專利名稱：：基于氧化還原電位自動(dòng)反饋調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地涉及一種通過(guò)基于氧化還原電位自動(dòng)反饋調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法和設(shè)備。
背景技術(shù)：
：氧化還原電位(ORP)表示溶液中不同氧化還原物質(zhì)對(duì)所構(gòu)成的氧化還原電勢(shì)。在發(fā)酵過(guò)程中，氧化還原反應(yīng)是與其胞內(nèi)的代謝過(guò)程相關(guān)聯(lián)的，因此，發(fā)酵液并不總是處于氧化還原平衡的狀態(tài)。很多研究表明，每個(gè)微生物都有一個(gè)最適生長(zhǎng)和產(chǎn)能的ORP范圍，但很多微生物都不能自發(fā)的進(jìn)入此范圍。在很多微生物的厭氧發(fā)酵過(guò)程中，ORP作為一個(gè)極其有用的過(guò)程參數(shù)來(lái)研究生物過(guò)程碳流量分布、能量分布、發(fā)酵產(chǎn)物的優(yōu)化及放大。對(duì)于不同的工程菌，通過(guò)調(diào)控0RP，可以影響工程菌的生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。例如，對(duì)于釀酒酵母，可以通過(guò)控制通氣中的氧濃度使得厭氧發(fā)酵過(guò)程中的ORP保持在其最適范圍，從而最大限度的降低發(fā)酵過(guò)程中副產(chǎn)物的生成，提高乙醇產(chǎn)率?？刂芆RP的方法主要有兩種一種是改變發(fā)酵罐通氣系統(tǒng)中空氣流量來(lái)改變發(fā)酵體系中的微量氧濃度；另一種方法是向發(fā)酵罐中加入氧化性或還原性的物質(zhì)，如氨、過(guò)氧化氫、二氧化氯等。由于加入氧化性或還原性的物質(zhì)可能會(huì)對(duì)整個(gè)發(fā)酵體系中的其它代謝情況產(chǎn)生影響，因此綜合考慮成本等因素，一般通過(guò)改變空氣流量來(lái)控制ORP。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，微量氧濃度的改變會(huì)對(duì)發(fā)酵反應(yīng)體系中氧化還原平衡產(chǎn)生很大的影響，一旦原有體系的平衡被打破，微生物將形成新的氧化還原平衡，從而使體系的ORP值不斷發(fā)生變化。ORP對(duì)微量氧非常敏感，因此通過(guò)人工來(lái)控制ORP保持某恒定水平比較困難。從現(xiàn)有的關(guān)于發(fā)酵體系中ORP的研究看，大多數(shù)都是通過(guò)手動(dòng)改變通氣中氧含量來(lái)維持ORP在設(shè)定值。迄今為止，還沒(méi)有如何實(shí)現(xiàn)ORP的自動(dòng)反饋控制的方法和設(shè)備。因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)自動(dòng)調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的方法和設(shè)備。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種自動(dòng)調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的方法和設(shè)備。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種自動(dòng)調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的方法，包括步驟(a)測(cè)定發(fā)酵體系的氧化還原電位ORP，記為實(shí)際0RP值；(b)將測(cè)定的實(shí)際ORP值數(shù)據(jù)輸送給中央處理器；(c)中央處理器將測(cè)定的實(shí)際ORP值與預(yù)定的ORP值或ORP值區(qū)間進(jìn)行比較，并據(jù)此產(chǎn)生調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)和調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(d)將所述調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)輸送給控制空氣流量的第一控制器，所述的第一控制器基于該第一控制信號(hào)調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的空氣流量；并且將所述調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)輸送給控制氮?dú)饬髁康牡诙刂破?，所述的第二控制器基于該第二控制信?hào)調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的氮?dú)饬?e)讓發(fā)酵體系在所述的空氣流量和氮?dú)饬髁肯掳l(fā)酵一段時(shí)間Tn,其中n表示循環(huán)次數(shù)；和(f)在所述的厭氧發(fā)酵過(guò)程中，重復(fù)步驟(a)至(e)。在另一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，按以下方式產(chǎn)生控制信號(hào)-(i)若實(shí)際ORP值處于預(yù)定ORP值區(qū)間內(nèi)，則產(chǎn)生用于維持當(dāng)前空氣流量的、調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)，并且產(chǎn)生用于維持當(dāng)前氮?dú)饬髁康?、調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(ii)若實(shí)際ORP值小于預(yù)定ORP值區(qū)間的下限，則產(chǎn)生用于增加當(dāng)前空氣流量的、調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)，并且產(chǎn)生用于減少當(dāng)前氮?dú)饬髁康?、調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(iii)若實(shí)際ORP值大于預(yù)定ORP值區(qū)間的上限，則產(chǎn)生用于減少當(dāng)前空氣流量的、調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)，并且產(chǎn)生用于增加當(dāng)前氮?dú)饬髁康?、調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)。在另一優(yōu)選例中，在發(fā)酵過(guò)程中維持發(fā)酵體系總通氣流量不變，即空氣流量和氮?dú)饬髁康目偭坎蛔?。在另一?yōu)選例中，若實(shí)際ORP值小于預(yù)定ORP值區(qū)間的下限，則第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)所導(dǎo)致的流量遞變值A(chǔ)F的絕對(duì)值滿足以下條件(l)流量遞變值A(chǔ)F位于預(yù)定的流量遞變值區(qū)間下限AFmin和上限AFmax之間；(2)流量遞變值A(chǔ)F與預(yù)定ORP值區(qū)間下限與實(shí)際ORP值的差值A(chǔ)ORP成正比關(guān)系；和/或若實(shí)際ORP值大于預(yù)定ORP值區(qū)間的上限，則第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)所導(dǎo)致的流量遞變值A(chǔ)F的絕對(duì)值滿足以下條件(l)流量遞變值A(chǔ)F位于預(yù)定的流量遞變值區(qū)間下限AFmin和上限AFmax之間；(2)流量遞變值A(chǔ)F與實(shí)際0RP值與預(yù)定0RP值區(qū)間上限的差值△0RP成正比關(guān)系。在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，所述的一段時(shí)間Tn滿足以下條件Tn《5分鐘。較佳地，Tn《2分鐘；更佳地，Tn《l分鐘。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)n》2時(shí)，中央處理器還對(duì)所述的Tn進(jìn)行如下調(diào)節(jié)若實(shí)際ORP值處于預(yù)定ORP值區(qū)間內(nèi)，則維持所述的一段時(shí)間Tn，即1^=Tn-l;并且若實(shí)際ORP值小于預(yù)定ORP值區(qū)間的下限，則所述的一段時(shí)間Tn與上一循環(huán)中的間隔時(shí)間Tn-l的差值A(chǔ)T的絕對(duì)值與預(yù)定ORP值區(qū)間下限與實(shí)際ORP值的差值A(chǔ)ORP成反比關(guān)系；并且若實(shí)際ORP值大于預(yù)定ORP值區(qū)間的上限，則所述的一段時(shí)間Tn與上一循環(huán)中的間隔時(shí)間Tn-l的差值A(chǔ)T的絕對(duì)值與實(shí)際ORP值與預(yù)定ORP值區(qū)間上限的差值A(chǔ)ORP成反比關(guān)系。在另一優(yōu)選例中，所述的預(yù)定0RP值區(qū)間是-150mV土10mV;-50mV土10mV;或-200mV士10mV。更佳地，預(yù)定ORP值區(qū)間是-150mV土5mV;-50mV土5mV;或-200mV土5mV。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種厭氧發(fā)酵方法，包括步驟在發(fā)酵過(guò)程中，用本發(fā)明第一方面中所述的方法控制發(fā)酵體系的氧化還原電位。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種乙醇發(fā)酵方法，包括步驟在生產(chǎn)乙醇的工程菌的發(fā)酵過(guò)程中，用本發(fā)明第一方面中所述的方法控制發(fā)酵體系的氧化還原電位處于預(yù)定ORP值區(qū)間；以及從發(fā)酵體系中分離出所產(chǎn)生的乙醇。在另一優(yōu)選例中，所述的乙醇工程菌是釀酒酵母。更佳地，所述的預(yù)定0RP值區(qū)間是-150mV土10mV。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的設(shè)備，包括以下組件(a)探頭，所述探頭用于測(cè)定發(fā)酵體系的氧化還原電位ORP(即實(shí)際ORP值)；(b)位于探頭和中央權(quán)利要求之間并與其相連的模數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D轉(zhuǎn)換器)，所述的A/D轉(zhuǎn)換器用于轉(zhuǎn)換探頭測(cè)定的實(shí)際ORP值并將數(shù)據(jù)輸送給中央處理器；(c)中央處理器，所述的中央處理器將測(cè)定的實(shí)際ORP值與預(yù)定的ORP值或ORP值區(qū)間進(jìn)行比較，并據(jù)此產(chǎn)生調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)和調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(d)位于中央處理器和空氣流量控制器之間并與其相連的、并且位于中央處理器和氮?dú)饬髁靠刂破髦g并與其相連的數(shù)模轉(zhuǎn)換器(D/A轉(zhuǎn)換器)，所述的D/A轉(zhuǎn)換器用于轉(zhuǎn)換中央處理器產(chǎn)生的第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)并將其分別輸送給空氣流量控制器和氮?dú)饬髁靠刂破鳎?e)空氣流量控制器，用于調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的空氣流量；(f)氮?dú)饬髁靠刂破?，用于調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的氮?dú)饬髁俊Ｔ诹硪粌?yōu)選例中，所述的設(shè)備還包括發(fā)酵罐，所述的發(fā)酵罐具有攪拌裝置。在另一優(yōu)選例中，所述的設(shè)備還包括以下一個(gè)或多個(gè)組件-.測(cè)定發(fā)酵體系中溶氧的測(cè)量裝置；測(cè)定發(fā)酵體系中pH的測(cè)量裝置；測(cè)定發(fā)酵體系尾氣的測(cè)量裝置。圖l顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中厭氧發(fā)酵系統(tǒng)參數(shù)檢測(cè)與通氣控制示意圖。圖2顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中0RP自動(dòng)反饋調(diào)控控制邏輯圖。圖中，各參數(shù)含義如下VI:設(shè)定ORP下限值V2:設(shè)定ORP上限值Pl:流量的遞變系數(shù)P2:時(shí)間的遞變系數(shù)Q)2:混合氣中02的流量CN2:混合氣中N2的流量T:控制的間隔時(shí)間△Fmim流量的遞變下限△Fmax:流量的遞變上限△Tmin:時(shí)間的遞變下限△Tmax:時(shí)間的遞變上限△ORPn:第n次遞變后ORP實(shí)際值與設(shè)定值的差值圖3不同初始條件的0RP控制效果圖。圖4顯示了本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中不同0RP水平的自動(dòng)反饋控制效果圖。圖5顯示了在本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中在不同0RP水平下的菌體生長(zhǎng)情況。圖6顯示了不同0RP水平下甘油的分泌情況。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人通過(guò)廣泛而深入的研究，首次開(kāi)發(fā)了基于發(fā)酵系統(tǒng)中的實(shí)時(shí)ORP值，自動(dòng)調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的方法和設(shè)備，從而顯著提高了ORP控制精度，縮短了達(dá)到預(yù)定ORP值的時(shí)間；并且減少ORP值的波動(dòng)，有助于減少能耗，降低發(fā)酵成本，利于環(huán)境保護(hù)。參見(jiàn)圖l所示的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)參數(shù)檢測(cè)與通氣控制示意圖。圖中，空氣和氮?dú)饨?jīng)質(zhì)量流量計(jì)通入發(fā)酵罐中，流量和ORP的值經(jīng)過(guò)數(shù)模轉(zhuǎn)換后在控制主機(jī)上顯示，給定各參數(shù)初始值后，流量和ORP形成串級(jí)控制系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)了ORP的自動(dòng)反饋調(diào)控。作為含氧氣體，可以使用空氣或氧氣；作為不含氧的氣體，可以使用氮?dú)饣蚨栊詺怏w。當(dāng)然，廣義上，也可以使用氧氣含量高的氣體作為氧氣源，使用氧氣含量非常低的氣體作為不含氧的氣體。本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中0RP自動(dòng)反饋調(diào)控控制邏輯圖如圖2所示。其中各參數(shù)的含義如下V1:設(shè)定ORP下限值；V2:設(shè)定ORP上限值；P,:流量的遞變系數(shù)；P2:時(shí)間的遞變系數(shù)；C02:混合氣中02的流量;CN2:混合氣中N2的流量；T:控制的間隔時(shí)間；△Fmin:流量的遞變下限，△Fmax:流量的遞變上限；△Tmin:時(shí)間的遞變下限；△Tmax:時(shí)間的遞變上限；△0RP:第n次遞變后ORP實(shí)際值與設(shè)定值的差值。整個(gè)控制程序可有9個(gè)變量參數(shù)設(shè)定ORP下限值V,，設(shè)定0RP上限值V2，流量的遞變系數(shù)Pu時(shí)間的遞變系數(shù)P2，控制的間隔時(shí)間T，流量的遞變上下限AF,JAFraax，時(shí)間的遞變上下限AUAT一上述變量參數(shù)可根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，例如根據(jù)現(xiàn)有的手工控制方法設(shè)定間隔時(shí)間T等參數(shù)。由于采用自動(dòng)控制，因此設(shè)定的間隔時(shí)間T(自刷通常短于手工控制時(shí)的間隔時(shí)間T(手工)，例如T(自動(dòng))〈1/2T(手工)，更佳地T(自動(dòng))〈1/4T(手工)。另外，由于本發(fā)明方法能夠更精確地將ORP值控制在更狹小的范圍，因此由0RP上限值V2和0RP下限值V,所構(gòu)成的0RP值區(qū)間也小于手工控制時(shí)的預(yù)定0RP值區(qū)間，例如通常前者小于或等于后者的1/2，更佳地前者小于或等于后者的1/3。0RP下限值V1和0RP上限值V2通常設(shè)定為使得V2-Vl的差《50mV，較佳地V2-Vl的差《30mV，更佳地V2-Vl的差《20mV。流量的遞變系數(shù)P1通常設(shè)定為《0.05，較佳地《0.01，更佳地《0.005。時(shí)間的遞變系數(shù)P2通常設(shè)定為《0.03，較佳地《0.008，更佳地《0.004。控制的間隔時(shí)間T通常設(shè)定為T《5分鐘，較佳地，T《2分鐘；更佳地，T《l分鐘。流量的遞變下限AFmin通常設(shè)定為發(fā)酵體積的0.01。/?；蚋?每分鐘)，較佳地為發(fā)酵體積的O.02%或更低(每分鐘)。例如以2.5升發(fā)酵體系為例，AFmin可以是O.001L/min或更低。流量的遞變上限AFmax通常設(shè)定為小于或等于發(fā)酵體積的2(^(每分鐘)，更佳地為小于或等于發(fā)酵體積的10%(每分鐘)。例如，以2.5升發(fā)酵體系為例，AFmin可以是O.5L/min。時(shí)間的遞變下限ATtnin通常設(shè)定為5秒-l分鐘；時(shí)間的遞變上限ATmax通常設(shè)定為2分鐘-30分鐘。當(dāng)實(shí)際ORP值低于設(shè)定區(qū)間時(shí)，混合氣中氧的流量會(huì)自動(dòng)增加；當(dāng)實(shí)際ORP值高于設(shè)定區(qū)間時(shí)，混合氣中氧的流量會(huì)自動(dòng)下降。在本發(fā)明中，混合氣中氧的流量變化AF可以是固定的，也可以是變動(dòng)的。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，混合氣中氧的流量的遞變流量幅度AF是按比例變化的。換言之，當(dāng)給定初始遞變系數(shù)P,后，流量的遞變值和ORP實(shí)際值與設(shè)定值的差值(AORP)呈正比(例)關(guān)系，即ORP實(shí)際值偏離設(shè)定值越大，流量的遞變值就越大，反之越小。這樣，有利于更快速地達(dá)到預(yù)定的ORF值，也更有利于消除ORF值的波動(dòng)。在本發(fā)明中，控制的間隔時(shí)間T可以是固定的，也可以變動(dòng)的。因?yàn)槲⑸锓磻?yīng)系統(tǒng)的狀態(tài)變化是非常復(fù)雜的，ORP的變化要明顯滯后于控制信號(hào)的傳遞，因此，在本發(fā)明的自動(dòng)反饋控制系統(tǒng)的優(yōu)選例中，控制的間隔時(shí)間T也是按比例變化的。當(dāng)給定初始遞變系數(shù)P2后，間隔時(shí)間的遞變量與AORP的趨勢(shì)呈反比(例)關(guān)系，當(dāng)AORP變小時(shí)，遞變的間隔時(shí)間就變大；反之當(dāng)AORP變小時(shí)，遞變的間隔時(shí)間就變大。例如，控制的間隔時(shí)間T(也稱為遞變時(shí)間)和ORP實(shí)際值與設(shè)定值的差值(AORP)之間呈線性反比函數(shù)的關(guān)系。當(dāng)差值A(chǔ)ORP越小時(shí)，重新測(cè)定ORP值的時(shí)間間隔就越大；當(dāng)差值越大時(shí)，重新測(cè)定ORP值的時(shí)間間隔就越小。在本發(fā)明中，正比(例)關(guān)系可以是線性的正比關(guān)系，也可以是非線性的正比關(guān)系(例如二次曲線)。同樣，反比(例)關(guān)系可以是線性的反比關(guān)系，也可以是非線性的正比關(guān)系。整個(gè)控制系統(tǒng)過(guò)程中，流量和時(shí)間的實(shí)際量和遞變量都不宜超過(guò)設(shè)定的上下限。適用于本發(fā)明的方法的工程菌沒(méi)有特別限制，可以是各種常規(guī)的工程菌，包括市售的工程菌、可獲自保藏中心的工程菌、從自然界篩選獲得的菌種、以及用重組技術(shù)制備的工程菌。優(yōu)選的工程菌是需要在厭氧條件下生長(zhǎng)或發(fā)酵的菌種，例如釀酒酵母等。本發(fā)明還提供了一種調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的設(shè)備，它包括以下組件(a)探頭，所述探頭用于測(cè)定發(fā)酵體系的氧化還原電位ORP(即實(shí)際ORP值)；(b)位于探頭和中央權(quán)利要求之間并與其相連的模數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D轉(zhuǎn)換器)，所述的A/D轉(zhuǎn)換器用于轉(zhuǎn)換探頭測(cè)定的實(shí)際ORP值并將數(shù)據(jù)輸送給中央處理器；(c)中央處理器，所述的中央處理器將測(cè)定的實(shí)際ORP值與預(yù)定的ORP值或ORP值區(qū)間進(jìn)行比較，并據(jù)此產(chǎn)生調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)和調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(d)位于中央處理器和空氣流量控制器之間并與其相連的、并且位于中央處理器和氮?dú)饬髁靠刂破髦g并與其相連的數(shù)模轉(zhuǎn)換器(D/A轉(zhuǎn)換器)，所述的D/A轉(zhuǎn)換器用于轉(zhuǎn)換中央處理器產(chǎn)生的第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)并將其分別輸送給空氣流量控制器和氮?dú)饬髁靠刂破鳎?e)空氣流量控制器，用于調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的空氣流量；(f)氮?dú)饬髁靠刂破?，用于調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的氮?dú)饬髁?。其中，各組件可通過(guò)市售方式獲得。例如，常用的ORP探頭是ORP鉑電極，中央處理器是電腦。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)例中，在以釀酒酵母厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的ORP自動(dòng)反饋控制過(guò)程中，2.5升發(fā)酵罐，T的初始值約為60s，Pt為0.005，Pz為0.001-0.003，初始C。"0.1L/分鐘，初始"2:1.9L/分鐘，AFmi:0.001L/min;△Fmax:0.51,/min;ATmi:5s;15分鐘。在啟動(dòng)ORP自動(dòng)反饋調(diào)控程序后的1小時(shí)內(nèi)，即可達(dá)到預(yù)定的ORP值區(qū)間，并且可以很方便地將ORP維持在相對(duì)穩(wěn)定的值。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于-(a)通過(guò)基于ORP的自動(dòng)反饋系統(tǒng)，成功地實(shí)現(xiàn)了ORP的自動(dòng)控制，減少了人工控制成本。(b)提高了ORP控制精度，縮短了達(dá)到預(yù)定ORP值的時(shí)間。(c)實(shí)時(shí)根據(jù)ORP值改變調(diào)試參數(shù)，從而更快速有效地調(diào)控ORP值，并減少ORP值的波動(dòng)。(d)為厭氧發(fā)酵代謝調(diào)控提供了有用的工具，便于將發(fā)酵控制在最適合產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物(如乙醇)的條件，從而減少能耗，降低發(fā)酵成本，有助于環(huán)境保護(hù)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例l1.1菌種活化從菌種保藏斜面挑取一環(huán)釀酒酵母(5^cc/ar咖yc"cere^w'ae)乙醇工程菌B1(購(gòu)自華東理工大學(xué))，用無(wú)菌水稀釋至不同梯度，將不同梯度的菌液分別涂布接入YPD固體培養(yǎng)基進(jìn)行活化，在3(TC培養(yǎng)100h后獲得單菌落。1.2種子培養(yǎng)一級(jí)種子制備從稀釋純化得到的單菌落平板上挑取一個(gè)單菌落，接入150ml搖瓶培養(yǎng)，裝種子培養(yǎng)基液量為30ml，在30。C、220rpm下培養(yǎng)大約12小時(shí)，作為一級(jí)種子；二級(jí)種子制備將30ml的一級(jí)種子全部倒入250ml裝液量為120ml的種子培養(yǎng)基搖瓶中，在3(TC、220rpm下培養(yǎng)大約12小時(shí)，得到二級(jí)種子，菌濃約為lX107個(gè)/ml。1.3好氧培養(yǎng)菌體生長(zhǎng)過(guò)程將ORP電極、pH電極、D0電極及溫度控制電極插入2.5L發(fā)酵罐中，裝液量為1.5L的發(fā)酵培養(yǎng)基，在121'C下滅菌15分鐘。接種量為IOI好氧培養(yǎng)條件，30°C，500rpm，空氣流量為3.OL/min，用工業(yè)氨水控制pH為5.0，好氧過(guò)程約控制在4一5h，此時(shí)菌濃約為lXl()S個(gè)/ml。0RP的范圍為50mV—100mV之間。實(shí)施例2ORP自動(dòng)反饋調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程采用圖l所示的設(shè)備。當(dāng)菌體生長(zhǎng)的好氧培養(yǎng)結(jié)束后(自最初發(fā)酵起約5小時(shí)后)，啟動(dòng)ORP自動(dòng)反饋系統(tǒng)，并維持總流量為2.OL/min不變。試驗(yàn)中，設(shè)定的ORP在-150mV土10mV,Pl、P2和T如表1所示，a、b、c表示了三種不同的初始值。其中，對(duì)照試驗(yàn)為當(dāng)菌體生長(zhǎng)的好氧培養(yǎng)結(jié)束后(自最初發(fā)酵起約5小時(shí)后)立即將空氣管路關(guān)閉，同時(shí)開(kāi)啟氮?dú)猓髁繛?.0L/min保持不變。結(jié)果當(dāng)設(shè)定ORP為-150mV時(shí)，不同初始條件的0RP控制效果見(jiàn)圖3和表1。表l三種不同的初始條件(a、b、c)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注l:自厭氧發(fā)酵起計(jì)時(shí)(即自開(kāi)啟ORP自動(dòng)反饋系統(tǒng)起計(jì)時(shí))。由圖3可知，不同的初始設(shè)定值會(huì)影響ORP的控制效果。初始條件a的控制效果最好。如果流量和時(shí)間的遞變系數(shù)過(guò)小(b)，則發(fā)酵液的ORP到達(dá)設(shè)定值的時(shí)間要長(zhǎng)。如果遞變系數(shù)過(guò)大(c)，則控制的精度會(huì)降低。因此，當(dāng)T為60s時(shí)，優(yōu)選的Pl為O.005±0.002,而P2為0.003±0.001。實(shí)施例3基于ORP值手工調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程(對(duì)比例)重復(fù)實(shí)施例2，不同點(diǎn)在于當(dāng)菌體生長(zhǎng)的好氧培養(yǎng)結(jié)束后(自最初發(fā)酵起約5小時(shí)后)，根據(jù)ORP值手工調(diào)控空氣和氮?dú)獾牧髁?，并且間隔時(shí)間為5分鐘。結(jié)果，從厭氧發(fā)酵起計(jì)，達(dá)到設(shè)定的0RP需要8小時(shí)以上。實(shí)施例4不同水平的ORP對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響在本實(shí)施例中，采用與實(shí)施例1和2相同的試驗(yàn)方法，不同點(diǎn)在于通過(guò)ORP自動(dòng)反饋調(diào)控系統(tǒng)，研究預(yù)定ORP值在-50mV、-150mV、-200mV不同水平以及完全不通氣培養(yǎng)(control)的條件對(duì)乙醇發(fā)酵過(guò)程的影響。另外，初始C。"0.1L/分鐘，初始Cn2:1.9L/分鐘，AF"0.001L/min;△FMX:0.5L/min;AT^:5s;AT幽15分鐘。控制結(jié)果如圖4所示。可以看出，利用ORP自動(dòng)反饋控制系統(tǒng)能很好的將ORP控制在設(shè)定值。其波動(dòng)范圍可控制在土5mV。_表2控制氧化還原電位時(shí)的發(fā)酵罐操作條件_預(yù)定的0RP值攪拌速率空氣速率達(dá)到預(yù)定ORP所PIP2T(mV)(r/min)(L/min)需的時(shí)間(h)_(s)-505000.30.510.0050.00360-1505000.10.410.0050.00360-20050000.22.50.0080.00360不同0RP水平下的菌體生長(zhǎng)情況如圖5所示。ORP越低，厭氧程度越深，菌體生長(zhǎng)越緩慢，生物量相應(yīng)也越低。甘油是乙醇發(fā)酵過(guò)程中最主要的副產(chǎn)物，甘油的生成主要起兩個(gè)作用，一是釀酒酵母抵御外界高滲透壓的手段，二是維持胞內(nèi)的氧化還原平衡。在厭氧條件下，胞內(nèi)的NADH是通過(guò)甘油途徑被氧化，從而使胞內(nèi)的氧化還原達(dá)到新的平衡。三種預(yù)定0RP值下的甘油產(chǎn)生情況如圖6所示。結(jié)果表明，0RP值越低，甘油分泌的量越多。三種預(yù)定0RP值下的糖醇轉(zhuǎn)換率如表3所示。表3不同ORP水平下的糖醇轉(zhuǎn)換率<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>從表3中可以看出，當(dāng)0RP為-150mV時(shí)糖醇轉(zhuǎn)化率最高，為O.4388g乙醇/g葡萄糖(或43.88°/。)。比-50mV時(shí)高出10.5%，比不通氣時(shí)高出27.8%。這說(shuō)明了釀酒酵母工程菌Bl在厭氧發(fā)酵的過(guò)程中的最適氧化還原電位為-150mV。通過(guò)ORP自動(dòng)反饋調(diào)控系統(tǒng)可以很好的將發(fā)酵液的ORP值控制在設(shè)定值。通過(guò)提高糖醇轉(zhuǎn)化率，可以減少能耗，降低發(fā)酵成本，有助于環(huán)境保護(hù)。討論通過(guò)上述實(shí)施例可以看出，通過(guò)ORP自動(dòng)反饋調(diào)控程序控制ORP在-50mV、-150mV、-200mV不同水平，在三種水平下0RP自動(dòng)反饋調(diào)控的精度都在土5mV內(nèi)，能完全滿足控制要求(圖2)。從不同ORP水平的乙醇代謝情況看，ORP為-150mV時(shí)糖醇轉(zhuǎn)化率最高，比-50mV時(shí)高出10.5°/。，比不通氣時(shí)高出27.8%。這說(shuō)明控制0RP在-150mV能提高乙醇的產(chǎn)率。當(dāng)然，根據(jù)所使用的工程菌不同，其最佳ORP值也有所不同。通過(guò)本發(fā)明的ORP自動(dòng)反饋調(diào)控系統(tǒng)能很好的將ORP控制在設(shè)定值。相比現(xiàn)有的人工控制，本發(fā)明的自動(dòng)反饋調(diào)控系統(tǒng)減少了人工控制成本，提高了控制精度，并為厭氧發(fā)酵代謝調(diào)控提供了有用的工具。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種自動(dòng)調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的方法，其特征在于，包括步驟(a)測(cè)定發(fā)酵體系的氧化還原電位ORP，記為實(shí)際ORP值；(b)將測(cè)定的實(shí)際ORP值數(shù)據(jù)輸送給中央處理器；(c)中央處理器將測(cè)定的實(shí)際ORP值與預(yù)定的ORP值或ORP值區(qū)間進(jìn)行比較，并據(jù)此產(chǎn)生調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)和調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(d)將所述調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)輸送給控制空氣流量的第一控制器，所述的第一控制器基于該第一控制信號(hào)調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的空氣流量；并且將所述調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)輸送給控制氮?dú)饬髁康牡诙刂破?，所述的第二控制器基于該第二控制信?hào)調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的氮?dú)饬髁浚?e)讓發(fā)酵體系在所述的空氣流量和氮?dú)饬髁肯掳l(fā)酵一段時(shí)間Tn，其中n表示循環(huán)次數(shù)；和(f)在所述的厭氧發(fā)酵過(guò)程中，重復(fù)步驟(a)至(e)。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，按以下方式產(chǎn)生控制信號(hào)-(i)若實(shí)際ORP值處于預(yù)定ORP值區(qū)間內(nèi)，則產(chǎn)生用于維持當(dāng)前空氣流量的、調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)，并且產(chǎn)生用于維持當(dāng)前氮?dú)饬髁康摹⒄{(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(ii)若實(shí)際ORP值小于預(yù)定ORP值區(qū)間的下限，則產(chǎn)生用于增加當(dāng)前空氣流量的、調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)，并且產(chǎn)生用于減少當(dāng)前氮?dú)饬髁康摹⒄{(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(iii)若實(shí)際ORP值大于預(yù)定ORP值區(qū)間的上限，則產(chǎn)生用于減少當(dāng)前空氣流量的、調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)，并且產(chǎn)生用于增加當(dāng)前氮?dú)饬髁康?、調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，若實(shí)際0RP值小于預(yù)定0RP值區(qū)間的下限，則第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)所導(dǎo)致的流量遞變值A(chǔ)F的絕對(duì)值滿足以下條件(l)流量遞變值A(chǔ)F位于預(yù)定的流量遞變值區(qū)間下限AFmin和上限AFmax之間；(2)流量遞變值△F與預(yù)定ORP值區(qū)間下限與實(shí)際ORP值的差值△0RP成正比關(guān)系；和/或若實(shí)際ORP值大于預(yù)定ORP值區(qū)間的上限，則第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)所導(dǎo)致的流量遞變值A(chǔ)F的絕對(duì)值滿足以下條件(1)流量遞變值A(chǔ)F位于預(yù)定的流量遞變值區(qū)間下限AFmin和上限AFtnax之間；(2)流量遞變值A(chǔ)F與實(shí)際ORP值與預(yù)定ORP值區(qū)間上限的差值A(chǔ)ORP成正比關(guān)系。4.如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(e)中，所述的一段時(shí)間Tn滿足以下條件Tn《5分鐘。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，當(dāng)n》2時(shí)，若實(shí)際ORP值處于預(yù)定ORP值區(qū)間內(nèi)，則維持所述的一段時(shí)間Tn，即Tn二Tn-l;并且若實(shí)際ORP值小于預(yù)定ORP值區(qū)間的下限，則所述的一段時(shí)間Tn與上一循環(huán)中的間隔時(shí)間Tn-l的差值A(chǔ)T的絕對(duì)值與預(yù)定ORP值區(qū)間下限與實(shí)際ORP值的差值A(chǔ)ORP成反比關(guān)系；并且若實(shí)際ORP值大于預(yù)定ORP值區(qū)間的上限，則所述的一段時(shí)間Tn與上一循環(huán)中的間隔時(shí)間Tn-l的差值A(chǔ)T的絕對(duì)值與實(shí)際ORP值與預(yù)定ORP值區(qū)間上限的差值A(chǔ)ORP成反比關(guān)系。6.—種厭氧發(fā)酵方法，其特征在于，包括步驟在發(fā)酵過(guò)程中，用權(quán)利要求l所述的方法控制發(fā)酵體系的氧化還原電位。7.—種乙醇發(fā)酵方法，其特征在于，包括步驟在生產(chǎn)乙醇的工程菌的發(fā)酵過(guò)程中，用權(quán)利要求l所述的方法控制發(fā)酵體系的氧化還原電位處于預(yù)定0RP值區(qū)間；以及從發(fā)酵體系中分離出所產(chǎn)生的乙醇。8.—種調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的設(shè)備，其特征在于，它包括以下組件(a)探頭，所述探頭用于測(cè)定發(fā)酵體系的氧化還原電位ORP，即實(shí)際0RP值；(b)位于探頭和中央權(quán)利要求之間并與其相連的模數(shù)轉(zhuǎn)換器(A/D轉(zhuǎn)換器)，所述的A/D轉(zhuǎn)換器用于轉(zhuǎn)換探頭測(cè)定的實(shí)際ORP值并將數(shù)據(jù)輸送給中央處理器；(c)中央處理器，所述的中央處理器將測(cè)定的實(shí)際ORP值與預(yù)定的ORP值或ORP值區(qū)間進(jìn)行比較，并據(jù)此產(chǎn)生調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)和調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(d)位于中央處理器和空氣流量控制器之間并與其相連的、并且位于中央處理器和氮?dú)饬髁靠刂破髦g并與其相連的數(shù)模轉(zhuǎn)換器(D/A轉(zhuǎn)換器)，所述的D/A轉(zhuǎn)換器用于轉(zhuǎn)換中央處理器產(chǎn)生的第一控制信號(hào)和第二控制信號(hào)并將其分別輸送給空氣流量控制器和氮?dú)饬髁靠刂破鳎?e)空氣流量控制器，用于調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的空氣流量；(f)氮?dú)饬髁靠刂破?，用于調(diào)節(jié)輸送到發(fā)酵系統(tǒng)中的氮?dú)饬髁俊?.如權(quán)利要求8所述的設(shè)備，其特征在于，還包括發(fā)酵罐，所述的發(fā)酵罐具有攪拌裝置。10.如權(quán)利要求8所述的設(shè)備，其特征在于，還包括以下一個(gè)或多個(gè)組件測(cè)定發(fā)酵體系中溶氧的測(cè)量裝置；測(cè)定發(fā)酵體系中pH的測(cè)量裝置；測(cè)定發(fā)酵體系尾氣的測(cè)量裝置。全文摘要本發(fā)明涉及一種基于氧化還原電位自動(dòng)反饋調(diào)控厭氧發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法。更具體地涉及自動(dòng)調(diào)控厭氧發(fā)酵過(guò)程中氧化還原電位的方法和設(shè)備。所述方法包括(a)測(cè)定發(fā)酵體系的氧化還原電位ORP；(b)將ORP值數(shù)據(jù)輸送給中央處理器；(c)中央處理器將實(shí)際ORP值與預(yù)定ORP值進(jìn)行比較，產(chǎn)生調(diào)節(jié)空氣流量的第一控制信號(hào)和調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁康牡诙刂菩盘?hào)；(d)將第一控制信號(hào)輸送給控制空氣流量的第一控制器以調(diào)節(jié)空氣流量；和將第二控制信號(hào)輸送給控制氮?dú)饬髁康牡诙刂破饕哉{(diào)節(jié)氮?dú)饬髁浚?e)讓發(fā)酵體系發(fā)酵一段時(shí)間；和(f)重復(fù)步驟(a)至(e)。本發(fā)明顯著提高了ORP控制精度，縮短了達(dá)到預(yù)定ORP值的時(shí)間；并且有助于減少能耗，降低發(fā)酵成本。文檔編號(hào)C12R1/865GK101358210SQ20081020050公開(kāi)日2009年2月4日申請(qǐng)日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日發(fā)明者炬儲(chǔ),莊英萍,張嗣良,杭海峰,強(qiáng)王,王永紅,超鄭申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)