專利名稱：一種在細胞表面展示外源蛋白的方法及產(chǎn)品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種在細胞表面展示外源蛋白
的方法及產(chǎn)品。
背景技術：
隨著生物工程技術的發(fā)展，具有某些功能活性的蛋白被越來越多地應用于各領 域。然而，蛋白作為有生物活性的物質，其本身極易于失活，穩(wěn)定性差，保存很困難，且難以 回收利用。并且，盡管目前蛋白的大規(guī)模重組制備已經(jīng)變得可能，然而表達后的蛋白的分離 和提純還存在諸多的困難，純化步驟復雜。因此本領域人員致力于尋找提高蛋白的穩(wěn)定性， 簡化蛋白的純化，固定化蛋白以及使得蛋白回收利用的方法。 此外，作為一種具體的例子，有機磷或氨基甲酸酯類殺蟲劑是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用 的一類農(nóng)藥，因其具有種類多樣、殺蟲譜廣、價格低廉等特點，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上被廣泛使用，為 糧食豐產(chǎn)和農(nóng)業(yè)發(fā)展提供保證。但由于農(nóng)藥的不合理使用，許多食品中有機磷或氨基甲酸 酯類農(nóng)藥殘留超標，導致急性中毒事件時有發(fā)生，嚴重威脅著人們的身體健康和農(nóng)產(chǎn)品在 國際市場的競爭力，目前已經(jīng)引起了各國政府和社會各界的廣泛關注。目前常用的有機磷 或氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法有免疫學檢測方法和酶抑制法。傳統(tǒng)的免疫學檢測技術因其 抗體特異性，不能同時檢測多種不同種類的農(nóng)藥，在實際應用中受到限制。而酶抑制法主要 利用了乙酰膽堿酯酶對有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性，具有簡便、靈敏等優(yōu)勢，成為 應用較為普遍的農(nóng)藥殘留快速檢測技術。乙酰膽堿酯酶能夠專一性的被有機磷或氨基甲酸 酯類農(nóng)藥抑制，但游離形式的乙酰膽堿酯酶穩(wěn)定性差，極易失活，并且其來源有限，純化過 程復雜，這些都大大地限制了其在生產(chǎn)實踐中的應用。因此，本領域需要找到更為有效的獲 得和利用乙酰膽堿酯酶的方法，特別是提供乙酰膽堿酯酶穩(wěn)定性，簡化乙酰膽堿酯酶純化 技術的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因構建物，所述的基因構建物在被導入適當?shù)募毎?后可在細胞表面表達外源蛋白。 本發(fā)明的另一目的在于提供一種細胞，所述的細胞表面展示有外源蛋白。 在本發(fā)明的第一方面，提供一種基因構建物，所述基因構建物從5'到3'依次包括
以下操作性相連的元件 (a)葡萄糖淀粉酶信號肽編碼序列；
(b)外源蛋白的編碼序列；禾口 (c)酵母a凝集素基因C端錨定信號的編碼序列。 在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白選自(但不限于)受體蛋白、配體蛋白、酶蛋白 或抗體蛋白等。 在另一優(yōu)選例中，所述的外源蛋白是長度是20-1200aa;較佳的是50-1000aa ;更
3佳的是80-800aa，如約lOOaa， 200aa， 300aa， 500aa， 700aa。
在另一優(yōu)選例中，所述的構建物中，外源蛋白是乙酰膽堿酯酶。 在另一優(yōu)選例中，所述的乙酰膽堿酯酶是不帶信號肽和錨定信號的乙酰膽堿酯 酶。 在另一優(yōu)選例中，所述的葡萄糖淀粉酶信號肽編碼序列是SEQ ID NO:l所示序列 中第1-75位的序列；或 所述的乙酰膽堿酯酶編碼序列是SEQ ID NO :1所示序列中第76-1824位的序列； 或 所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號的編碼序列是SEQ ID NO :1所示序列中 第1858-2817位的序列。 在另一優(yōu)選例中，在元件(b)和元件(c)之間，包括一標簽蛋白編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的標簽蛋白是Flag蛋白。 在另一優(yōu)選例中，所述的元件(a) 、 (b)和(c)之間包括或不包括連接肽編碼序列，
所述的連接肽具有l(wèi)-15aa ;較佳地具有l(wèi)-10aa ;更佳地具有1-5aa。 在另一優(yōu)選例中，所述的乙酰膽堿酯酶是黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶。 在另一優(yōu)選例中，所述的基因構建物具有SEQ ID NO :1所示的序列。 在本發(fā)明的二方面，提供一種重組的表達載體，所述表達載體含有所述的基因構建物。 在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體的骨架質粒是pYES-DEST52。 在本發(fā)明的第三方面，提供一種細胞，所述的細胞是酵母細胞，所述細胞中含有所
述的表達載體；或其基因組中整合有所述的基因構建物。 在另一優(yōu)選例中，所述的酵母細胞選自釀酒酵母或畢赤酵母。 在另一優(yōu)選例中，所述的基因構建物中，外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿酯酶的 編碼序列。 在另一優(yōu)選例中，所述的酵母細胞是釀酒酵母細胞，其表面上展示表達有乙酰膽 堿酯酶。 在本發(fā)明的第四方面，提供一種在細胞表面展示表達外源蛋白的方法，所述方法 包括 (i)將所述的基因構建物導入到酵母細胞中，獲得重組細胞；
(ii)培養(yǎng)(i)的重組細胞，從而在細胞表面展示表達外源蛋白。
在另一優(yōu)選例中，在步驟(i)中，所述的基因構建物中，外源蛋白的編碼序列是
乙酰膽堿酯酶的編碼序列；從而在步驟(ii)中，在細胞表面展示乙酰膽堿酯酶。 在本發(fā)明的第五方面，提供一種檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試
劑盒，所述試劑盒中包括 細胞，所述的細胞中帶有一基因構建物，所述的基因構建物中外源蛋白的編碼序 列是乙酰膽堿酯酶的編碼序列；或 固相載體，以及吸附或包埋在固相載體中的細胞，所述的細胞中帶有一基因構建
物，所述的基因構建物中外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿酯酶的編碼序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括(但不限于)磷酸膽堿酯酶的底物(如乙酰膽堿或碘化乙酰膽堿)，顯色劑(如DTNB)，微量滴定板(如96孔板)，使用說明書。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方 法，所述方法包括 (1)將細胞固定于固相載體或懸浮于與所述細胞相容性的介質中，形成檢測體系； 所述的細胞中帶有一基因構建物，所述的基因構建物中外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿 酯酶的編碼序列； (2)在(1)的檢測體系中加入待測樣品，混合；禾口 (3)檢測(2)的體系中乙酰膽堿酯酶的活性，從而確定待測樣品中是否含有有機 磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(3)中，包括向步驟(2)的檢測體系中加入乙酰膽堿酯 酶的底物，通過檢測乙酰膽堿酯酶對底物的水解情況確定待測樣品中是否含有有機磷或氨 基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。 在另一優(yōu)選例中，所述的乙酰膽堿酯酶的底物是乙酰膽堿(ATch)，或碘化乙酰膽 堿(AtchI)。 在另一優(yōu)選例中，在步驟(2)中，還包括設置對照體系，所述的對照體系中不加 入待測樣品；步驟(3)中，還包括將檢測體系中乙酰膽堿酯酶活性與對照體系中乙酰膽堿 酯酶活性比較；若檢測體系中乙酰膽堿酯酶活性顯著降低(如降低10%，優(yōu)選降低20%;更 優(yōu)選降低40%或更低)；則表明待測樣品中含有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥(定性方法)。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖l.pYES-S-AChE-fag-Aga重組質粒的構建流程和圖譜。 圖2.載體pYES-S-AchE-f lag-Ag a酶切鑒定，其中 泳道M :DNA Marker,由HindIII、 BamHI和EcoRI消化的入DNA ; 泳道1 :由PvuII和BglII酶消化的pYES-S-AchE-f lag-Ag a 。 圖3.乙酰膽堿脂酶酶活力的測定，其中 圖3A.空白對照酵母反應體系酶活力測定； 圖3B.未誘導的轉化子酵母反應體系酶活力測定； 圖3C.誘導后的轉化子酵母反應體系酶活力測定。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，首次設計得到一種基因構建物，所述的基因構建物在 導入到細胞中后，可使得重組表達的細胞表面展示表達外源蛋白(如乙酰膽堿酯酶)，且外 源蛋白在細胞表面上的展示表達效果特別優(yōu)異，可保留良好的蛋白活性。采用本發(fā)明的基 因構建物以及表達系統(tǒng)，可方便地實現(xiàn)外源蛋白的固定化，并可簡化蛋白純化的繁瑣步驟。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在細胞表面展示表達乙酰膽堿酯酶，可直接利用所述表 面展示有乙酰膽堿酯酶的細胞來檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在與否 或存在量。與采用游離形式的乙酰膽堿酯酶檢測相比，展示在細胞表面的乙酰膽堿酯酶性
5質更為穩(wěn)定，且無需繁瑣的純化過程即可使用，有效地簡化了檢測步驟，提高了檢測準確 性。 如本文所用，所述的"操作性相連"或"可操作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA 序列的某些部分能夠調節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控 制序列的轉錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。 如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......構
成"、"基本上由......構成"、和"由......構成"；"主要由......構成"、"基本上
由......構成"和"由......構成"屬于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。 構建物 為了能夠實現(xiàn)將外源蛋白展示在酵母細胞表面的目的，本發(fā)明人曾經(jīng)嘗試了多種 基因構建方法，最后獲得了最佳的基因構建物，從而實現(xiàn)外源蛋白的良好展示表達。因此， 本發(fā)明提供了一種基因構建物，所述構建物從5'到3'依次包括以下操作性相連的元件 (a)葡萄糖淀粉酶信號肽編碼序列；(b)外源蛋白的編碼序列；和(c)酵母a凝集素基因C 端錨定信號的編碼序列。 所述的構建物編碼的融合蛋白中，以葡萄糖淀粉酶信號肽作為外源蛋白的信號 肽。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖淀粉酶信號肽具有良好的細胞表面定位效果，可良好地指 導胞質中表達的外源蛋白穿過細胞壁，最終展示在酵母細胞的表面。作為本發(fā)明的優(yōu)選方 式，所述的葡萄糖淀粉酶信號肽編碼序列是SEQID N0:l中第l-75位的序列；或其簡并的序 列或其變異體，只要所述的變異體編碼的蛋白也保留有葡萄糖淀粉酶信號肽的全部或部分 (至少50%以上，優(yōu)選至少80%以上)活性或功能。 所述的構建物編碼的融合蛋白中，以酵母a凝集素基因C端錨定信號作為外源蛋 白的錨定信號。當用于本發(fā)明時，酵母a凝集素基因C端錨定信號具有非常優(yōu)異的蛋白錨 定效果，使得外源蛋白良好地、穩(wěn)定地錨定在細胞表面，且保持良好的蛋白活性。作為本發(fā) 明的優(yōu)選方式，所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號的編碼序列是SEQ ID N0:1中第 1858-2817位的序列；或其簡并的序列或其變異體，只要所述的變異體編碼的蛋白也保留 有酵母a凝集素基因C端錨定信號的全部或部分(至少50%以上，優(yōu)選至少80%以上) 活性或功能。 如本文所用，所述的"外源蛋白"可以是多種需要展示表達的蛋白，例如，所述的外 源蛋白可以是(但不限于)受體蛋白、配體蛋白、酶蛋白或抗體蛋白等。其它類型的蛋白 也是可用的。 所述的受體類蛋白例如是核受體，如孤兒核受體、類固醇受體等等。將受體類蛋白 或受體類蛋白的配體結合區(qū)展示表達在細胞表面，從而獲得重組細胞，所述的重組細胞可 應用于藥物篩選等領域，例如用于篩選與該受體相匹配的配體。 所述的酶蛋白例如是乙酰膽堿酯酶、蛋白激酶等。將酶蛋白展示表達在細胞表面， 從而獲得重組細胞，所述的重組細胞可應用于酶催化反應領域。有利于保持酶蛋白的生物 活性，以及有利于酶的固定化以及酶的回收利用。 本發(fā)明的基因構建物的各元件是操作性相連的。所述的各元件之間可以直接相 連，或者也可包括適當?shù)拈g隔序列，例如具有卜45bp的連接序列；較佳地具有l(wèi)-30bp的連 接序列；更佳地具有l(wèi)-15bp的連接序列。所述的連接序列例如是酶切位點，或者是標簽蛋白編碼序列。 本發(fā)明還包括含有所述構建物的重組表達載體，任何適用于酵母細胞表達的表達 載體可用于制備本發(fā)明的表達載體，只要其能在酵母細胞內(nèi)復制和穩(wěn)定。表達載體的一個 重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。作為本發(fā)明的優(yōu)選方 式，所述的表達載體選自(但不限于):pYSE-DEST52(Invitrogen)， pPIC9K(Invitrogen) 等。將構建物克隆入表達載體以構建重組表達載體的方法也是本領域人員已知的。
含有乙酰膽堿酯酶編碼序列的構建物 作為本發(fā)明特別優(yōu)選的方式，所述的外源蛋白是一種酶蛋白。更優(yōu)選的，所述的酶 蛋白是乙酰膽堿酯酶。 所述的乙酰膽堿酯酶是本領域人員熟知的蛋白，其編碼基因也是本領域熟知的。 任何一種乙酰膽堿酯酶蛋白的生物活性片段的編碼序列都可以應用到本發(fā)明中。在這里， 乙酰膽堿酯酶蛋白的生物活性片段的含義是指作為一種蛋白片段，其仍然能保持完整的乙 酰膽堿酯酶蛋白的全部或部分功能(如至少80%的活性，更佳的至少90%的活性)。氨基 酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的乙酰膽堿酯酶蛋白及其編 碼基因也可應用于本發(fā)明中。所述的經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形 成的乙酰膽堿酯酶蛋白也具有乙酰膽堿酯酶蛋白的全部或部分功能。 乙酰膽堿酯酶及其編碼基因的來源比較廣泛，例如可以分離自蠅、魚腦、哺乳動物 血液等。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的乙酰膽堿酯酶是黑腹果蠅乙酰膽堿酯酶。所 述的乙酰膽堿酯酶的氨基酸序列可以與GenBank登錄號為NM_057605所示的序列基本上相 同。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的乙酰膽堿酯酶不帶有其自身的信號肽和錨定信 號，其編碼序列具有SEQ ID N0 :1中第76-1824位的序列。 所述的構建物編碼的融合蛋白中，以葡萄糖淀粉酶信號肽代替了乙酰膽堿酯酶自 帶的信號肽。本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖淀粉酶信號肽比乙酰膽堿酯酶自帶的信號肽具 有更好的細胞表面定位效果，葡萄糖淀粉酶信號肽可良好地指導胞質中表達的乙酰膽堿酯 酶蛋白穿過細胞壁，最終展示在酵母細胞的表面。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的葡萄糖淀 粉酶信號肽非編碼序列是SEQ IDN0 :1中第1-75位的序列。 所述的構建物編碼的融合蛋白中，以酵母a凝集素基因C端錨定信號代替了乙 酰膽堿酯酶自帶的錨定信號。酵母a凝集素基因C端錨定信號具有更優(yōu)異的蛋白錨定 效果，使得乙酰膽堿酯酶良好地、穩(wěn)定地錨定在細胞表面，且保持良好的酶活性。作為本發(fā) 明的優(yōu)選方式，所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號的編碼序列是SEQ ID N0:1中第 1858-2817位的序列。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在乙酰膽堿酯酶與酵母a凝集素基因C端錨定信號之 間，還包括一標簽蛋白編碼序列，從而在翻譯表達后有利于融合蛋白的檢測。優(yōu)選的是一些 氨基酸序列較短的標簽蛋白，所述的標簽蛋白例如是Flag蛋白，其具有SEQ ID N0:1中第 1825-1848位所示的編碼序列。例如，可以采用抗所述標簽蛋白的抗體(如anti-Flag)來 檢測蛋白的表達情況；或者，可以采用抗所述標簽蛋白的抗體來純化蛋白或展示所述蛋白 的細胞。
細胞
本發(fā)明還提供了一種重組的細胞，所述的細胞是酵母細胞，所述細胞中含有所述 的表達載體，或其基因組中整合有所述的基因構建物。優(yōu)選地，所述的酵母細胞選自釀酒 酵母、畢赤酵母。所述的細胞的表面上可穩(wěn)定地展示表達外源蛋白，從而可直接用于所述外 源蛋白相關的應用，如用于篩選藥物或藥物發(fā)揮催化作用等等。 本發(fā)明所述的在細胞表面展示表達外源蛋白的方法主要包括(i)將本發(fā)明的基 因構建物導入到酵母細胞中，獲得重組細胞；(ii)培養(yǎng)(i)的重組細胞，從而在細胞表面展 示表達外源蛋白。 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細胞的表面上可穩(wěn)定地展示表達乙酰膽堿酯酶， 從而可用于檢測待測樣品中的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，同時還可用于乙酰膽堿酯酶相 關的環(huán)保、醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、軍事等領域。在酶活性水平上，本發(fā)明制備的酵母細胞表面展示的乙 酰膽堿酯酶的酶活力檢測與市面購買的成品酶粉的參比試驗表明，本發(fā)明的酵母細胞表面 的乙酰膽堿酯酶活力很高，達到3. 06 ii mol/min mL，完全可達到或超過市面購買的成品酶 粉的酶活力水平。 將基因構建物引入到宿主細胞內(nèi)的方法是本領域已知的，例如可采用選自以下的 方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等?？赏ㄟ^抗性標記 來篩選引入了基因構建物的重組細胞。 獲得的重組細胞可以采用常規(guī)的酵母細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)，在適于宿主細胞生長的 條件下進行培養(yǎng)?？筛鶕?jù)培養(yǎng)的規(guī)模適當?shù)卣{節(jié)培養(yǎng)的條件，使之良好地表達蛋白。
所述的重組細胞可以被置于溶液中，制成細胞懸浮液使用。更優(yōu)選的，所述的重組 細胞可被固定化在固相載體中，從而便于穩(wěn)定地使用，以及便于細胞的回收和重復利用。可 通過固定細胞，實現(xiàn)外源蛋白(如酶)的固定化，避免了游離蛋白的性質不穩(wěn)定、極易失活、 不能重復使用的缺點，從而使得相應的外源蛋白可以更好地得到應用。 固定化細胞的方法是本領域已知的技術，例如可以采用選自(但不限于)以下的 技術(l)吸附法(包括物理吸附法，離子結合法等)；(2)包埋法(如海藻酸鈉凝膠固定化 細胞法)；(3)共價交聯(lián)法。對于酵母細胞而言，一種可選的固定方法是包埋法，其是將細胞 均勻地包埋在水不溶性載體的緊密結構中，細胞不會漏出而底物和產(chǎn)物可以進入和滲出。 細胞和載體不起任何結合反應，細胞處于最佳生理狀態(tài)。因此，酶的穩(wěn)定性高，活力持久。
細胞固定化常用材料(或稱為固相載體)例如可選自(但不限于)(l)多糖類 (纖維素、瓊脂、葡聚糖凝膠、藻酸鈣、K-角叉膠、DEAE-纖維素等)；(2)蛋白質(骨膠原、明 膠等)；(3)無機載體(氧化鋁、活性炭、陶瓷、磁鐵、二氧化硅、高嶺土、磷酸鈣凝膠等)；(4) 合成載體(聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛樹脂等)。 對于酵母細胞而言，優(yōu)選地可以采用海藻酸鈉來實現(xiàn)固定?？蓪⒔湍讣毎c海藻 酸鈉混合，然后將混合液滴入氯化鈣溶液中，使藻酸鈉轉變?yōu)樗蝗艿脑逅徕}凝膠，由此將 包埋在其中，這種固定方法是本領域人員已知的。
試劑盒 本發(fā)明還提供了一種檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試劑盒，所述 試劑盒中包括本發(fā)明所述的表面展示表達有乙酰膽堿酯酶的細胞(或細胞培養(yǎng)物)?；?者，所述的試劑盒中含有固相載體，以及吸附或包埋在固相載體中的表面展示表達有乙酰 膽堿酯酶的細胞。
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此外，所述的試劑盒中還可包括用于分析酶活性的試劑，包括磷酸膽堿酯酶的底 物(如乙酰膽堿或碘化乙酰膽堿)，顯色劑(如DTNB)，微量滴定板(如96孔板)，以及使用 說明書等。 此外，當需要時，所述的試劑盒中還可包括用于稀釋樣品的試劑；或用于培養(yǎng)細胞 的培養(yǎng)基。 此外，所述的試劑盒中還可包括使用說明書等，用于指導檢測人員正確地使用或 操作。 有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢測方法 所述的有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法基于以下原理乙酰膽堿酯酶能夠 專一性的被有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制，且其抑制率與農(nóng)藥的濃度成正比關系。因此 通過檢測樣品是否使乙酰膽堿酯酶活性發(fā)生變化，可快速檢測樣品中有機磷或氨基甲酸酯 類農(nóng)藥的殘留情況。乙酰膽堿酯酶的酶活性可以通過其與底物的反應情況來確定。
因此，本發(fā)明提供一種檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，所述 方法包括(l)將本發(fā)明所述的表面展示表達有乙酰膽堿酯酶的細胞固定于固相載體或懸 浮于與所述細胞相容性的介質中，形成檢測體系；(2)在(1)的檢測體系中加入待測樣品， 混合；和(3)檢測(2)的體系中乙酰膽堿酯酶的活性，從而確定待測樣品中是否含有有機磷 或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。 乙酰膽堿酯酶的酶活性的測定是本領域人員已知的技術。乙酰膽堿酯酶可催化神
經(jīng)傳導代謝產(chǎn)物(如乙酰膽堿)水解，其水解產(chǎn)物可與顯色劑(如二硫代二硝基苯甲酸，
DTNB)反應，產(chǎn)生顯色物質(DTNB可顯示黃色)，用分光光度計測定吸光度隨時間的變化值，
計算出抑制率，通過抑制率可以判定出產(chǎn)品中是否存在有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥以及存
在量。優(yōu)選地，可通過設置對照體系來更準確地反映酶活性的變化情況。 所述的"與所述細胞相容性的介質"是指對所述細胞以及細胞表面展示的酶均不
產(chǎn)生影響，且對于有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥與乙酰膽堿酯酶的相互作用以及乙酰膽堿酯
酶與其底物的相互作用不產(chǎn)生影響的介質。所述的介質例如可以是適當?shù)姆磻彌_液，如
磷酸鈉緩沖液。 經(jīng)過實施例驗證，細胞表面展示有乙酰膽堿酯酶的細胞檢測體系當應用于農(nóng)藥檢 測時，對于許多種有機磷類以及氨基甲酸酯類農(nóng)藥均具有非常靈敏的檢測效果，特別是對 于殘殺威、速滅威、呋喃丹等農(nóng)藥，半抑制濃度(IC50)最高達到了 0. 00073 iig/mL。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于 (1)本發(fā)明找到了可良好地使外源蛋白展示表達在酵母細胞表面的方法，利用酵 母作為外源蛋白的表達宿主；采用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)，外源蛋白在細胞表面上的展示表 達效果特別優(yōu)異，可保留良好的蛋白活性，可方便地實現(xiàn)外源蛋白的固定化，并可簡化蛋白 純化的繁瑣步驟。 (2)本發(fā)明在酵母表面表達乙酰膽堿酯酶，可以使得攜帶乙酰膽堿酯酶的重組細 胞直接與農(nóng)藥發(fā)生相互作用，避免了過往從生物體或分泌液中分離純化乙酰膽堿酶的復雜 程序，生產(chǎn)工藝大為簡便，成本降低。 (3)在酵母表面表達乙酰膽堿酯酶，可通過固定酵母，實現(xiàn)酶的固定化，避免了游 離酶的性質不穩(wěn)定，極易失活，不能重復使用的缺點，從而可以將其開發(fā)為傳感器等更加靈敏和自動化的農(nóng)藥殘留檢測設備。 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York : Co Id Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。 實施例l.乙酰膽堿脂酶融合蛋白酵母真核表達載體構建 乙酰膽堿脂酶(AChE)基因全長1947bp (參見GenBank登錄號NM_057605)，可編碼649個氨基酸(參見GenBank登錄號NP_476953)，該酶蛋白序列N端含有信號肽序列(l-38aa)，其C端含有GPI錨定信號(620_649aa)。 為了使乙酰膽堿脂酶能夠在酵母表面展示，本發(fā)明人刪除該酶蛋白的錨定信號(622-649aa)，由酵母自身的a凝集素基因(Ag a ) C端錨定信號序列(320aa)代替。同時在AChE基因與a凝集素基因錨定區(qū)域之間加入一個Flag抗原表位，以便用于融合蛋白的檢測。 此外，為了改善酶蛋白在酵母表面定位的效果，本發(fā)明人以葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)分泌信號肽序列代替了 AChE自身信號肽，并利用pYES-DEST52Gateway系統(tǒng)，構建了 pYES-S-AChE-flag-Aga重組質粒，見圖1。
表達載體構建方法具體如下 從果蠅與釀酒酵母的cDNA文庫中分別獲取AChE
(1-1863bp)
基因以及Aga
(3，端960bp)
(a凝集素，其序列參見GenBank登錄號X16861)基因，并克隆到PMD18-T載體(購自Invitrogen公司)中，得到重組質粒T_AChE(1—1863)與T_Ag a (3'端96卿)。 通過常規(guī)的PCR技術，以T-AChE(卜1863)為模板，在3'端中引入flag標簽堿基序列(編碼以下氨基酸序列DYKDDDDK)以及Not I酶切位點，得到產(chǎn)物AChE(卜1863)-f lag片段。同時以T-Aga
(3，端960bp)
為模板，5'端引入Not I酶切位點，得到產(chǎn)物Aga(3，,e。bp)片段。以上述兩個產(chǎn)物片段為模板，利用重疊PCR技術，整合為片段AChE(卜腦)-f lag-Ag a (3,端96卿)。并繼續(xù)以此為模板，將葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase)分泌信號肽堿基序列(其序列見SEQ ID N0:l中第l-75位))引入5'端引物中，以此替換掉AChE基因片段5'端的信號肽堿基序列(l-114bp)，獲得S_AChE(115—觀)-flag-Aga (3,端96卿)片段。利用T0P0技術將此片段克隆至載體pENTR/D-TOPO⑧(Invitrogen公司)的attLl/attL2位點中，得到重組質粒pEntr-S_AChE(115—觀)-flag-Aga (3'端96一，利用Gateway 技術將融合基因片段AChE(115—腦)-f lag-Ag a (3'端96一插入到pYSE_DEST52 (Invitrogen公司)表達載體的attL1/
attL2位點中，得到目的質粒pYES-AChE (115-1863) _flag_Ag a (3'端960bp)。 上述所構建的重組載體pYES-S-AChE-f lag-Ag a用PvuII與BglII雙酶切鑒定，酶切片段大小為718bp，與實際預期相符，見圖2。測序結果顯示該酶切片段為實驗所需目的片段。 S-AChE(115—1863)_f lag-Ag a (3'端96一的核苷酸序列如SEQ ID NO :l所示，其中第1-75位為葡萄糖淀粉酶分泌信號肽編碼序列；第76-1824位為AChE編碼序列；第1825-1848位為Flag標簽編碼序列；第1858-2817位為Ag a的3'端編碼序列。
實施例2.乙酰膽堿酯酶誘導表達以及酶活力鑒定
10
將重組質粒pYES-S-AChE-f lag-Ag a轉化釀酒酵母INVScl (購自Invitrogen公司)，在SC選擇平板上篩選轉化子。挑取的單克隆在5ml SC培養(yǎng)基中3(TC培養(yǎng)過夜，隨后10，000rpm，4t:條件下離心5min收集細胞，用以半乳糖(Gal)為碳源的SC培養(yǎng)基將其稀釋為0D6。。值為0. 4的細胞懸液，3(TC誘導4小時，再10， OOOrpm，4"條件下離心5min收獲細胞。 細胞重懸在磷酸鈉緩沖液(pH7.6)中，使其0De。。值為0.5，隨后依次加入底物碘化乙酰膽堿(ATchI)和顯色劑DTNB，其終濃度均為lmM。將該反應體系置于37°C ，測其0D412值，以后每隔0. 5min測定一次，連續(xù)測定15min。酶活力定義為每mL細胞懸液(0D6。。 = 1)每min水解底物的y mol數(shù)，酶活力單位為P mol/mL. min。具體公式如下
酶活力=VXA/(V。XKXLXc) (公式1) 公式中A表示吸光度隨時間的變化率(min—0 ;V。表示酶活力測定時所取細胞懸液的體積(mL) ， V。 = 0. 1 ;K表示消光系數(shù)[L/ (mmol. mm) ] ， K = 1. 36 ;c表示酵母細胞懸液的吸光值，c = 1 ;L表示測定酶活力時溶液的光徑長度，即比色皿光程(mm) ， L = 2 ;V表示反應體系的總體積(mL) ， V = 0. 2。 將未轉質粒的空白酵母，未經(jīng)Gal誘導的轉化子酵母懸液作為對照，測定誘導后轉化子酵母懸液的乙酰膽堿酯酶活力。與對照相比(圖3A，圖3B)，誘導后的轉化子酵母可檢測到明顯的酶活性(圖3C)，根據(jù)公式l計算其酶活力為3.06iimol/mL.min。上述結果也證明了乙酰膽堿酯酶展示在酵母細胞表面，而非細胞內(nèi)表達或分泌表達。
實施例3.有機磷農(nóng)藥半抑制濃度(IC5。)測定 酵母細胞誘導表達AChE后離心收集，再重懸于磷酸鈉緩沖液(pH7.6)中，隨后接種于96孔板中，使其0D6。。值為0. 5，加入終濃度分別為0、 10-4、 10-3、 10-2、 10-1和1 y g/mL的有機磷農(nóng)藥，3(TC下孵育30min，然后加入終濃度均為lmM的底物ATChI與顯色劑DTNB，反應總體積為200 ii L， 37t:下反應15min，反應過程中每間隔0. 5min檢測0D412值。使用常規(guī)的直線內(nèi)插法分別計算出農(nóng)藥對AChE的ICs。值。 從表1結果可知，12種有機磷農(nóng)藥對AChE的敏感性都十分顯著，其中敏感性最好的是速滅威，其IC5。值為0. 00073 i！ g/mL，即便是敏感性差的久效磷，其IC5。值也達到了0. 046 ii g/mL。這說明固定化后乙酰膽堿酯酶敏感性仍然較高，具有很好的應用價值。
表1有機磷農(nóng)藥對AChE的半抑制濃度IC5。
農(nóng)藥名稱IC50(Mg/mL)
甲基啼啶磷0.0137
久效磷0.046
殘殺威0.002
速滅威0.00073
對氧磷0.001267
抗蚜威0.00246
呋喃丹0.00175
葉蟬散0.015
西維因0.025
氧化樂果0.029
甲拌磷0扁76
馬拉硫磷0.013 實施例4.酵母細胞的固定 稱取1.6g海藻酸鈉于無菌的小燒杯中，加無菌去離子水少許，調成糊狀，再加入其余的水(總量為40ml)。火上加溫至熔化，冷卻至3(TC左右，加入10ml上述制備的表面展示有乙酰膽堿酯酶的酵母培養(yǎng)液，混合均勻，倒入下邊裝有膠管與止血夾的漏斗中，通過1. 5 3. 0mm的小孔，以恒定的速度滴到盛有10% CaCl2溶液的平皿中制成凝膠珠。凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min以便形成穩(wěn)定的結構，之后將凝膠珠轉入300ml錐形瓶中，用無菌去離子水洗滌3次后加入200ml SC培養(yǎng)基。
實施例5.檢測試劑盒 —種檢測待測樣品中有機磷存在與否的試劑盒，該試劑盒中含有 容器1，以及裝于該容器中的實施例4制備的固定有所述表面展示乙酰膽堿酯酶
的酵母細胞的凝膠珠，其存在于SC培養(yǎng)基中； 容器2，以及裝于該容器中的碘化乙酰膽堿(ATchI); 容器3，以及裝于該容器中的顯色劑DTNB ; 以及，說明檢測方法的使用說明書。 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。 序列表 〈110〉中國科學院上海生命科學研究院 〈120〉 一種在細胞表面展示外源蛋白的方法及產(chǎn)品 〈130>087048
〈160>1 〈170>PatentIn version 3.3 〈210>1 〈211>2817 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈220〉 〈221>misc_feature 〈223>融合基因 〈400>1atgcaactgttcaatttgcctcattctttctcgtcctctcttecttttct60ttgctcgtttctgctetcgatcgcctggtccctccggacctgtecgcggt120cgctccgtgacggtgc郷gc郷g郷tgcatgtctecacgggcatcccctecgccaag180ccgcccgtcgaggacctgcgcttccgaaagccggttcccgcggagccatggcacggcgtc240ctcgacgccacgcggttetccgccacctgcgtcc皿gagcgttecgagtecttccccggc300ttctccggcg郷卿tctgg皿cccc皿caccaacgtgtccgaggactgcctctecate360朋tgtctgggcgccggca朋ggcccgacttcgccatgggcggggtgc咖cgggggtgag420caccccaatggC3朋C3ggCggacactgaccatctcatcctccgcagaac■3Cg3CC朋Cggactgccgattctgatctggatctetggcggtggcttcatgaccggatcg540gccaccctggtgcggatetcatgaccgccgtggg咖tgt皿tegtggcc600tccttccagtatcgggtgggagcttttgggttcttgcacctggcgccggaaatgccgtcg660g朋ttcgcgg皿gaggcgcccgg咖tgtgggcctetgggatcaggcactcgccattcgc720tggctgaaggacaacgctcatgccttcggcgga皿tccggactgttcgga780gagtcggctggatccagttcggtg皿tgcccagctcatgtcgccggtgacg郷ggtctg840gtcaagcgcgg^tgatgcagtcgggcactatgaacgccccctggagccacatgacctcc■g卿郷ccgtgg卿tcggc皿ggcgctgatcaacgactgc皿ctgc皿tgcatctetg960Ctg朋g3CC3atcccgctcacgtgatgagctgcatgcgttccgtggacgcc^gaccate1020tcggtgcagcagtgg朋ctcctectcgggcatcctcagctttccctcggcgcccaccatt1080gatggtgcgttcctgccggcggatcccatgacgctgatga卿cggcggatctg皿ggac1140tecgacatcctgatggg腿acttcttgctgtecgatttc1200atcgattacttcgat朋ggacgatgccacggccctgccacgggaca^tecctggaaatt1260atgaacaatatttttggcaaggc皿cgc皿gcgg雄gcgaggccatcattttccagtet1320accagttggg朋ggc朋tcctggctetcag皿CC3gC3gCa^tcggacgcgccgtgggc1380gatcacttcttcacctgcccC3CC皿Cg3gtetgcccaggctctggcggagcgaggcgct1440tccgtgcactactectactttacacaccgcacaagcacctcattgtggggcg皿tggatg1500ggcgtgctgcgatcg朋tecttctttggccagccgctg皿caactccctg1560cagtetcgacctgtggagcgtgagctgggc皿gcgtetgctcagtgcggtcattgagttt1620gcteagacgggaaatcccgctc郷atggcg郷賜tggcccaacttctcc皿ggaggat1680cccgtctactatettttcagcaccgacgat^gatcgaga皿ttggccaggggtcctttg1740
13
gcggctcgctgctcgttctgg皿tgattecggc郷tect1800tgcgatggcgattcggg皿gtgctgattet3tg3C皿ggCggccgctegc1860gcc皿皿gctcttttetctcaaccactectactgattteacactagtgcg1920tettccactggatccatttccac3gteg皿3C3ggC皿tCgaactecatc3g皿gtgatc1980agcratgtggtgacteccagcac皿朋ctgtctccaactgctecteccagcctgacaatt2040gC3C皿3CC3gtetctattctactgactca皿tetcac3gtegg皿c3gatettcacacc2100tgattegtgatgtgg朋3CC3ttegcag3gaaacagcttcgaccgttgta2160gccgctccaacctc皿c皿ctggatgg織ggcgctetgaatecttecatctcgcaattt2220acatcctcttctttcgcaac朋tc皿cagctctcttcatcagcagtettt2280atgcttcaattgtcaatgtgatetcacg朋tectgctgct2340gttccatctg朋gagcccacttttgtaaatgCC3Cg3g皿actcctteaattccttctgc24003gC3gC朋3Cagccatccagtccctcatcttetecgtcttccccactcgtatcgtccctc2460tccgteagca朋gC3CC3gttttecgccttctgtgccaac2520cga皿朋tecgggttectttg3gC3C3Cggctttgacaacatcttcagtt2580ggcctteattcttttegtga朋C3gC3gtCtcatctcaggtgacaccttt2640ttagtgtcatccttgatcgcatetccttcttctgcatcaggtccggtetc2700tcacatcaacttctctcatgatttcaacctatg朋ggteaagcgtcteta2760tttttctcagctgagctcggttcgatcatttttctgcttttgtcgtecctgctettc281權利要求
一種基因構建物，其特征在于，所述基因構建物從5’到3’依次包括以下操作性相連的元件(a)葡萄糖淀粉酶信號肽編碼序列；(b)外源蛋白的編碼序列；和(c)酵母α凝集素基因C端錨定信號的編碼序列。
2. 如權利要求l所述的基因構建物，其特征在于，所述的外源蛋白選自受體蛋白、配體蛋白、酶蛋白或抗體蛋白。
3. 如權利要求2所述的基因構建物，其特征在于，所述的外源蛋白是乙酰膽堿酯酶。
4. 如權利要求3所述的基因構建物，其特征在于，所述的葡萄糖淀粉酶信號肽編碼序列是SEQ ID N0:l所示序列中第l-75位的序列；或所述的乙酰膽堿酯酶編碼序列是SEQ ID NO :l所示序列中第76-1824位的序列；或所述的酵母a凝集素基因C端錨定信號的編碼序列是SEQ ID NO:l所示序列中第1858-2817位的序列。
5. 如權利要求3所述的基因構建物，其特征在于，在元件(b)和元件(c)之間，包括一標簽蛋白編碼序列。
6. —種重組的表達載體，其特征在于，所述表達載體含有權利要求l-5任一所述的基因構建物。
7. —種細胞，其特征在于，所述的細胞是酵母細胞，所述細胞中含有權利要求6所述的表達載體；或其基因組中整合有權利要求1-5任一所述的基因構建物。
8. 如權利要求7所述的細胞，其特征在于，所述的酵母細胞選自釀酒酵母或畢赤酵母。
9. 如權利要求7所述的細胞，其特征在于，所述的基因構建物中，所述的外源蛋白的編碼序列是乙酰膽堿酯酶的編碼序列。
10. —種在細胞表面展示表達外源蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括(i) 將權利要求l-5任一所述的基因構建物導入到酵母細胞中，獲得重組細胞；(ii) 培養(yǎng)(i)的重組細胞，從而在細胞表面展示表達外源蛋白。
11. 一種檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括權利要求9所述的細胞；或固相載體，以及吸附或包埋在固相載體中的權利要求9所述的細胞。
12. —種檢測待測樣品中有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 將權利要求9所述的細胞固定于固相載體或懸浮于與所述細胞相容性的介質中，形成檢測體系；(2) 在(1)的檢測體系中加入待測樣品，混合；禾口(3) 檢測(2)的體系中乙酰膽堿酯酶的活性，從而確定待測樣品中是否含有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。
13. 如權利要求12所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，包括向步驟(2)的檢測體系中加入乙酰膽堿酯酶的底物，通過檢測乙酰膽堿酯酶對底物的水解情況確定待測樣品中是否含有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥或其含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在酵母細胞表面展示外源蛋白的方法及產(chǎn)品。本發(fā)明公開了一種基因構建物，所述的基因構建物在導入到細胞中后，可使得重組表達的外源蛋白在細胞表面展示。采用本發(fā)明的基因構建物以及表達系統(tǒng)，外源蛋白在細胞表面上的展示表達效果特別優(yōu)異，可保留良好的蛋白活性，方便地實現(xiàn)外源蛋白的固定化，并可簡化蛋白純化的繁瑣步驟。
文檔編號C12Q1/44GK101724649SQ20081020189
公開日2010年6月9日 申請日期2008年10月29日 優(yōu)先權日2008年10月29日
發(fā)明者專芳芳, 吳松潔, 王慧, 許誦辭 申請人:中國科學院上海生命科學研究院