專利名稱：：一種球擬酵母菌及采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種丙氨酸缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌和用該菌發(fā)酵生產(chǎn)丙翻酸的方法。
背景技術：
：丙酮酸是一種十分重要的有機酸，在化工、制藥、農(nóng)用化學品等工業(yè)以及科學研究中有著廣泛的用途。發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸具有原料成本低，來源廣泛，產(chǎn)品純度高，反應條件溫和等諸多優(yōu)點，引起了研究者的廣泛興趣。在選育高產(chǎn)菌株方面，主要集中在對丙酮酸代謝去路的阻斷和加速葡萄糖到丙酮酸的代謝，目前已取的較大進步。文獻Yonehara(《J.Ferment.Bioeng》.1994,78:155-159)和Miyata(《J.Ferment.Bioeng》.1996,82:475-479)報道的四種維生素營養(yǎng)缺陷型T.g/a6ratolF00005(為煙酸(NA),維生素(B》，維生素B6，生物素(Bio))產(chǎn)酸超過50g/L。米原轍在四種維生素缺陷的基礎上，選育出L-Arg(《生物工學會志》2000，78(2):56-62)，L-Val和L-Leu營養(yǎng)缺陷型(《特許公報》平4一24037),以及2-脫氧葡萄糖抗性，氨基羥乙酸抗性(《特許公報》平4—24038)菌株，使丙酮酸的產(chǎn)率提高到30.54g/g;Miyata在四種維生素缺陷的基礎上選育出乙酸營養(yǎng)缺陷型菌株(JBiosciBioeng199988:173-178)，降低PDC活性，使丙酮酸產(chǎn)率提高到0.58g/g江南大學(原無錫輕工大學)李寅(《工業(yè)微生物》2001.31(2):1013.)選育了乙酸滲漏型菌株，丙酮酸產(chǎn)量(300L)可達58.4g/L，產(chǎn)率0.562g/g.Yikota(BiosciBiotechnolBiochem.1994,58:2164-2167)選育硫辛酸營養(yǎng)缺陷型￡-co//W1485lip2培養(yǎng)32小時丙酮酸產(chǎn)率達0.51g/g，而以該菌株為出發(fā)菌株構建的￡-co//TBLA-l培養(yǎng)24小時，丙酮酸產(chǎn)率達到0.6g/g。上述文件或專利報道的技術，普遍存在的一個缺陷是生產(chǎn)成本偏高、生產(chǎn)控制要求嚴格和菌種安全性質(zhì)有待進一步評估等。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的之一是公開一種球擬酵母菌(7^"/0戸&g/WratoDY404)本發(fā)明的另一個目的是提供采用上述球擬酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，以克服現(xiàn)有技術存在的缺陷。本發(fā)明所述的球擬酵母菌是一種屬于光滑酵母屬(7br"/o戸&)的球擬酵母(g/Wrato)，以下簡稱DY404。該菌種的原始菌種為7brw/o/w&g/WrataDY400，是本公司實驗室保藏菌種，是由土壤分離并且經(jīng)化學誘變篩選煙酸(NA)、硫胺素(B》，吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四種維生素營養(yǎng)滲漏型，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CCTCCM1178。本菌種經(jīng)對所述菌種進行紫外線照射、化學試劑處理(如硫酸二乙酯誘變)等所獲得的，該菌種已于2008年8月29日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為:CGMCC2646(分類命名光滑球擬酵母Torulopsisgkbrata)。所述菌種的誘變和分離篩選紫外誘變從新鮮斜面上接一環(huán)DY400菌種入種子培養(yǎng)基，在500毫升三角瓶中放置70毫升種子培養(yǎng)基，在30°C，115rpm條件下培養(yǎng)20小時，離心收集細胞，洗滌，加入無菌生理鹽水到原體積，震蕩均勻，取5毫升至含有50毫升加玻璃珠的生理鹽水中震蕩。取10毫升該菌懸液入9毫升培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，放在20W的紫外燈下，距離30厘米，照射1分鐘。稀釋涂布在培養(yǎng)基A(完全培養(yǎng)基)，3(TC培養(yǎng)48小時，再對應點種于培養(yǎng)基B(基本培養(yǎng)基)和培養(yǎng)基C(補充基本培養(yǎng)基)，挑取篩選生長良好，而基本平板不長或生長較微弱的菌落。硫酸二乙酯誘變?nèi)∽贤庹T變得到菌株，接一環(huán)菌種入種子培養(yǎng)基，在500毫升三角瓶中放置70毫升種子培養(yǎng)基，在3(TC，115r/min條件下培養(yǎng)20小時，離心收集細胞，洗漆，加入磷酸緩沖液到原體積，震蕩均勻。取4毫升菌懸液加入含有16毫升磷酸緩沖液的三角瓶中，加0.2毫升硫酸二乙酯，震蕩培養(yǎng)50分鐘，立即加入0.5毫升的25%硫代硫酸鈉緩沖液終止反應。將此反應液稀釋涂布在培養(yǎng)基A(完全培養(yǎng)基)，30'C培養(yǎng)48小時，再對應點種于培養(yǎng)基B(基本培養(yǎng)基)和培養(yǎng)基C(補充基本培養(yǎng)基)，挑取篩選生長良好，而基本平板不長或生長較微弱的菌落，接種種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時。將挑選出來的菌株接一環(huán)入發(fā)酵培養(yǎng)基，根據(jù)丙酮酸產(chǎn)量高低確定復篩菌株，復篩時，對復篩用菌株的維生素營養(yǎng)缺陷型遺傳標記進行確認。所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.3g/L。所述完全培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgSCV7H200.4g/L，自然pH(固體培養(yǎng)基加2%重量百分比的瓊脂粉)；所述基本培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖10g/L，硫酸銨0.5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.4g/L，CaCl250mg/L，F(xiàn)eS0420mg/L，CuS045mg/L,MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L。所述補充基本培養(yǎng)基的組分如下在基本培養(yǎng)基中添加天冬氨酸，濃度為0.8g/L。上述的菌種具有如下的特征1.形態(tài)特征用普通光學顯微鏡觀察在肉湯培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)16~24h的染色培養(yǎng)物，細胞通常為球形，2.在各種培養(yǎng)基上的特征a普通肉湯瓊脂斜面中間劃直線培養(yǎng)，呈中度生長，24h呈白色，表面光滑、濕潤、無黏性。b普通肉湯瓊脂平板單菌落圓形，培養(yǎng)2430h，菌落為白色，直徑約lmm，48h約3mm，表面濕潤、光滑并有光澤，邊緣整齊，無黏性。2.生理生化特征a.對氧要求表現(xiàn)為好氧及兼性厭氧。b.對溫度關系菌株的生長溫度為1533°C，2530。C培養(yǎng)生長良好。菌株在40、50、6(TC條件下處理10min，迅速冷卻后置于3(TC培養(yǎng)36h，發(fā)現(xiàn)50'C熱處理20min菌體已全部死亡。c.pH值的影響菌體在pH3~7.5均能生長，但在pH5.56時生長最好。d.不利用蔗糖為碳源。e.必需生長因子生物素、硫胺素、煙酸和吡哆醇以及丙氨酸或天冬氨酸。3.碳源利用葡萄糖、果糖、淀粉、乙酸鈉等4.氮源利用使用氮源包括氨、硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸銨、蛋白胨等。采用(《Theyeastsataxonomicstudy》thirdrevisedandenlargededitedbyN丄W.Kreger-vanRij)文獻規(guī)定的方法，對所述菌種進行鑒定，結果表明，該菌種為一種屬于光滑球擬酵母屬的菌種，但是，又與原菌種有明顯區(qū)別，其區(qū)別在于本公開菌種還具有煙酸(NA)、硫胺素(B》，吡哆醇(B6)和生物素(Bio)四種維生素營養(yǎng)滲漏型和丙氨酸和天冬氨酸缺陷型。通過常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)方法，可以培養(yǎng)所述的DY404菌，并利用其生產(chǎn)丙酮酸，其培養(yǎng)方法在許多文獻中，均有詳細的報道，如文獻《工業(yè)微生物》2001.31(2):1013.，簡述如下將所述的DY404菌，接入種子培養(yǎng)基中，在2537。C震蕩培養(yǎng)或發(fā)酵罐1822小時，即可獲得培養(yǎng)物，用于發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸；所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L,蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04*7H200.3g/L。該方法為一種成熟的方法，本發(fā)明不再贅述。將所述的培養(yǎng)物以110%的體積比的接種量，優(yōu)選4~6%的體積比，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度2832T:，優(yōu)選3(TC下，并加入堿性物質(zhì)，控制體系的pH為4.56.5，優(yōu)選5.5，通入空氣，攪拌發(fā)酵5060小時，然后從發(fā)酵產(chǎn)物中，收集丙酮酸；通風為1525L/min，攪拌速度為400450r/min，所述堿性物質(zhì)為NaOH、KOH、Ca(OH)2或CaC03等。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖100g/L，硫酸銨6g/L，KH2P042g/L，MgS(V7H200.3g/L，CaCl250mg/L,FeS0440mg/L，CuS044mg/L，MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L，天冬氨酸0.8g/L。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在丙酮酸的生物合成途徑中，丙酮酸的合成途徑短，合成能力是很強的。但由于丙酮酸是非?；顫姷拇x中間產(chǎn)物，是各種氨基酸和有機酸的代謝樞紐，往往不會大量積累。因此控制丙酮酸的代謝消耗是目前研究的主要方向。丙酮酸經(jīng)乙酰CoA到三羧酸循環(huán)后，經(jīng)草酰乙酸并在天冬氨酸轉氨酶作用下生成天冬氨酸，而天冬氨酸是天冬氨酸系氨基酸包括賴氨酸、高絲氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和異亮氨酸等的起始物質(zhì)，這些氨基酸存在發(fā)酵液中，既消耗了能量，又增加了發(fā)酵液中的副產(chǎn)物。在光滑球擬酵母菌中，丙酮酸在轉氨酶的作用下，生成丙氨酸，再進一步代謝為谷氨酰胺等。本發(fā)明篩選得到的菌種為同時天冬氨酸和丙氨酸缺陷型菌株。由于天冬氨酸和丙氨酸是可以相互轉換的，因此在基本培養(yǎng)基中只需添加兩種氨基酸中的一種菌種即可生長。本發(fā)明公開的DY404菌，為天冬氨酸和丙氨酸缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌，能夠減少丙酮酸的代謝，增加了糖酸轉化率。另外，該酵母菌中不僅存在丙酮酸到丙氨酸的轉氨反應，還存在天冬氨酸到丙氨酸的脫羧反應，采用所述菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，和現(xiàn)有技術比較，在相同的生產(chǎn)周期內(nèi)產(chǎn)酸率可提高38%，轉化率提高2-3個百分點，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)的前景。具體實施例方式以下實施例中，轉化率的定義如下產(chǎn)酸率發(fā)酵結束后發(fā)酵培養(yǎng)液中丙酮酸的濃度(％，w/v)。轉化率發(fā)酵過程中產(chǎn)物(丙酮酸)的生成量與碳源(葡萄糖)的投入量的比值(g/g)。實施例13從新鮮斜面取一環(huán)DY404菌接種于3只體積為5L裝液量為0.7L種子培養(yǎng)基的三角瓶中，3(TC培養(yǎng)20小時，以體積百分比為10%的接種量接入30L發(fā)酵罐，通風為20L/min，溫度3(TC，攪拌450r/min，過程中用8.8mol/LNaOH控制pH5.5。所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.3g/L。發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下葡萄糖100g/L，硫酸銨6g/L，KH2P042g/L，MgS04*7H200.3g/L，CaCl250mg/L,FeS0440mg/L，CuS044mg/L，MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L，毛發(fā)粉0.8g/L。然后采用膜分離方法去除細胞和其他蛋白質(zhì)，丙酮酸可從清液中用直接濃縮精餾法提取。具體的結果見表l。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例47從新鮮斜面取一環(huán)菌接種于500mL搖瓶，3(TC培養(yǎng)20小時，以體積百分比為1%接種量接入30L罐種子罐，培養(yǎng)15小時，以體積百分比為10%的接種量接入300L發(fā)酵罐中，通風為8L/小時，溫度3(TC，攪拌200r/min，過程中用10mol/LNaOH控制pH為5.5。其它同實施例l。結果如表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求1.一種球擬酵母菌(Torulopsisglabrata)-DY404—CCTCC.M2646。2.—種以球擬酵母菌(ronz/c^w'sg/fl6rato)為出發(fā)菌種選育丙酮酸高產(chǎn)菌株的方法，其特征在于利用物理或化學誘變方法使得菌株具有丙氨酸或天冬氨酸的營養(yǎng)缺陷型，阻斷菌種丙酮酸到丙氨酸的轉氨反應。3.—種以球擬酵母菌(T^w/o/w^g/"6rato)為菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法，其特征在于，包括先培養(yǎng)所述的球擬酵母菌(7bra/o^"g/a6rato)-DY404,再將該培養(yǎng)物在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，獲得含有丙酮酸的發(fā)酵產(chǎn)物。4，根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)液的組分如下葡萄糖40g/L，蛋白胨5g/L，KH2P04lg/L，MgS04'7H200.3g/L。5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，將所述的培養(yǎng)物以110%的體積比的接種量，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度2832°C，控制體系的pH為4.56.5，通入空氣，攪拌發(fā)酵5060小時。6..根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，通風為1525L/min，攪拌速度為400450r/min，所述堿性物質(zhì)為NaOH、KOH、Ca(OH)2或CaC03。7.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下:葡萄糖100g/L，硫酸銨6g/L，KH2P042g/L，MgS04'7H200.3g/L，CaCl250mg/L，F(xiàn)eS0440mg/L，CuS044mg/L，MnCl22mg/L，ZnCl25mg/L，鹽酸硫胺0.01mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，生物素0.02mg/L，煙酸7.5mg/L，毛發(fā)粉0.8g/L。全文摘要本發(fā)明公開了一種球擬酵母菌及采用該菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸的方法。本發(fā)明的球擬酵母菌，為天冬氨酸和丙氨酸缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌，能夠減少丙酮酸的代謝，增加了糖酸轉化率。另外，該酵母菌中不僅存在丙酮酸到丙氨酸的轉氨反應，還存在天冬氨酸到丙氨酸的脫羧反應，采用所述菌種發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，和現(xiàn)有技術比較在相同的生產(chǎn)周期內(nèi)產(chǎn)酸率可提高38％，轉化率提高2-3個百分點，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)的前景。文檔編號C12R1/88GK101440351SQ20081020114公開日2009年5月27日申請日期2008年10月14日優(yōu)先權日2008年10月14日發(fā)明者關惠琴,孫炳耀,健章申請人:上海新立工業(yè)微生物科技有限公司