專利名稱：霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測(cè)試劑，具體涉及一種霍亂弧菌基因快速診斷 試劑盒及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
目前對(duì)霍亂弧菌有多種檢測(cè)方法，從以病原微生物分離鑒定、形態(tài)學(xué)鑒定和自動(dòng)生化鑒定為主的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB 15984—1995、 SN/T 1022—2001)，到特異蛋白的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、核酸探針、聚合酶鏈 式反應(yīng)(PCR)技術(shù)等分子生物學(xué)檢測(cè)方法(SN/T 1872—2007)。其中 病原核酸檢測(cè)在快速性、安全性、準(zhǔn)確性和靈敏性等方面都有很大的 提高，這些新技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等微生物學(xué)檢測(cè) 舊模式，不需要對(duì)微生物進(jìn)行分離提純，而直接用樣品或樣品的增菌 液對(duì)其基因及基因產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測(cè)，并且與分子生物學(xué)技術(shù)及生物 信息學(xué)手段相結(jié)合，向準(zhǔn)確、快速、靈敏和自動(dòng)化的方向發(fā)展。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測(cè)技術(shù)在實(shí) 際應(yīng)用中也存在一些問(wèn)題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要 專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過(guò)程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)技術(shù)雖然較好地解決了交 叉污染的問(wèn)題，并簡(jiǎn)化了操作過(guò)程，但卻需要更復(fù)雜的定量測(cè)定儀器，因此不適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù) 中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)快 速簡(jiǎn)便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確 性不夠，目前只能是輔助檢測(cè)手段。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最 新成果對(duì)滿足病原微生物檢測(cè)要求的不斷提高具有重要意義。其中等 溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測(cè)技術(shù)是病原核酸檢測(cè) 技術(shù)上的長(zhǎng)足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來(lái)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡(jiǎn)禾爾LAMP )具有j艮 多的優(yōu)越性，且目前也未見有用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)霍亂弧菌的 基因快速診斷試劑盒。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種檢測(cè)成本 低、使用方便、檢測(cè)速度快、特異性高的基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的 霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒 的檢測(cè)方法。本發(fā)明的上述目的是通過(guò)如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的一、本發(fā)明的霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒，是由兩對(duì)引物、fi^DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成，以上七種液體分別置于容器中，其中 所述的兩對(duì)引物為夕卜弓I物F3: GGTGACTTTATTGTGCGC;外引物B3: GGCTACCTAACTCACCAC;內(nèi)引物FIP: ACTGCCAACTCACTTTGAGTGttttCCTCGGTAGT ACCTAATGAC;內(nèi)引物BIP: CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAttttCAGAGGT AGAAATCTTATGTGAA;上述每lL反應(yīng)液中含有1.6 2mmo1 dNTP 、 20 25mmo1 Tris-HCl、 10 12.5mmol氯化鉀、10 12.5mmol硫酸銨、8 10mmo1 硫酸鎂、1 1.25ml TritonX-lOO、 0.8 lmol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP 各1.6 2mol和外引物F3/B3各0.2 0.25mol;優(yōu)選的比例是每1L反應(yīng) 液中含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmol氯化鉀、12.5mmo1 硫酸銨、10mmol硫酸鎂、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內(nèi)引物 FIP/BIP各2mol和外引物F3/B3各0.25mo1。上述每1L樣品預(yù)處理液中含有10 20 mmol pH 8.0的Tris-HC1、 1 2 mmol EDTA和10 12ml Triton X-100。優(yōu)選的比例是每1L樣品預(yù) 處理液中含有20mmo1 Tris-HC1 (pH 8.0)、 2mmo1 EDTA和12ml Triton X-100。上述顯色液優(yōu)選為熒光染料SYBR Green I或EvaGreen;上述穩(wěn)定液優(yōu)選為石蠟油。 上述陽(yáng)性對(duì)照為霍亂弧菌基因組DNA。 二、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的生產(chǎn)工藝 1、將內(nèi)引物FHVBIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度檢測(cè)，抽樣質(zhì)檢；2、 將反應(yīng)液無(wú)菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢;3、 將穩(wěn)定液無(wú)菌分裝，抽樣質(zhì)檢；4、 將陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、 組裝試劑盒。三、本發(fā)明基因快速診斷試劑盒的檢測(cè)方法1、 樣品處理將待測(cè)樣品增菌后于離心管中離心，去上清，沉淀中加入樣品預(yù) 處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上清即為 樣品模板DNA;2、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)反應(yīng)過(guò)程在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積％， fof DNA聚合酶大片段 0.9 1.8體積％，穩(wěn)定液52 54.5體積％，樣品模板DNA4.5 9體 積％， 63 65。C恒溫反應(yīng)45 90min。所述體積百分比是指占四個(gè)組 分總體積的體積百分比。3、 反應(yīng)后處理在上述反應(yīng)管和陽(yáng)性對(duì)照組中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯 色與對(duì)照組相同則為陽(yáng)性，否則為陰性。本發(fā)明的原理是利用BW DNA聚合酶和根據(jù)耙基因序列設(shè)計(jì)的 兩對(duì)特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異 性識(shí)別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DN A區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多 環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過(guò)程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg^結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物^"焦 磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過(guò)肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒 溫(63 65°C)條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條 件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡(jiǎn)單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的撿 測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、容易污染及檢測(cè)成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測(cè)方法對(duì)檢 測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡(jiǎn)便，不需要特殊的試劑 和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一 種簡(jiǎn)便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與P CR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù) 在靈敏度、特異性和檢測(cè)范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技 術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)高通量快速檢測(cè)，而 且檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。國(guó)內(nèi)目前尚未有這方面的試 劑盒出售。目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié) 合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初歩鑒定需2 3天，完 成鑒定報(bào)告需10 15天；采用本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒僅需2 小時(shí)。并且，本發(fā)明的反應(yīng)液中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清 晰。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果l.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反 應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷 試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的 存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高；4.本發(fā)明的基 因快速診斷試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā) 明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與 反應(yīng)溶液中的MgS+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物一焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼 觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高， 更加明顯可靠。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例l試劑盒的制備(1) 按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物 外引物F3: GGTGACTTTATTGTGCGC;外引物B3: GGCTACCTAACTCACCAC;內(nèi)引物FIP: ACTGCCAACTCACTTTGAGTGttttCCTCGGTAGT ACCTAATGAC;內(nèi)引物BIP: CGCTTGGCTATATGTTTACTGACAttttCAGAGGT AGAAATCTTATGTGAA;(2) 購(gòu)置DNA聚合酶BwDNApolymerase(大片段)，置于容器。(3) 配制反應(yīng)液反應(yīng)液的配方按每1L溶液含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-Cl、 12.5mmo1氯化鉀、12.5mmo1硫酸銨、lOmmol硫 酸鎂、1.25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各2mo1 和外引物F3/B3各0.25mol配制，置于容器。(4) 配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液的配方按每1L溶液含有20mmolTris-HCl (pH8.0) 、 2 mmol EDTA和12ml Triton X-100配帝iJ，置于容器。(5) 購(gòu)置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6) 購(gòu)置顯色液SYBRGreen I,置于容器。(7) 提取陽(yáng)性對(duì)照霍亂弧菌基因組DNA，置于容器。(8) 將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。 制備工藝簡(jiǎn)述如下1、 將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制， 濃度撿測(cè)，抽樣質(zhì)檢；2、 將反應(yīng)液無(wú)菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；3、 將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；4、 將陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、 組裝試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的制備 反應(yīng)液的配方為每1L反應(yīng)液中含有1.6mmo1 dNTP、 20mmo1 Tris-HCl、 lOmmol氯化鉀、10mmol硫酸銨、8mmol硫酸鎂、lml Tr itonX-100、 0.8mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6mol和外引物F3/B 3各0.2mol;樣品預(yù)處理液的配方為每lL樣品預(yù)處理液中含有10mmo1 pH 8.0的Tris-HC1、 lmmol EDTA和10ml Triton X-100。 顯色液為EvaGreen。其他同實(shí)施例l。實(shí)施例3霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒的應(yīng)用 1、樣品處理(模板DNA提取)(1) 采用無(wú)菌操作技術(shù)取食品樣品25g (ml)，按SN/T 1022—2001 進(jìn)行增菌處理；(2) 取lml增菌液，10000rpm離心2min，獲得菌體沉淀；(3) 在上述菌體沉淀中加入10(Vl樣品預(yù)處理液混合均勻，沸水中 煮10分鐘后立即置于冰上冷卻10分鐘，10000rpm離心2分鐘，上清 即為樣品模板DNA。2、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)過(guò)程1) 在200pl反應(yīng)管配制反應(yīng)體系反應(yīng)液22^1， B^DNA聚合 酶0.5pl (4U)，穩(wěn)定液30jxl，模板DNA2,5nl。2) 將配制好的反應(yīng)管于64'C恒溫反應(yīng)lh。3、 反應(yīng)后處理向上述反應(yīng)產(chǎn)物中加入2plSYBRGreenI，混勻，同時(shí)也向陽(yáng)性 對(duì)照管(霍亂弧菌基因組DNA)中加入SYBR Green I混勻，若反應(yīng)管與對(duì)照管一樣顯現(xiàn)綠色則為陽(yáng)性，若反應(yīng)管顯現(xiàn)橙色則為陰性。
權(quán)利要求
1、一種霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒，其特征在于由Bst DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成，以上五種液體分別置于容器中，反應(yīng)液內(nèi)兩對(duì)引物為外引物F3GGTGACTTTATTGTGCGC；外引物B3GGCTACCTAACTCACCAC；內(nèi)引物FIPACTGCCAACTCACTTTGAGTGttttCCTCGGTAGTACCTAATGAC；內(nèi)引物BIPCGCTTGGCTATATGTTTACTGACAttttCAGAGGTAGAAATCTTATGTGAA；每1L反應(yīng)液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化鉀、10～12.5mmol硫酸銨、8～10mmol硫酸鎂、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物F3/B3各0.2～0.25mol；每1L樣品預(yù)處理液中含有10～20mmol pH 8.0的Tris-HCl、1～2mmol EDTA和10～12ml Triton X-100；上述陽(yáng)性對(duì)照為霍亂弧菌基因組DNA。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述的顯色液為SYBR Green I或EvaGreen。
3、 根據(jù)權(quán)利要求l所述試劑盒，其特征在于所述每1L樣品預(yù)處理 液中含有20 mmol pH 8.0的Tris- HC1、 2mmo1 EDTA和12ml TritonX-100。
4、根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述每1L反應(yīng)液中 含有2mmo1 dNTP、 25mmo1 Tris-HCl、 12.5mmo1氯化鉀、12.5mmo1 硫酸銨、lOmmol硫酸鎂、L25ml TritonX-100、 lmol甜菜堿、內(nèi)引 物FnVBDP各2mo1和外引物F3/B3各0.25mol。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于所述穩(wěn)定液為石蠟油。
6、 一種檢測(cè)霍亂弧菌的方法，其特征是使用權(quán)利要求l所述試劑 盒，按下列步驟進(jìn)行(1) 將待測(cè)樣品增菌后于離心管中離心，去上清，沉淀中加入 樣品預(yù)處理液并混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心后，上 清即為樣品模板DNA;(2) 在反應(yīng)管中加入反應(yīng)液38 40體積％， BstDNA聚合酶大 片段0.9 1.8體積％，穩(wěn)定液52 54.5體積％，樣品模板DNA4.5 9體積％，恒溫反應(yīng)；(3) 在上述反應(yīng)管和陽(yáng)性對(duì)照組中分別加入顯色液，混勻，樣 品組顯色與對(duì)照組相同則為陽(yáng)性，否則為陰性。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述檢測(cè)方法，其特征在于步驟(2)中，恒 溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C ，反應(yīng)時(shí)間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明公開了霍亂弧菌基因快速診斷試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒由兩對(duì)引物、DNA聚合酶、穩(wěn)定液、反應(yīng)液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽(yáng)性對(duì)照液組成，以上七種液體分別置于容器中。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒快速、高效、靈敏度高，只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測(cè)成本低。本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡(jiǎn)便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg²⁺結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—焦磷酸鎂沉淀，可通過(guò)肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽(yáng)性結(jié)果顯色差異顯著，更加明顯可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101403005SQ200810198809
公開日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者莉 凌, 曹以誠(chéng), 李志勇, 杜正平, 譚惠媚, 洵 陳 申請(qǐng)人:廣州華峰生物科技有限公司