專利名稱：一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種快速篩選香蕉抗枯蔞病的方法。
背景技術(shù)：
香蕉作為世界重要水果之一，年產(chǎn)量達(dá)10400萬噸(FAO， 2004)。我 國的香蕉生產(chǎn)近年來發(fā)展迅猛，到2004年全國栽培面積達(dá)26.96萬hm2， 總產(chǎn)量達(dá)642萬噸，居全球第五，是我國南方產(chǎn)量最大的水果，香蕉業(yè)已 成為我國熱區(qū)農(nóng)業(yè)中的支柱產(chǎn)業(yè)，但是由于目前香蕉栽培種抗性差，全球 香蕉產(chǎn)業(yè)深受枯萎病(又稱巴拿馬病)的危害，其病原菌為古巴尖鐮孢菌 (Fusarium oxysporum f.sp cuberse (E.F.Simth) Snyder .et hansen)， 是一種 具毀滅性的檢疫性病害，特別是該病原菌4號生理小種，能夠浸染所有的 香蕉種類，為毀滅性病害。以廣東為例，1995年報(bào)道該病在廣東危害香蕉 栽培種面積約1.4 hm2;而在2002年，發(fā)病面積猛增到1.4萬hm2， 2003 年則增加到2.0萬hm2。目前有枯萎病發(fā)生的蕉園里第一年發(fā)病率為10%， 第二年發(fā)病率為20% 30%，第三年發(fā)病率達(dá)70%以上，遭此危害的蕉田 基本上不能繼續(xù)種植香蕉。香蕉感染枯萎病后，當(dāng)前沒有任何藥劑可以防 治，因此香蕉祜萎病已使得臺灣、廣東等地部分香蕉園毀滅，造成極大的 經(jīng)濟(jì)損失。因此蕉農(nóng)只有選擇抗枯萎病的香蕉品種進(jìn)行種植，才能防止香 蕉枯萎病的發(fā)生。由于目前還沒有找到一種有效的防治香蕉枯萎病的化學(xué) 藥劑，采用種植抗病品種、與水生作物輪作和生物防治是當(dāng)前防治香蕉枯 萎病比較有效的途徑，但是香蕉試管苗市場管理較為混亂，許多不是抗病 品種被不法商以抗病品種出售，最后造成蕉農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失。而且在沒有水田 的地區(qū)，香蕉與水生作物輪作是不可能的。
本發(fā)明的目的是提供一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，分別篩選和 制備兩對特異性引物，以待檢測的香蕉植株的基因組DNA為模板，通過 PCR擴(kuò)增的方法能快速地鑒定出抗香蕉枯萎病植株和易感枯蔞病植株，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其檢測的準(zhǔn)確率達(dá)100%。為蕉農(nóng)選擇種植抗枯蔞病
香蕉品種進(jìn)行種植提供了有效的保證。
本發(fā)明包括如下步驟
(1) 香蕉基因組DNA的提取
稱取0.5g香蕉根尖或者葉片，加入0.01-0.02克聚乙烯吡咯環(huán)酮，快 速在液氮中研磨成粉末狀；將粉末轉(zhuǎn)入65 'C預(yù)熱的4 mL3%CTAB提取液 中(CTAB提取液2% CTAB， lOOmmol L1 Tris漏Cl (pH8.0)， 1.4 mol L" NaCl， 20 mmol I/1 EDTA(pH8.0)， 20/(^巰基乙醇)，同時(shí)加入20 pL10 mg mL'1的 蛋白酶K，搖勻后65 t:水浴60min，期間不斷輕輕搖動(dòng)離心管；冷卻后， 加入l/3體積5molL"的KAc溶液，混勻后冰浴20 mhi;加入等體積的氯 仿/異戊醇(24:l)，混勻后，在4'C條件下12,000 rpm離心10min;上清液 轉(zhuǎn)移到新的離心管中，向上清液中加入2/3倍體積預(yù)冷的異丙醇，充分混 勻，-20°。沉淀111后，在4'C條件下用12,000 rpm離心15min;棄上清， 加入1 mL75。/。乙醇洗滌兩次，4'C， 12,000 rpm離心5 min;棄上清，在通 風(fēng)櫥中風(fēng)干沉淀物，加入500 fiLTE緩沖液(含10嗎.mr1的RNase)溶解， 55'C水浴30min;取上層液相，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA， 在4'C條件下12,000 ipm離心15 min;棄上清，75°/。乙醇洗滌沉淀，在4 'C 條件下12,000 rpm離心15 min，棄上清，置超凈工作臺中倒置于吸水紙上 晾干，DNA干燥后，用50-10(HiL的TE溶解沉淀；用0.8%瓊脂糖凝膠電 泳檢測提取DNA的質(zhì)量，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，然后 -20'(:分裝保存?zhèn)溆茫?br> (2) PCR檢測所用兩對引物的序列_
OPU10F 5，-ACCTCGGCACTCGAAGACACAT-3，~~
OPU10R 5，-ACCTCGGCACTATTACCCATCAT-3， OPS09F 5'-TCCTGGTCCCAGTACAAATAC-3， OPS09R 5，-TCCTGGTCCCTCTGAATTTTC-3，
這兩對引物序列設(shè)計(jì)好以后，由上海生工生物公司進(jìn)行合成，得到引 物后，用dd水配成10倍的母液，使用時(shí)按要求進(jìn)行使用； (3) PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件分別利用兩對特異引物OPU10F和OPU10R， OPS09F和OPS09R對抗 病品種'威廉斯芽變'和感病品種'威廉斯'香蕉基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng) 體系為2.5 pL 10xbuffer， 0.4 jiL25 mmol丄-1 MgCl2, 1.0 |iL 2.5 m mol丄1 dNTP， lULATaqDNA聚合酶，1.0^110fimoW/1引物，20ng模板DNA， 最后加入16 ddH20補(bǔ)足到25 jiL的總反應(yīng)體積;然后在PCR儀上反應(yīng)， PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4'C預(yù)變性5 min，然后94'C變性40 S，38 。C退火1 min， 72 。C延伸90 S ,循環(huán)35次，72 。C 10 min;取10 PCR反應(yīng)產(chǎn)物與2 jiL 上樣緩沖液混勻，點(diǎn)入含EB的1.2%瓊脂糖凝膠中，在5Vcm"條件下電 泳1 h后，把瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到FX自動(dòng)成像系統(tǒng)(BIORAD公司)進(jìn)行拍照， 從擴(kuò)增的產(chǎn)物中就可以快速地確定所有檢測的待測株是否能抗香蕉枯萎 病。
本發(fā)明以香蕉基因組為模板，用兩對特異引物分別對其基因組進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，都能從抗病品種中擴(kuò)增出特異DNA片段，而感病的香蕉品種則 不能擴(kuò)增出目的片段。這項(xiàng)技術(shù)通過一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)用兩對特異引物分別進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可以相互驗(yàn)證，能有效地消除PCR假陽性的現(xiàn)象， 檢測過程快速簡單，結(jié)果可靠，從而能快速地鑒定出抗香蕉枯蔞病植株和 感枯蔞病香蕉植株。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法對香蕉抗枯萎病的 檢測的準(zhǔn)確率達(dá)100%。為蕉農(nóng)選擇抗香蕉枯萎病品種進(jìn)行提供了可靠的保 證。


圖1是本發(fā)明用OPU10F和OPU10R引物對'威廉斯'和'威廉斯芽變'基 因組擴(kuò)增結(jié)果圖2是本發(fā)明用OPS09F和OPS09R引物對"威廉斯芽變"和"威廉斯" 基因組擴(kuò)增結(jié)果圖3是本發(fā)明利用OPU10F和OPU10R在"金手指"和"威廉斯芽變" 和其它四個(gè)感病品種中的擴(kuò)增結(jié)果圖4是本發(fā)明OPS09F和OPS09R在四個(gè)感病品種、"威廉斯芽變"和"金 手指"中的擴(kuò)增結(jié)果圖5是本發(fā)明利用OPU10F和OPU10R對"威廉斯芽變"組培苗檢測 結(jié)果圖；圖6是本發(fā)明利用OPS09F和OPS09R對"威廉斯芽變"組培苗檢測結(jié) 果圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l
分別用OPU10F和OPU10R、 OPS09F和OPS09R兩對引物都能從抗香蕉 枯蔞病品種"威廉斯芽變"4個(gè)植株中通過PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出約為1800bp 的DNA片段，而在感染病品種"威廉斯"4個(gè)植株中則無此片段出現(xiàn)如圖l 和圖2所示。說明通過利用引物OPU10F和OPU10R、 OPS09F和OPS09R對香 蕉基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠準(zhǔn)確地從香蕉植株中篩選出抗香蕉枯萎病品 種，此目的帶的出現(xiàn)也可作為香蕉抗枯蔞病抗品種 一個(gè)重要標(biāo)記。
圖l.用OPU10F和OPU10R引物對'威廉斯'和'威廉斯芽變'基因組擴(kuò) 增結(jié)果，1,2,3,4是"威廉斯芽變"是抗病品種；5,6，7,8是"威廉斯"是感 病品種。
圖2 .用OPS09F和OPS09R引物對"威廉斯芽變"和"威廉斯"基因 組擴(kuò)增結(jié)果，1,2,3,4是"威廉斯芽變"是抗病品種；5,6,7,8是"威廉斯" 是感病品種。
實(shí)施例2
將OPU10F和OPU10R， OPS09F和OPS09R引物用于感病品種
('Cavendish'、'大蜜哈，、'巴西蕉，、'野生蕉，)和抗病品種('金手指
Goldfinger，)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果表明，用OPU10F和OPU10R這一對
引物在抗病品種'金手指'和"威廉斯芽變"中均穩(wěn)定擴(kuò)增出大小相同的目
的片段，而感病的4個(gè)品種均不能擴(kuò)增出目的片段如圖3所示；再用
OPS09F和OPS09R在抗病品種'金手指'和"威廉斯芽變"均擴(kuò)增出目的片
段，但是在金手指中擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)多條泳帶，這是可能是由于退火時(shí)溫度過
低導(dǎo)致的錯(cuò)配現(xiàn)象而造成的如圖4所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分別用兩對引物
相互驗(yàn)證可以直接應(yīng)用于香蕉抗病枯萎病品種快速檢測。
圖3利用OPU10F和OPU10R在"金手指"和"威廉斯芽變"和其
它四個(gè)感病品種中的擴(kuò)增結(jié)果。
注M是Maricer2000; 1，"金手指"是抗病品種，2，"威廉斯芽變"是
抗病品種；3,4,5,6分別為感病品種("Cavendish"、"大蜜哈"、"巴西蕉"、"野生蕉")
圖4 OPS09F和OPS09R在四個(gè)感病品種、"威廉斯芽變"和"金手指" 中的擴(kuò)增結(jié)果。
注M是Marker 2000; 1，2,3,4是四個(gè)感病品種("Cavendish"、"大蜜 哈"、"巴西蕉"、"野生蕉");5,6是"威廉斯芽變"和"金手指"。 實(shí)施例3
隨機(jī)選取本實(shí)驗(yàn)室的40株"威廉斯芽變"組培材料，分別利用OPU10F 和OPU10R， OPS09F和OPS09R引物，對其組培苗是否也能抗香蕉枯萎病 情況進(jìn)行分析。用兩對引物分別檢測到在40株"威廉斯芽變"幼苗，結(jié)果 表明有39株苗都能擴(kuò)增出目的片段。在組培苗中有一株可能發(fā)生了變異， 導(dǎo)致基因組中目的片段的缺失，所以擴(kuò)增不出目的片段。
同時(shí)對這40株組培苗進(jìn)行接種枯萎病4號生理小種病菌后，再種植在 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所香蕉園內(nèi)(廣東湛江)，在香蕉苗 種植后整個(gè)生育期間沒有枯萎病的發(fā)生。因此從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，利用這兩 對引物進(jìn)行檢測后再種植，能保證檢測到的香蕉苗抗枯萎病植株不感染枯 蔞病，所以這種快速的檢測方法是切實(shí)有效的。
圖5利用OPU10F和OPU10R對"威廉斯芽變"組培苗檢測結(jié)果。 注M是Marker 2000; 140是是"威廉斯芽變"組培苗，其中第六個(gè)植 株發(fā)生了變異，PCR結(jié)果為陰性，其他39株均為陽性。
圖6利用OPS09F和OPS09R對"威廉斯芽變"組培苗檢測結(jié)果。 注M是Marker 2000; 140是是"威廉斯芽變"組培苗，其中第六個(gè)植 株發(fā)生了變異，PCR結(jié)果為陰性，其他39株均為陽性。
所需要的儀器和藥品在國內(nèi)的的生物試劑公司均有公幵銷售，能很容易 地從市場上購買到。 .
權(quán)利要求
1、一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，其特征是包括如下步驟(1)香蕉基因組DNA的提取稱取0. 5g香蕉根尖或者葉片，加入0.01-0.02克聚乙烯吡咯環(huán)酮，快速在液氮中研磨成粉末狀；將粉末轉(zhuǎn)入65℃預(yù)熱的4mL3％CTAB提取液中，同時(shí)加入20μL10mg mL-1的蛋白酶K，搖勻后65℃水浴60min，期間不斷輕輕搖動(dòng)離心管；冷卻后，加入1/3體積5mol L-1的KAc溶液，混勻后冰浴20min；加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻后，在4℃條件下12,000rpm離心10min；上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，向上清液中加入2/3倍體積預(yù)冷的異丙醇，充分混勻，-20℃沉淀1h后，在4℃條件下用12,000rpm離心15min；棄上清，加入1mL75％乙醇洗滌兩次，4℃，12,000rpm離心5min；棄上清，在通風(fēng)櫥中風(fēng)干沉淀物，加入500μLTE緩沖液溶解，55℃水浴30min；取上層液相，加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇沉淀DNA，在4℃條件下12,000rpm離心15min；棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，在4℃條件下12,000rpm離心15min，棄上清，置超凈工作臺中倒置于吸水紙上晾干，DNA干燥后，用50-100μL的TE溶解沉淀；用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的質(zhì)量，同時(shí)用紫外分光光度計(jì)檢測DNA濃度，然后-20℃分裝保存?zhèn)溆茫?2)PCR檢測所用兩對引物的序列這兩對引物序列設(shè)計(jì)好以后，由上海生工生物公司進(jìn)行合成，得到引物后，用dd水配成10倍的母液，使用時(shí)按要求進(jìn)行使用；(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件分別利用兩對特異引物OPU10F和OPU10R，OPS09F和OPS09R對抗病品種‘威廉斯芽變’和感病品種‘威廉斯’香蕉基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為2.5μL 10×buffer，0.4μL 25mmol.L-1MgCl2，1.0μL 2.5m mol.L-1dNTP，1U LATaq DNA聚合酶，1.0μL 10μmol·L-1引物，20ng模板DNA，最后加入16μL ddH2O補(bǔ)足到25μL的總反應(yīng)體積；然后在PCR儀上反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，然后94℃變性40S，38℃退火1min，72℃延伸90S，循環(huán)35次，72℃ 10min；取10μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物與2μL上樣緩沖液混勻，點(diǎn)入含EB的1.2％瓊脂糖凝膠中，在5V.cm-1條件下電泳1h后，把瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到FX自動(dòng)成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)進(jìn)行拍照，從擴(kuò)增的產(chǎn)物中就可以快速地確定所有檢測的待測株是否能抗香蕉枯萎病。
2、 據(jù)權(quán)利要求職所述的一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，其特征是 CTAB提取液2。/。CTAB， lOOmmol L" Tris-Cl ， pH8.0， 1.4 mol L" NaCl， 20 mmol L" EDTA ， pH8.0， 2°/<^巰基乙醇。
3、 據(jù)權(quán)利要求職所述的一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，其特征是 緩沖液含10叫.mr1的Rnase。
全文摘要
一種快速篩選香蕉抗枯萎病的方法，分別制備兩對特異性引物，以待檢測的香蕉植株的基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增的方法能快速地鑒定出抗香蕉枯萎病植株和易感枯萎病植株。本發(fā)明以香蕉基因組為模板，用兩對特異引物分別對其基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，都能從抗病品種中擴(kuò)增出特異DNA片段，而感病的香蕉品種則不能擴(kuò)增出目的片段。這項(xiàng)技術(shù)通過一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)用兩對特異引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果可以相互驗(yàn)證，能有效地消除PCR假陽性的現(xiàn)象，檢測過程快速簡單，結(jié)果可靠，從而能快速地鑒定出抗香蕉枯萎病植株和感枯萎病香蕉植株。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法對香蕉抗枯萎病的檢測的準(zhǔn)確率達(dá)100％。為蕉農(nóng)選擇抗香蕉枯萎病品種提供了可靠的保證。
文檔編號C12Q1/68GK101423870SQ20081019842
公開日2009年5月6日 申請日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日
發(fā)明者張秀梅, 李偉才, 尉 王, 胡玉林, 莫億偉, 謝江輝, 陳佳瑛 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所