專利名稱：：一種人巨細胞病毒(hcmv)熒光pcr檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種快速而且方便的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，可同時檢測HCMV基因組的UL122基因和UL123基因，屬于分子生物學領域。
背景技術：
：人巨細胞病毒(humancytomegalovirus,HCMV)也稱人皰疹病毒5型(Humanherpesvirus5)，屬a皰疹病毒亞科，HCMV是人類先人性病毒感染的最常見病原之一，可致感染患兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累、多器官損害、智力降低、耳聾等；在正常健康人中可引起單核細胞增多癥；在免疫缺陷者一如器官移植受者一、獲得性免疫缺陷綜合征患者一及癌癥患者一中可引起嚴重的感染，甚至致死。它和弓形體、風疹病毒、單純皰疹病毒、梅毒螺旋體合稱為人類五大生物致畸因子。鑒于HCMV在臨床疾病中的重要作用，已經(jīng)引起醫(yī)學界的廣泛重視。在皰疹病毒科中，HCMV基因組最大，約235240kb，分子為150160X103KDa。HCMV基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯受其自身及宿主細胞的調(diào)控，并具有時相性，分為IE(即刻早期)，E(早期)和L(晚期)。HCMV病原學檢測[OOO5](—)血清學診斷方法HCMV感染的血清學診斷方法通常有補體結(jié)合試驗(CF)，酶免疫試驗(EIA)等，CF法敏感性低，而EIA則在高效價血清標本檢測時分辯率低下。l.CF法用于CF法的抗原大多數(shù)從感染CMV實驗株如AD169的成纖維細胞中提取，抗原提取方法往往會影響檢測效果，幾年前的重要改進是用甘氨酸提取CMV的CF抗原，增加了實驗的敏感性.盡管如此，CF法敏感性很低，因而目前不再應用。2.EIA法(1)EIA法檢測CMV抗體有好幾種CMV抗體檢測ELISA試劑盒供應，一般幾小時可出結(jié)果，許多比較性研究證實ELISA抗體效價高，操作容易，無需慮及血清的抗補體作用，但在ELISA檢測中，某些血清與正常細胞抗原有非特異性反應而產(chǎn)生假陽性，若提高起始稀釋度以排除假陽性又會降低實驗的敏感性，故需做重復試驗并設定正常細胞抗原對照.CMV特異性的IgM-ELISA試劑盒已有供應，但如同所有的IgM檢測一樣，可能受類風濕因子等干擾，因而血清標本需預處理.CMV的血清檢測也包括中和病毒感染的抗體測定，血清的中和抗效價常不變，很少超過1:2000，試驗需要活性良好的補體，有一定技術難度。[OO12](2)EIA法檢測CMV抗原用單克隆抗體進行EIA，檢測CMV抗原是近幾年研究的重點，現(xiàn)已可測定CMV的中和抗原(至少3種蛋白質(zhì))，及各種結(jié)構(gòu)蛋白，調(diào)節(jié)蛋白.單克隆抗體能在感染后的幾個小時內(nèi)檢測到成纖維細胞核內(nèi)的CMV抗株，離心可幫助CMV吸附于單層細胞，效果可提高34倍，尿與氣管肺泡洗液的培養(yǎng)結(jié)果尤佳.但由于血液白細胞層常有細胞毒性，經(jīng)離心會使單層細胞受損，反而降低了檢測陽性率。3.乳膠凝集法乳膠凝集法測定CMV抗體是篩選血、器官供體的重要方法，幾分鐘內(nèi)可出結(jié)果，誤差5%(包括假陰性)，判定結(jié)果的主觀性是誤差的明顯因素。4.免疫吸印法將高分辨率的凝膠電泳和高靈敏度的免疫固相檢出法相結(jié)合，凝膠電泳使混合在一起的病毒成分和細胞成份分開，再通過敏感的生物分子親和技術檢測，克服了CF試驗敏感性差，EIA分辨率低的缺陷.同時，整個反應只需16h左右即可作出明確的診斷，快速且簡便.HCMV主要結(jié)構(gòu)蛋白150和38KDa出現(xiàn)于大部分病人血清中，并與HCMV-IgG、HCMV-IgM均起反應，極具代表性，可作為感染HCMV感染的指標。(二)核酸雜交目前HCMV感染的診斷技術已從生物學病毒分離防和免疫學檢測抗原抗體，進入到對基因組進行診斷的分子生物學水平階段，通過標記的核酸探針用分子雜交方法檢測標本微量的病毒DNA，具有特異性強，靈敏度高的優(yōu)點，同時此法，不僅能診斷HCMV的活動性感染，而且還能確證潛伏感染.用高比活性放射性同位素檢測HCMV，DNA克隆片段及放射自顯影檢測方法.靈敏度可達O.5pg，特異性可達100X.如用光敏生物素標記探針檢測HCMVDNA，靈敏度達1050pg，由隨機引物延伸法和缺口平移法標記的生物素探針靈敏度分別為1050pg和10pg。(三)病毒的分離(細胞培養(yǎng))基本原理細胞培養(yǎng)是以組織活細胞為母體，使活病毒得到擴增，引起宿主細胞病變(CPE).通過CPE出現(xiàn)的時間，特征等進行病毒檢測。從臨床標本中分離CMV是一種確切的診斷，但HCMV感染宿主范圍窄，只在人成纖維母細胞中增殖，增殖非常緩慢，初次分離需l個月才出現(xiàn)細胞毒，細胞腫大形成巨細胞性細胞，腫大的細胞核內(nèi)和胞漿內(nèi)可查見嗜酸性包涵體，在不利條件下CMV的感染性迅速減弱，且一些生長迅速的皰疹病毒或真菌會使單層細胞受損而影響CMV的分離。(四)DNA/RNA擴增已有較多文獻報道通過DNA擴增的方法檢測HCMVDNA或RNA，但有報道通過一對PCR引物可引起假陰性，主要原因可能是臨床標本中HCMV毒株的不同或病毒基因組中極微小變異(及病毒拷貝數(shù)太低)所致。此外，即使引物設計所選的序列針對HCMV同一基因的不同部位，其PCR擴增結(jié)果也有明顯差異.。因此，巢式PCR常被用于HCMV的檢測。但與此同時，操作步驟和檢測時間均較長，而且實驗容易造成污染，很難在臨床上進行廣泛的推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便的一種人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，用于檢測標本中HCMVDNA的含量。1、為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是使用兩對特異性引物和兩條特異性探針，分別與人巨細胞病毒(HCMV)基因組的UL122和UL123基因保守序列匹配，并可同時一個PCR管中進行檢測，目標片段長度分別為91bp和160bp。如果兩條探針標記相同的4熒光，兩者熒光擴增信號疊加，即便其中一套引物或探針配對的基因組序列發(fā)生變異，另外一套檢測引物和探針仍可正常對HCMVDNA進行檢出，大大降低了假陰性率，而且只需一次PCR即可完成檢測，省時且減少了實驗室污染。如果兩條探針標記不同的熒光，可單獨檢測UL122和UL123基因。引物和探針序列如下引物l:5—_-ACCCTGTTCTTCCTCGCTAT-3—(SeqNo.1)引物2:5—_-GCCCGAGCCCGACTTTA-3—(SeqNo.2)引物3:5—_-CCAGTGAATTTCTCTTCCGTCT-3—(SeqNo.3)引物4:5—_-CATAGAGATAGCGATAAATGAGTC-3—(SeqNo.4)探針l:5—_-GATACAGCCGGCGGTATCGA-3—(SeqNo.5)探針2:5—_-CTCCTTGATTCTATGCCGCACCAT-3—(SeqNo.6)或者與上述序列同源性大于75%的序列、或者上述所有序列的堿基互補序列。其中，引物1、引物2與探針1組合，用于檢測HCMV基因組UL122基因；引物3、引物4與探針2組合，用于檢測HCMV基因組UL123基因。兩條標記探針的熒光發(fā)光基團可以相同也可以不同，為FAM、TET、J0E、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、RhodamineGreen、Rhodamine6G、0regonGreen488、0regonGreen500、0regonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或ROX中的任意兩種組合；熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-l、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。2、上述的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，其特征在于采用多重熒光PCR檢測技術，在一個反應管內(nèi)對HCMV基因組的UL122和UL123基因同時進行檢測，以降低假陰性的發(fā)生率。3、上述的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，PCR反應體系包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM各引物、200nM各探針、lUTaq酶、0.05UUNG酶。4、上述的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，可以按如下程序進行實時熒光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然后95。C保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C45秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集相應探針標記通道的熒光)。本發(fā)明與現(xiàn)有HCMV核酸PCR檢測方法相比，具有以下有益的技術效果(1)檢領ljHCMV基因組即亥lj早期基因(immediate-earlytranscriptionalregulator;IE2)中的U122和U123基因，預測性較強。(2)同時檢測U122和U123兩個基因，能較好的降低假陽性率。(3)在同一管內(nèi)同時對兩個基因的檢測，相比巢式PCR操作更簡單，檢測時間更短，同時大大降低了污染的可能性。(4)通過對兩個熒光探針標記不同的熒光染料，可對U122和U123基因單獨進行分析和研究。圖1為稀釋后的四個濃度梯度人巨細胞病毒臨床分離株使用本發(fā)明試劑盒在Roche公司LightCycler熒光擴增儀上檢測的結(jié)果(各濃度標本重復檢測2次)；圖2為稀釋后的三個濃度梯度的人巨細胞病毒AD-169株(humancytomegalovirusAD-169，保藏狀態(tài)細胞毒{人胚肺細胞；MKC-5})使用本發(fā)明試劑盒在ABI公司ABI7500熒光擴增儀上檢測的結(jié)果；具體實施例方式設計和制備引物、探針序列(針對HCMV標準株-Humanherpesvirus5strainAD169基因〈GeneBank序列號為BK000394>序列設計)引物l:5—-ACCCTGTTCTTCCTCGCTAT-3—(SeqNo-1)引物2:5—-GCCCGAGCCCGACTTTA-3—(SeqNo.2)引物3:5—-CCAGTGAATTTCTCTTCCGTCT-3—(SeqNo-3)引物4:5—-CATAGAGATAGCGATAAATGAGTC-3—(SeqNo.4)探針l:5—FAM-GATACAGCCGGCGGTATCGA-BHQ1-3—(SeqNo-5)探針2:5—FAM-CTCCTTGATTCTATGCCGCACCAT-BHQ1-3—(SeqNo.6)上述引物和探針均在寶生物工程(大連)有限公司合成。人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR診斷試劑盒的組成為(20人份)組成成份名稱體積核酸提取液1mlPCR反應緩沖液460ii1PCR反應酶40ii1陽性對照品50ill陰性對照品50ill其中，PCR反應緩沖液(使用終濃度)包括:10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKCl、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM引物1、200nM引物2、200nM引物3、200nM引物4、200nM探針1和200nM探針2;PCR反應酶(終濃度)包括1UTaq酶、0.05UUNG酶；陽性對照品為HCMVDNA陽性臨床血清，陰性對照品為HCMVDNA陰性的血清。試劑盒的操作步驟如下(1)病毒核酸提取取待測血清樣本200ill(或尿液、乳汁1ml)3，OOOrpm離心5min，取上清，4°C13，OOOrpm離心10min，棄上清，加入核酸提取液50(陽性和陰性對照品直接加入核酸提取液50ii1)，振蕩混勻15s，IO(TC保溫lOmin，取出至4"或室溫冷卻，13，OOOrpm離心3min。取上清供PCR擴增用。(2)熒光PCR反應液的配制按每人份PCR反應緩沖液23ul、PCR反應酶2ul的配方配制PCR反應液，并按25ul/管分裝到0.2mlPCR管中，然后加入5ul待檢的核酸提取產(chǎn)物，按如下程序進行實時熒光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然后94t:保溫3分鐘，再按94°C10秒一60°C35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集FAM通道熒光)。(3)質(zhì)量監(jiān)控與結(jié)果分析<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>根據(jù)儀器分析的結(jié)果，在如下情況視實驗有效陽性對照品的25<Ct值<30，陰性對照品Ct值為40(ABI7500等儀器上顯示為"Undet.")。試劑盒性能指標最低檢測量取HCMV標準細胞毒株-AD169細胞培養(yǎng)液，使用中山大學達安基因股份有限公司生產(chǎn)的"人巨細胞病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒"(批準文號國藥準字S20060056)對其進行HCMV核酸定量，用TE緩沖液分別稀釋至1X104copies/ml、1X103copies/ml和lX102COpieS/ml，重復檢測各稀釋產(chǎn)物10次，結(jié)果表明，試劑盒能穩(wěn)定檢測出lX103copies/ml濃度的標準細胞毒株(10/10)，試劑盒最低檢測量為1X103copies/ml;特異性使用試劑盒對HSV-1、HSV-2、EB、RV和HPV臨床標本各1例(酶免檢測抗體為陽性，達安基因股份有限公司生產(chǎn)的"人巨細胞病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒"檢測為HCMV陰性)進行檢測，結(jié)果全部為陰性，特異性為100%。精密性使用試劑盒對1例經(jīng)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的"人巨細胞病毒核酸擴增熒光定量檢測試劑盒"定量結(jié)果為5.2X105COpieS/ml的臨床標本(尿液)重復10次檢測，統(tǒng)計檢測Ct值CV<3%。臨床研究使用試劑盒對沈陽盛京醫(yī)院297例HCMV臨床標本(其中，尿液195例，乳汁62例，血清40例)分別在Roche公司的LightCycler和ABI公司的ABI7500熒光PCR儀上進行檢測，陽性率分別為32.3%(96/297)和31.3%(93/297)，其中，乳汁標本的檢測陽性檢出率最高，為93.5%(58/62)。上述實驗結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒不僅操作簡單，而且，在保證了高靈敏度的同時，保證了特異性和精密性，可用于分析標本中的HCMV病毒核酸的情況。SEQUENCELISTING〈110〉上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司劍軍，何懿，夏大治，吳〈120〉一種人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法〈160>6〈170〉Patentlnversion3.37〈210>1〈211>20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>1accctgttcttcctcgctat〈210>2〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>2gcccgagcccgacttta〈210〉3〈211〉22〈212>DNA<213>人工序列〈400>3ccagtgaatttctcttccgtct〈210>4〈211>24<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4catagagategcgata肌tgagtc<210>5<211>20〈212>DNA〈213〉人工序列〈400>5gatacagccggcggtatcga<210>6〈211>24〈212〉DNA〈213>人工序列<400>6ctccttgattctatgccgcaccat權(quán)利要求一種人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，其特征在于包含兩對特異性引物和兩條特異性探針，擴增目標片段長度分別為91bp和160bp，序列為引物15`-ACCCTGTTCTTCCTCGCTAT-3`(SeqNo.1)引物25`-GCCCGAGCCCGACTTTA-3`(SeqNo.2)引物35`-CCAGTGAATTTCTCTTCCGTCT-3`(SeqNo.3)引物45`-CATAGAGATAGCGATAAATGAGTC-3`(SeqNo.4)探針15`-GATACAGCCGGCGGTATCGA-3`(SeqNo.5)探針25`-CTCCTTGATTCTATGCCGCACCAT-3`(SeqNo.6)或者與上述序列同源性大于75％的序列、或者上述所有序列的堿基互補序列。其中，引物1、引物2與探針1組合，用于檢測HCMV基因組UL122基因；引物3、引物4與探針2組合，用于檢測HCMV基因組UL123基因。兩條標記探針的熒光發(fā)光基團可以相同也可以不同，為FAM、TET、JOE、Cy3、Cy5、Cy5.5、Fluorescein、Rhodamine、RhodamineRed、RhodamineGreen、Rhodamine6G、OregonGreen488、OregonGreen500、OregonGreen514、TexasRed、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、Acridineorange、或ROX中的任意兩種組合；熒光淬滅基團為DABCYL、DABSYL、TAMRA、BHQ-1、BHQ-2或BHQ-3中的任意一種或一種以上的組合。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，其特征在于采用多重熒光PCR檢測技術，在一個反應管內(nèi)對HCMV基因組的UL122和UL123基因同時進行檢測，降低假陰性的發(fā)生率。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，其特征在于，PCR反應體系包括10mMTris-HCl(PH8.3)、50mMKC1、300iiMd(AGC)TP、300iiMdUTP、5mMMgCl2、200nM各引物、200nM各探針、lUTaq酶、0.05UUNG酶。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法，其特征在于，可以按如下程序進行實時熒光PCR檢測反應管先在5(TC反應2分鐘，然后95t:保溫5分鐘，再按94°C20秒一60°C45秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集相應探針標記通道的熒光)。全文摘要本發(fā)明涉及一種人巨細胞病毒(HCMV)熒光PCR檢測方法。本發(fā)明分別針對人巨細胞病毒(HCMV)基因組的UL122和UL123基因設計了兩組檢測引物和探針，通過同時檢測兩個基因降低了因HCMV基因組發(fā)生突變導致的假陰性率的發(fā)生。本發(fā)明技術能快速、簡便的對HCMVDNA進行定性和定量檢測，具有較高的特異性和靈敏性。文檔編號C12Q1/70GK101760560SQ200810201649公開日2010年6月30日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者何劍軍,吳大治,夏懿申請人:上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司