetMet155160AlaProAlaProAlaPro175LeuThrLeuGluGluGlu190LeuProAsnArgGlylie205GluGlyLysSerArgThr220GlySerGluGlyGlyThr235240ArgSerGlyLeuAspThr25權(quán)利要求1、一種與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的MASTR基因片段，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的MASTR基因片段，其特征在于，序列表SEQIDNO:1的400bp處有1個C400-T400的堿基突變，導(dǎo)致MspI-RFLP多態(tài)性。3、檢測權(quán)利要求2所述的一種豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的MASTR基因片段突變的引物對，所述的引物對的正向引物為5'-CCTCACTTTCCCGCATCTTC-3',反向引物為5'-GCTCCCTATTCTTCCTTTCCAG-S"4、制備如權(quán)利要求2所述的與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的MASTR基因片段的方法，按照以下步驟利用權(quán)利要求3所述的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用限制性內(nèi)切酶MspI對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，最后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測CC，CT，TT基因型的分布。5、權(quán)利要求2所述的與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的MASTR基因片段在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于家畜分子標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬肉質(zhì)性狀系水力相關(guān)的分子標(biāo)記的克隆及應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由MASTR基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO1的第400bp處有一個C400-T400的堿基突變，導(dǎo)致MspI-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴(kuò)增MASTR基因部分DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性的檢測方法。本發(fā)明為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個新的分子標(biāo)記。文檔編號C12N15/10GK101376884SQ20081019723公開日2009年3月4日申請日期2008年10月13日優(yōu)先權(quán)日2008年10月13日發(fā)明者榜劉,彭中鎮(zhèn),徐學(xué)文,韓雪蕾申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)