專利名稱：：一株高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境有機污染物生物處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一株降解高環(huán)多環(huán)芳烴組分的真菌及其在污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：多環(huán)芳烴是一類憎水性有機污染物，低水溶性是造成這類化合物持久性的主要原因。由于這類化合物具有致癌、致畸和致突變的特性而倍關(guān)注。近幾十年來，環(huán)境中的PAHs(多環(huán)芳烴)含量不斷增加，美國EPA已經(jīng)列出了16種PAHs作為優(yōu)控物，因此，修復(fù)PAHs污染的水土環(huán)境己成為研究的熱點。盡管PAHs能夠通過化學(xué)氧化、光解和揮發(fā)等途徑降解和轉(zhuǎn)移，但是微生物降解是影響自然界中PAHs持久性的最關(guān)鍵因素。生物修復(fù)被認(rèn)為是目前去除環(huán)境中有機物的最經(jīng)濟有效的方法，然而生物修復(fù)的成功應(yīng)用局限于低環(huán)PAHs，這是因為高環(huán)PAHs水溶性更低，易于吸附于有機物質(zhì)，從而降低了生物可利用性。關(guān)于高環(huán)多環(huán)芳烴的生物修復(fù)方面研究，大部分是一種菌株對單一PAH進行的，然而實際環(huán)境中多環(huán)芳烴的污染大都以混合形式出現(xiàn)，它們的相互作用使得混合多環(huán)芳烴的生物降解更為復(fù)雜。國內(nèi)外關(guān)于菌株降解高環(huán)PAH的報道，主要是以苯并[a]芘作為研究對象，如OlivierPotin等人分離出一株半知類真菌Cte/aypon'MW^/zaem^emww，4天對液體培養(yǎng)基中的苯并[a]芘降解了18%(OlivierPotin,EtienneVeignie,CatherineRafin.Biodegradationofpolycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)byC/(3cfo5por/畫s;Aaeras77e/7wwmisolatedfromanagedPAHcontaminatedsoil,FEMSMicrobiologyEcology2004，51:71-78.);國內(nèi)蘇丹等人研究了當(dāng)土壤中BaP的初始濃度為50mg/kg時，芽孢桿菌SB02、動膠桿菌SB09和黃桿菌SB10在42d內(nèi)對BaP的降解率分別為33.04%、25.39%和22.02%(蘇丹，李培軍，王鑫等.3株細(xì)菌對土壤中芘和苯并芘的降解及其動力學(xué).環(huán)境科學(xué)，2007，28(4):913-917.)。然而，關(guān)于其他高環(huán)PAH的報道很少，我們應(yīng)該加大這方面的研究力度。'
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有多種高環(huán)多環(huán)芳烴的修復(fù)技術(shù)存在的問題，提供一種能高效、快速降解高環(huán)多環(huán)芳烴物質(zhì)的菌種。本發(fā)明的另一目的是提供上述菌種在污染土壤生物處理和環(huán)境污染修復(fù)中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的高效降解菌F6來源于廣州某油罐區(qū)石油污染地表層(020cm)土，經(jīng)人工富集、篩分及純化所得到，菌株命名為F6。該菌株具有以下分類學(xué)特征在察氏平板培養(yǎng)基的生長形態(tài)為菌落表面奶酪色，部分黃色，老后灰綠色，質(zhì)地氈狀，反面暗棕色；電子顯微鏡下觀察該菌體的形態(tài)為菌絲發(fā)達有隔，子囊球形至亞球形，直徑78um，含孢子八個，分生孢子梗自分生菌絲生出，5080x2.5um，小梗單獨直接生于菌絲上，與菌絲間具一橫隔，或呈雙叉狀生出，1535x2.53.0um，分生孢子橢圓形，2.54.5umxl.82.5um，生成很長糾結(jié)鏈狀。此外，該菌株的18SrDNA序列與宛氏擬青霉(Paea7omycMv鎖'o報)的同源性達94.9%。結(jié)合以上分類學(xué)形態(tài)特征和18SrDNA序列的比對結(jié)果，該菌株命名為宛氏擬青霉(Azed/om_ycMv肌'WOF6。上述菌株于2008年8月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，編號為CCTCCNo:M208118。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明菌株在純培養(yǎng)條件下30天內(nèi)對苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽和茚并[l，2，3-cd]芘五種高環(huán)多環(huán)芳烴混合體系中PAH(多環(huán)芳烴)的降解率為16.06%24.57%，單一體系中PAH的降解率為10.42%'33.25%。同時PAH單體與混合體系中PAH的降解率存在一定差異，苯并[k]熒蒽和苯并[b]熒蒽在單一體系中降解率增大，而其他則減小。利用這些特點，本發(fā)明菌株可用于降解單一高環(huán)多環(huán)芳烴污染物或高環(huán)多環(huán)芳烴混合物污染物，或者用于土壤生物修復(fù)，并為高環(huán)多環(huán)芳烴共代謝機理研究提供了一種新的種質(zhì)資源。圖1為菌株宛氏擬青霉(paecilomycesvariotii)F6對混合體系和單一體系中高環(huán)PAH的降解效果。圖2為菌株宛氏擬青霉(paecilomycescariotii)對土壤介質(zhì)中的高環(huán)PAH的降解效果。具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但發(fā)明的實施方式不限于此。實施例l:高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌宛氏擬青霉(尸fle"7omycMvan'加7)F6的篩選分離及其多環(huán)芳烴降解性能。新鮮土樣10g放入250ml錐形燒瓶中，加入90ml滅菌的無菌水溶液，在往復(fù)震蕩器上震蕩30min，28°C(150r/min)。待固體顆粒穩(wěn)定靜置30mm后，取部分懸浮液進行稀釋得到一系列懸浮液10"，10—2，10—3，l(T4，10—5，10—6，10—7，分別各取lml均勻地涂布在含高環(huán)PAHs的瓊脂平板上(三個平行樣)，28。C時培養(yǎng)。經(jīng)過5-12天的生長，挑選特征不同(菌絲體)生長旺盛的單菌落，轉(zhuǎn)接至無PAHs的MYEA培養(yǎng)基中。在固體培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃線分離獲得純菌種。純化的菌種4"C斜面保存。真菌培養(yǎng)基(MYEA):麥芽膏提取物，0.2%;酵母膏提取物0.2%，pH7.0，以及補充0.02%氯霉素溶液。121°C高壓蒸汽處理滅菌20min;高環(huán)多環(huán)芳烴混合培養(yǎng)基將苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、茚并[l，2，3-cd]芘丙酮溶液添加到MYEA培養(yǎng)基中，每種物質(zhì)含量均為50mg丄"；高環(huán)多環(huán)芳烴單質(zhì)培養(yǎng)基將苯并[a]蒽、苯并[a]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、茚并[l，2，3-cd]芘丙酮溶液分別添加到MYEA培養(yǎng)基巾，PAH濃度均為50mg丄—1。經(jīng)反復(fù)分離純化得到的真菌進行高環(huán)多環(huán)芳烴混合降解實驗，在菌種接種前，用5ml無菌水沖洗純化菌的固體斜面，用接種環(huán)輕刮斜面，直至菌體完全洗脫下來。然后將此孢子懸液接種到含95mL5mg'ml-1的葡萄糖溶液的250mL錐形燒瓶內(nèi)，搖床培養(yǎng)(150。m，28°C)36h,以誘導(dǎo)孢子萌發(fā)和菌絲體的生長。萌發(fā)的孢子最終濃度控制在大約1071/1。將10mL孢子懸浮液加到裝有50mL髙環(huán)多環(huán)芳烴單質(zhì)(混合)液體培養(yǎng)基的150ml三角瓶，28°C，150rpm下培養(yǎng)，另外一份高環(huán)PAHs培養(yǎng)基不接種真菌，作為非生物作用降解PAHs對照。每個處理進行3個平行樣，均在無菌條件下操作。30天后取樣分析培養(yǎng)液中的PAHs含量及生物量。實驗結(jié)果見圖1。由圖l可以看出，PAH混合和單一體系中多環(huán)芳烴都有一定的降解并且存在一定差異，培養(yǎng)30d后的單一體系中各PAH的降解率大小順序為苯并[k]熒蒽〉苯并[b]熒蒽〉茚射l，2，3-cd]芘〉苯并[a]芘〉苯并[a]蒽。在混合體系中苯并[k]熒蒽和苯并[b]熒蒽的降解率分別為21.21%和21.11%，而單一體系中的降解率分別為33.25%和26.44%,均有所上升；而單一體系對苯并[a]蒽、苯并[a]芘和茚并[l，2，3-cd]芘的降解率卻下降了。本實施例說明分離所得到的宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)F6可以對五種單一或混合的高環(huán)PAH具有一定的降解能力。實施例2:各生長因子對高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌降解效果的影響1、選取pH值，溫度，污染物濃度，C:N作為影響因子(葡萄糖為C源，(NH》2S04為N源)，設(shè)計成L9(34)正交實驗，結(jié)果如表1所示。2、向一系列裝有50mL不同碳氮比的無機鹽培養(yǎng)基的錐形瓶中接入數(shù)量相同的優(yōu)勢真菌孢子(培養(yǎng)基中最終孢子數(shù)約為107個七—"，設(shè)3個重復(fù)；振蕩培養(yǎng)(150rpm，28°C)57天，測定ZPAHs的降解率，結(jié)果如表2所示。上述無機鹽培養(yǎng)基的配置方法為無機鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g'L-1):MgS04-7H2O，0.2;CaCl2.2H2O，0.01;FeSO4.7H20，0.005;KH2PO4，0.4;Na2HPO4'12H2O，0.6;蒸餾水定容至1.0L，pH7.0，120。C蒸汽滅菌30min。采用葡萄糖為C源，(NH》2S04為N源。表1和表2的結(jié)果表明高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)Fe在條件為pH值為7、溫度為20°C、C:N為10:1、PAHs初始濃度為100mg丄"時，對PAHs的降解效果最好，各因素主次為pH〉C:N〉CPAHs〉溫度。表l生長因子對宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)F6降解效果影響正交試驗<table>complextableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2宛氏擬青霉(i^ea7o/z^c^vfl/vW//)F6在不同條件下對高環(huán)PAH的降解<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table><row><column>較優(yōu)水平</column><column>2</column><column>1</column><column>2</column><column>2</column></row><row><column>因素主次</column><column>1</column><column>4</column><column>2</column><column>3</column></row><table>實施例3:宛氏擬青霉(paecilomycesvariotil)F6對PAHs人工污染土壤的降解效果1.如表4，人工配土的含C，N量都比較低(PAHs微量可忽略)，根據(jù)實例2確定的最佳C:N比添加葡萄糖和硫酸銨調(diào)整含量為C:8g/kg，N:0.8g/kg，調(diào)節(jié)含水率為60%-70%。配制營養(yǎng)液葡萄糖19.2g/L，硫酸銨3.5g/L，去離子水1L。(按葡萄糖20g/kg計算)。表3土壤中各營養(yǎng)元素含量<table><row><column>樣品</column><column>有機碳(g/kg)</column><column>全氮(g/kg)</column><column>有效磷(g/kg)</column><column>速效鉀(mg/kg)</column></row><row><column>清潔土樣</column><column>4.16</column><column>0.43</column><column>0.007</column><column>0.9</column></row><table>2.取50g土壤12份，各添加營養(yǎng)液25ml/份，即C:8g/kg，N:0.8g/kg(10:1)，混合均勻裝入滅菌培養(yǎng)皿中。其中(1)非生物降解對照三份加5mlHgCl2(0.7g/L)+5ml細(xì)菌發(fā)酵液并進行高壓滅菌；(2)土著微生物降解對照三份加經(jīng)高壓滅菌的F6孢子懸浮液5ml+5ml細(xì)胞菌發(fā)酵液；(3)三份土壤投加降解F6孢子懸浮液5ml(48h)+高壓滅菌的51111細(xì)菌發(fā)酵液(48h);(4)三份投加F6孢子懸浮液5ml+5ml細(xì)胞菌發(fā)酵液。每份含水量為70%。將準(zhǔn)備好的各土樣培養(yǎng)皿稱重并封上封口膜(防止水分流失保證供氧)，室溫避光下培養(yǎng)，每7天稱重并補充適量水分。30天后取土樣10g左右，冷凍干燥均質(zhì)化，測定PAHs殘余濃度。從表4和圖2可以看出，30天后添加了菌株F6的土壤實驗(3)與(4)與非生物對照中5種PAH含量都有明顯減少，其中(3)的ZPAHs減少了149.26mg/kg，(4)的ZPAHs減少了120.26mg/kg，而土著微生物對照(2)各PAH含量變化不大，ZPAHs僅減少了去10.99mg/kg，所以(3)和(4)中PAH降解的主要貢獻者是菌株F6。本實例這說明菌株F6對土壤介質(zhì)中的高環(huán)PAH也是具有一定降解能力。表430天后土壤中PAHs含量(mg/kgDW)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權(quán)利要求1、一株高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌，其特征在于該菌株為宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)F6CCTCCNoM208118，具備降解單一高環(huán)多環(huán)芳烴和高環(huán)多環(huán)芳烴混合物的能力。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌，其特征在于所述高環(huán)多環(huán)芳烴化合物為四環(huán)、五環(huán)或六環(huán)的苯環(huán)稠和化合物。3、權(quán)利要求1或2所述高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌在降解單一高環(huán)多環(huán)芳烴污染物或高環(huán)多環(huán)芳烴混合物污染物，或者在土壤生物修復(fù)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一株高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌及其應(yīng)用，本發(fā)明所提供的一株高環(huán)多環(huán)芳烴降解菌宛氏擬青霉(Paecilomycesvariotii)F₆，具備降解單一高環(huán)多環(huán)芳烴和高環(huán)多環(huán)芳烴混合物的能力。在多環(huán)芳烴復(fù)合體系中培養(yǎng)30d后，對多環(huán)芳烴的降解率為16.06％～24.57％；而在單一多環(huán)芳烴體系中降解率為10.42～33.25％，其中對苯并[k]熒蒽和苯并[b]熒蒽的降解率最高，分別為33.25％和26.44％。本發(fā)明提供的菌株可為開展多種高環(huán)多環(huán)芳烴降解的共代謝機理研究和多環(huán)芳烴復(fù)合污染水土環(huán)境修復(fù)技術(shù)的構(gòu)建提供了新的種質(zhì)資源。文檔編號C12R1/79GK101343616SQ20081019826公開日2009年1月14日申請日期2008年9月2日優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日發(fā)明者慧李,李伯威,蔡信德申請人:環(huán)境保護部華南環(huán)境科學(xué)研究所