專(zhuān)利名稱(chēng)：一種兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因檢測(cè)產(chǎn)品，具體的說(shuō)，涉及一種有關(guān)兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)的試 劑盒。
背景技術(shù)：
先天性耳聾是指因父母的遺傳因素或母親在妊娠過(guò)程、分娩過(guò)程中的異常造成的耳聾。 分為傳導(dǎo)性、感音神經(jīng)性和混合性三類(lèi)，并大多為感音神經(jīng)性耳聾。有時(shí)還可以伴有其它部 位畸形，如眼、牙齒、毛發(fā)、頸部、四肢等畸形。由于先天性耳聾分為遺傳性耳聾和非遺傳 性耳聾；并且又分為傳導(dǎo)性、感音神經(jīng)性和混合性三類(lèi)。因此只有早日將其確診并區(qū)別開(kāi)來(lái)， 才能獲得更好更有效的治療效果。
先天性耳聾現(xiàn)有的治療方法是無(wú)論年齡大小， 一旦發(fā)現(xiàn)則需要馬上治療。以現(xiàn)在醫(yī)療水 平，越早發(fā)現(xiàn)先天性耳聾，越有好的治療效果。
因此，人們希望有一種簡(jiǎn)便而客觀的方法可以進(jìn)行兒童先天性耳聾基因檢測(cè)，做到早發(fā) 現(xiàn)、早診斷，提早采取預(yù)防和治療措施。

發(fā)明內(nèi)容
為了可以簡(jiǎn)便而客觀地對(duì)兒童先天性耳聾進(jìn)行測(cè)試，本發(fā)明提供一種兒童先天性耳聾基
因分析檢測(cè)試劑盒，可以以?xún)和疍NA樣本為測(cè)試樣本，對(duì)兒童先天性耳聾的基因進(jìn)行檢測(cè)，
從而簡(jiǎn)便快捷地測(cè)試其先天性耳聾。
該試劑盒由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照品組成。
使用時(shí)以被測(cè)兒童的DNA樣本為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)過(guò)樣本DNA抽提后，使用試劑盒在熒光定量PCR
儀上進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)合反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行診斷。
上述的預(yù)混PCR反應(yīng)液含有SYBR green I，以及擴(kuò)增與兒童先天性耳聾GJB2基因相關(guān)
突變的引物；擴(kuò)增GJB2基因上第235位缺失型的引物序列如下
上游引物FlDel: 5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-3 20bp， 上游引物F1CI: 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-3 19bp， 下游引物R1: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-3 22bp; 擴(kuò)增GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物序列如下 上游引物F2I: 5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-3 19bp， 下游引物R2I: 5-ACGTGCATGGCCACTAGGAG-3 20bp， 上游引物F2Del: 5陽(yáng)CTGCAAAGGAGGTGTGGGG-3 19bp， 下游引物R2Deh 5-GGGGAAGTAGTGATCGTAGCTGG-3 23bp。
上述的兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照品有2個(gè)， 分別包含如下的序列SEQ1:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CCATAGCCGG
TGCAGCCTGG
CACACCTCCT
SEQ2:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CATAGCCGGA
GTGTTGCAGA
CCTTTGCAG。
GATGAACTTC CTAGGAGCGC ATGTGGGAGA CTGCAGGGTG TTGCAG;
CTCTTCTTCT TGGCGTGGAC TGGGGAAGTA TTGCAGACAA
CATGTCTCCG ACGAAGATCA GTGATCGTAG AGTCGGCCTG
GTAGGCCACG GCTGCAGGGC CACACGTTCT CTCATCTCCC
GTAGGCCACG GTTGCAGGCC TGGCTGCAGG CCCCACACCT
GATGAACTTC CTAGGAGCGC TGTGGGAGAT
CTCTTCTTCT
TGGCGTGGAC
GGGGAAGTAG
CATGTCTCCG
ACGAAGATCA
TGATCGTAGC
CAAAGTCGGC
CTGCTCATCT
上述的兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陰性對(duì)照品包含的序 列為
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
本發(fā)明的使用可在兒童的任何年齡階段進(jìn)行，以做到早發(fā)現(xiàn)，早治療；只需取其DNA樣 本，比如口腔樣本，操作簡(jiǎn)便。能為兒童先天性耳聾的臨床診斷提供有價(jià)值的參考信息，提 早采取預(yù)防和治療措施，有利于使兒童患者得到更好的治療效果。


圖1，圖2，圖3,圖4，圖5，圖6為熒光定量PCR儀上的擴(kuò)增曲線圖。各圖上方的Delta RnvsCycle，是指ARn隨循環(huán)變化的對(duì)數(shù)擴(kuò)增圖譜；ARn(DeltaRn)是指在給定的一組PCR 條件下所生成熒光信號(hào)的對(duì)數(shù)值。該圖的橫坐標(biāo)表示循環(huán)數(shù)(CycleNumber),縱坐標(biāo)表示熒 光值(DdtaRn)。橫線表示熒光域值，曲線與熒光域值線的交叉點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)即為Ct值。
圖l、圖2、圖3中橫線3表示熒光域值；曲線1表示為擴(kuò)增GJB2基因上第235位缺失 型的引物對(duì)FlDel +R1，擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線；曲線2為擴(kuò)增GJB2基因上第235位 缺失型的引物對(duì)F1CI +R1，這對(duì)引物擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線。
圖1表示GJB2基因上第235位沒(méi)有缺失的野生純合型樣本產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線1與 熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為Cl，曲線2與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C2。
圖2表示GJB2基因上第235位缺失的突變純合型樣本產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線2與熒光 域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C3，曲線1與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到 域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C4。
圖3表示GJB2基因上第235位缺失型的雜合型樣本產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線1與熒光域 值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C5，曲線2與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域 值的Ct循環(huán)數(shù)值為C6。
圖4、圖5、圖6中橫線4表示熒光域值；曲線5表示為擴(kuò)增GJB2基因上16位缺失型 的引物對(duì)F2Del + R2Del，擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線；曲線6表示為擴(kuò)增GJB2基因上沒(méi)有 16位缺失的引物對(duì)F21 +R2I,這對(duì)引物擴(kuò)增樣本所生成的擴(kuò)增曲線。
圖4表示GJB2基因上16位缺失純合型產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線5與熒光域值線的交叉點(diǎn) 表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C7，曲線6與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù) 值為C8。
圖5表示GJB2基因上16位缺失雜合型產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線5與熒光域值線的交叉點(diǎn) 表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為C9，曲線6與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù) 值為CIO。
圖6表示GJB2基因上沒(méi)有16位缺失純合型產(chǎn)物擴(kuò)增曲線圖曲線6與熒光域值線的交 叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct循環(huán)數(shù)值為Cll，曲線5與熒光域值線的交叉點(diǎn)表示達(dá)到域值的Ct 循環(huán)數(shù)值為C12。
具體實(shí)施例
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
應(yīng)當(dāng)理解，下面實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采 用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，或按照制造廠商所建 議的步驟和條件。
實(shí)施例l:
試劑盒的制備。包括(1)探針的準(zhǔn)備；(2) DNA抽提試劑；(3)預(yù)混反應(yīng)液；(4)標(biāo)準(zhǔn) 陽(yáng)性對(duì)照；(5)標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照。 (1)探針的準(zhǔn)備；
由通常的核苷酸引物合成儀合成，與兒童先天性耳聾GJB2基因相關(guān)突變的引物。 擴(kuò)增GJB2基因上第235位缺失型的引物序列如下-上游引物FlDel: 5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-3 20bp, 上游引物F1CI: 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-3 19bp， 下游引物R1: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-3 22bp;擴(kuò)增GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物序列如下
上游引物F2I: 5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-3 〗9bp，
下游引物R2I: 5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-3 20bp，
上游引物F2Deh 5-CTGCAAAGGAGGTGTGGGG-3 19bp，
下游弓I物R2Del: 5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG-3 23bp 。 下游引物RI: 5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-3 20bp
上游引物FDel: 5-CTGCAAAGGAGGTGTGGGG-3 19bp
下游引物RDel: 5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG-3 23bp
使用前按每OD引物稀釋為100pmol/L (即lOOpmol/pl)濃度的加水量，開(kāi)啟瓶蓋溶解 之前最好在3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心l分鐘，防止開(kāi)蓋時(shí)引物散失。使用前，將濃溶 液稀釋成工作液10pmol/ml后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
(2)DNA抽提試齊U:
試劑名稱(chēng) 成分 體積濃度
緩沖液GASDS 100 ml0.5 mmol/L
緩沖液GBNAOH 100 ml50 mmol/L
緩沖液GD碳酸鈉-丙酮 100 ml1 mmol/L
緩沖液GW無(wú)水乙醇 100 ml原液
洗脫液 Tris鹽 50 ml10 mmol/L
(3)預(yù)混PCR反應(yīng)液
預(yù)混反應(yīng)液包括4種，每種內(nèi)含一對(duì)上下游擴(kuò)增引物，各對(duì)應(yīng)一個(gè)基因型。按lml配比量計(jì)算，共同的成分配制為100 的dNTP ， 20 pi; 500 U4tlTaq DNA Polymerase20^1; 2 X Quant One Step SYBR 1300 ^1; 10 的上游引物50pl;10 的下游引物50^1;
RNase-free ddH20 860 pl。
管l的l對(duì)引物為
上游引物FlDel: 5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-320bp
下游引物Rl: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-322bp
管2的1對(duì)引物為
上游引物FICI: 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-319bp
下游引物Rl: 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-322bp
管3的1對(duì)引物為
上游引物F2I: 5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-319bp
下游引物R2I: 5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-320bp
管4的1對(duì)引物為
上游引物F2Del: 5-CTG CAA AGG AGG TGT GGG G-319bp
6下游引物R2Del: 5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG陽(yáng)3 23bp
(4)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有GJB2基因中含突變核苷酸片段構(gòu)成的Pucl8-T重組質(zhì)粒，該重組 質(zhì)料轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè) A260定量并稀釋到109Copy/pl， -20°〇保存。貯存存為109Copy4U，使用濃度為105Copy/pl。
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板提供2種，每種濃度為105Copy4U。序列如下
SEQ1:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CCATAGCCGG
TGCAGCCTGG
CACACCTCCT
SEQ2:
TCTCCCCCTT
TGCATGGCCA
CATAGCCGGA
GTGTTGCAGA
GTGCGGGAAA
GATGAACTTC
CTAGGAGCGC
ATGTGGGAGA
CTGCAGGGTG
TTGCAG，
GATGAACTTC
CTAGGAGCGC
TGTGGGAGAT
CAAAGTCGGC
GAGCAGTGGT
CTCTTCTTCT TGGCGTGGAC TGGGGAAGTA TTGCAGACAA
CTCTTCTTCT
TGGCGTGGAC
GGGGAAGTAG
CTGCTCATCT
GGCCACAAAA
CATGTCTCCG ACGAAGATCA GTGATCGTAG AGTCGGCCTG
GTAGGCCACG GCTGCAGGGC CACACGTTCT CTCATCTCCC
CATGTCTCCG ACGAAGATCA TGATCGTAGC CCCCACACCT CAAGAGAAGA
GTAGGCCACG GTTGCAGGCC TGGCTGCAGG CCTTTGCAGAT。
(5)標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照
標(biāo)準(zhǔn)陰性模板是含有擬南芥基因片斷180個(gè)核苷酸構(gòu)成的Pucl8-T重組質(zhì)粒。該重組質(zhì) 料轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ot增殖后用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè) A260定量并稀釋到109Copy/Vl， -20。C保存。貯存存為109Copy l，使用濃度為105Copy/pl。 序列如下
SEQ3:
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT
GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC
TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT
GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
實(shí)施例2:試劑盒的使用 (1)樣本的制備
取樣方式使用棉簽在面頰內(nèi)擦拭IO次。
注意為了保證樣本不被食物或者飲料污染，取樣前30分鐘內(nèi)請(qǐng)勿進(jìn)食和飲水。
a)處理材料將在面頰內(nèi)擦拭過(guò)的棉簽轉(zhuǎn)置于2ml離心管中，用剪刀將棉簽部分從其桿
7上剪下，加入400pl緩沖液GA。
b) 加入20pl蛋白酶K溶液，渦旋IO秒混勻，56'C放置60分鐘，其間每15分鐘渦旋 混勻數(shù)次。
c) 加入400 ^1緩沖液GB,充分顛倒混勻，70'C放置10分鐘，此時(shí)溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短 離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。
d) 加200 pl無(wú)水乙醇，充分顛倒混勻，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。
e) 將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)， 12,000 rpm( 13,400xg)離心30秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。
f) 向吸附柱CR中加入500 ^1緩沖液GD, 12,000 rpm( 13,400xg)離心30秒，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管中。
g) 向吸附柱CR中加入700(al漂洗液PW， 12,000 rpm( 13,400xg)離心30秒，倒掉收集 管中的廢液，將吸附柱CR放回收集管。
h) 向吸附柱CR中加入500 pl漂洗液PW， 12,000 rpm( 13,400xg)離心30秒，倒掉收集 管中的廢液。
i) 將吸附柱CR放回收集管中，12,000 ipm ( 13,400xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附 柱CR室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗。
j)將吸附柱CR轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50 ^tl洗脫緩沖 液TB，室溫放置2-5分鐘，12,000 rpm( 13,400xg)離心2分鐘。重復(fù)一次。
(2) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程
a) 按樣品數(shù)n (樣品數(shù)=待測(cè)樣本數(shù)+陰性對(duì)照1個(gè)+陽(yáng)性對(duì)照1個(gè))取預(yù)混PCR反應(yīng)液 每管23 pl分裝于反應(yīng)管中。
b) 將上述處理好的待測(cè)樣本和陰性、陽(yáng)性對(duì)照(務(wù)必振蕩混勻數(shù)秒)各取2ul分別加入 反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
c) PCR條件 95 。C 10 sec
(95°C 15 sec, 60°C 60 sec)X40個(gè)循環(huán)
(3) 結(jié)果分析與判斷
a)定量檢測(cè)SNP的判斷標(biāo)準(zhǔn)
兩曲線的Ct值之差的絕對(duì)值記為IACtl，當(dāng)IACtl《1，判斷為雜合型；當(dāng)IACtl》5 ，判斷
為純合型。
如圖，圖l中IACtl》5，表示該樣本為GJB2-5-DD純合型樣本。圖2中，|ACt|》5，表 示該樣本為GJB2-5-II純合型樣本。圖3中，|ACtl《l，表示該樣本為GJB2-5-ID雜合型樣本。 圖4中IACtl^5，表示該樣本為GJB2-16-DD純合型樣本。圖5中，|ACt|《l，表示該樣本為 GJB2-16-ID雜合型樣本。圖6中，|ACt|>5，表示該樣本為GJB2-16-II純合型樣本。b)結(jié)果分析
基因型 診斷結(jié)果
GJB2 (235缺失)+ GJB2 (16
^卩^ + 、 基因檢測(cè)結(jié)果顯示發(fā)生兒童先天性耳聾的機(jī)率比較大。 堿基缺失)
GJB2 (235未缺失)+GJB2 (16
rf#+=+、 基因檢測(cè)結(jié)果顯示發(fā)生兒童先天性耳聾的機(jī)率比較小。 堿基未缺失)
GJB2 (235缺失型+ 16堿基缺基因檢測(cè)結(jié)果顯示可能發(fā)生兒童先天性耳聾，需要結(jié)
失型)的其他組合 合其他的檢查手段。序列表
<110>上海裕隆生物科技有限公司 <120>—種兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒 <160> 10
<210> 1 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223〉根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上第235位缺失型的DNA引物，命名為上游引物FlDel。 <400> 1
ccacatccgg ctatgggtct 20
<210>2 <211〉 19 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上第235位缺失型的DNA引物，命名為上游引物F1CI。 <400〉 2
cacatccggc tatgggtcc 19
<210〉 3 <211>22 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上第235位缺失型的DNA引物，命名為下游引物Rl。 <400> 3
tctccccctt gatgaacttc ct 22
<210>4 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物，命名為上游引物F2I。 <400> 4
gccaggctgc aagaacgtg 19
10<210> 5 <211>20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220>
<223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物，命名為下游引物R21。 <400〉 5
acgtgcatgg ccactaggag 20
<210>6 <211> 19 <212>DNA <213>人工序列 <220>
<223〉根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物，命名為上游引物F2Del。 <400〉 6
ctgcaaagga ggtgtgggg 19
<210>7 <211>23 <212>DNA <213〉人工序列 <220>
<223>根據(jù)核酸堿基配對(duì)原理和基因芯片雜交條件設(shè)計(jì)，以用作兒童先天性耳聾基因分析檢 測(cè)試劑盒中檢測(cè)GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物，命名為下游引物R2Dd。 <400> 7
ggggaagtag tgatcgtegc tgg 23
<210〉 8
<211>216
<212>DNA
<213〉人屬(Homo)
<400> 8
tctccccctt gatgaacttc ctcttcttct catgtctccg gtaggccacg tgcatggcca 60 ctaggagcgc tggcgtggac acgaagatca gctgcagggc ccatagccgg atgtgggaga 120 tggggaagta gtgatcgtag cacacgttct tgcagcctgg ctgcagggtg ttgcag織a 180
agtcggcctg ctcatctccc cacacctcct ttgcag 216
<210〉9
<211〉 199
<212> DNA
<213>人屬(Homo)
<400> 9
11tctccccctt gatgaacttc ctcttcttct catgtctccg gtaggccacg tgcatggcca 60
ctaggagcgc tggcgtggac acgaagatca gttgcaggcc catagccgga tgtgggagat 120
ggggaagtag tgatcgtagc tggctgcagg gtgttgcaga caaagtcggc ctgctcatct 180
ccccacacct cctttgcag 199
<210> 10 <211〉 180 <212> DNA
<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana) <400> 10
ttcgttattg aatcttgttt tggttctctt gtgtggaatg cattgttctt gcttctctgg 60 aacttgggat atgatgacaa aaatacgata tctctaaggc taattgctgt gcggatgaaa 120 tatatttgca cgtcagtctg atcccattat gtatataaca ttaggagttg gtgcatgctc 180
1權(quán)利要求
1.一種兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照品組成；所述的預(yù)混PCR反應(yīng)液含有SYBR green I，以及擴(kuò)增與兒童先天性耳聾GJB2基因相關(guān)突變的引物；擴(kuò)增GJB2基因上第235位缺失型的引物序列如下上游引物F1Del5-C CAC ATC CGG CTA TGG GTC T-3 20bp，上游引物F1CI 5-CAC ATC CGG CTA TGG GTC C-3 19bp，下游引物R1 5-TCT CCC CCT TGA TGA ACT TCC T-3 22bp；擴(kuò)增GJB2基因上16個(gè)堿基缺失型的引物序列如下上游引物F2I5-GCC AGG CTG CAA GAA CGT G-3 19bp，下游引物R2I5-ACG TGC ATG GCC ACT AGG AG-320bp，上游引物F2Del5-CTG CAA AGG AGG TGT GGG G-3 19bp，下游引物R2Del5-GGG GAA GTA GTG ATC GTA GCT GG-3 23bp。
2.如權(quán)利要求1所述的兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性對(duì)照品有2個(gè)，分別包含如下的序列 SEQ1:TCTCCCCCTT GATGAACTTC CTCTTCTTCT CATGTCTCCG GTAGGCCACG TGCATGGCCA CTAGGAGCGC TGGCGTGGAC ACGAAGATCA GCTGCAGGGC CCATAGCCGG ATGTGGGAGA TGGGGAAGTA GTGATCGTAG CACACGTTCT TGCAGCCTGG CTGCAGGGTGSEQ2:TCTCCCCCTT GATGAACTTC CTCTTCTTCT CATGTCTCCG GTAGGCCACG TGCATGGCCA CTAGGAGCGC TGGCGTGGAC ACGAAGATCA GTTGCAGGCC CATAGCCGGA TGTGGGAGAT GGGGAAGTAG TGATCGTAGC TGGCTGCAGG GTGTTGCAGA CAAAGTCGGC CTGCTCATCT CCCCACACCT CCTTTGCAG。
3.如權(quán)利要求1或2所述的兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于 所述的陰性對(duì)照品包含的序列為SEQ3 : TTCGTTATTGAATCTTGTTTTGGTTCTCTT GTGTGGAATGCATTGTTCTTGCTTCTCTGGAACTTGGGAT ATGATGACAAAAATACGATA TCTCTAAGGC TAATTGCTGT GCGGATGAAATATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
全文摘要
一種用于兒童先天性耳聾基因分析檢測(cè)試劑盒，可以及早發(fā)現(xiàn)兒童先天性耳聾易感性。本試劑盒由DNA抽提試劑，預(yù)混PCR反應(yīng)液，標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照品組成。使用時(shí)以被測(cè)兒童的DNA樣本為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)過(guò)樣本DNA抽提后，使用試劑盒在熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)合反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行診斷。本發(fā)明的使用可在兒童的任何年齡階段進(jìn)行，以做到早發(fā)現(xiàn)，早治療；只需取其DNA樣本，比如口腔樣本，操作簡(jiǎn)便。能為兒童先天性耳聾的臨床診斷提供有價(jià)值的參考信息，提早采取預(yù)防和治療措施，有利于使兒童患者得到更好的治療效果。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101684493SQ20081020058
公開(kāi)日2010年3月31日 申請(qǐng)日期2008年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日
發(fā)明者汪寧梅, 穆海東, 颯 黎 申請(qǐng)人:上海裕隆生物科技有限公司