專利名稱：：蠶電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及鱗翅目昆蟲家蠶(大造)的電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
：電壓門控鈉通道(VGSC)在神經(jīng)元以及其它可興奮性細(xì)胞動作電位形成和傳導(dǎo)過程中扮演著極為重要的角色。當(dāng)細(xì)胞膜去極化時(shí)，VGSC被電壓依賴性的激活，使胞外鈉離子選擇性通透進(jìn)入胞內(nèi)，形成動作電位的去極化相；VGSC在開放后幾個毫秒時(shí)段里就會失活，失活的VGSC需要回到靜息狀態(tài)后才能再開放(Catteml，1992)。VGSC的細(xì)微突變或變化，將影響生理功能的異常(Laietal.，2003)。哺乳動物鈉通道基因亞型較多，如Navl.l-Navl.9和NavX，而昆蟲鈉通道基因的亞型相對較少，只發(fā)現(xiàn)2種亞型，即；^ra基因和A9C基因。其中，僅/ara基因編碼的鈉通道在體外得以表達(dá)和功能鑒定，而ASU基因功能尚未得到鑒定(GoIdin，2002)。目前已克隆和測序的昆蟲para直系同源鈉通道基因(para-orthologoussodiumchannelgene)有果蠅(Draso盧7a靴/cmogtwfer)的para基因、家蠅(她5:ccic/麵es"o)的Kssc/基因(也稱Mc基因)、煙草頓蟲CHeto決^w'r^ce""的/wcp基因、德國小蠊(5/ato//agmnam'ca)的para，基因、東亞鉗蝎(5w/n^mw加"w7)的5mWav7基因以及虎紋捕鳥蛛(O"油o"o麵/j,函)的OZi/Vav7基因(Loughneyetal"1989;Inglesetal.,19%;Miyazakietal.,19%;Parketal.,1999Zuoetal.,2002)。昆蟲鈉通道存在于包括感覺神經(jīng)元在內(nèi)的昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)，一般不表達(dá)在肌肉組織。細(xì)胞水平上的研究表明，昆蟲鈉通道在神經(jīng)元的胞體與軸突上均有表達(dá)(Wicheretal.,2001)。鈉通道呈現(xiàn)出的亞型多樣性，為理解鈉通道在生理/病理下的功能特性及其動態(tài)平衡調(diào)控帶來了復(fù)雜性，同時(shí)，也正在引發(fā)通道藥理與毒理基因組學(xué)研究的挑戰(zhàn)性。在神經(jīng)系統(tǒng)中，各亞型的鈉通道通常共表達(dá)于同一個細(xì)胞上(例如DRG神經(jīng)元)，為了闡明各亞型參與的生理活動，有必要將各通道介導(dǎo)的電流成分分離，但由于鈉通道各亞型介導(dǎo)的宏觀電流性質(zhì)接近，單用不同刺激方式無法獲得單一電流；而體外表達(dá)雖可以獲得單一亞型的信息，但表達(dá)體系以及輔助亞基的存在與否都會對通道的性質(zhì)產(chǎn)生重大影響，而且失去了通道在體內(nèi)時(shí)的復(fù)雜環(huán)境，增加了對鈉離子通道認(rèn)識的難度以及應(yīng)用。例如，目前臨床上癲癇、神經(jīng)病理性痛等的治療藥物通常以鈉通道為靶器，但由于其選擇性不高，可能產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用；昆蟲鈉通道是DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的主要作用靶點(diǎn)，但長期使用和濫用會導(dǎo)致昆蟲產(chǎn)生抗藥性，昆蟲的para鈉通道基因突變與抗藥性密切相關(guān)(Williamsonetal.,1996;Soderlund&Knipple，2003)。因此，解析新型鈉通道亞型的基因編碼特征，不僅有利于各亞型生理功能的闡明與藥理價(jià)值的評估，同時(shí)也為鈉通道關(guān)聯(lián)的臨床疾病治療藥物以及高效生物殺蟲劑的研制提供理論的可行性和新分子先導(dǎo)物的開發(fā)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的之一在于提供一種家蠶電壓門控鈉通道基因。本發(fā)明的目的之二在于提供該電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供該電壓門控鈉通道基因的克隆方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種家蠶電壓門控鈉通道基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一(1)具有SEQNO1所示的DNA序列；(2)與序列表中SEQNOl限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。一種上述的家蠶電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白，其特征在于該編碼蛋白具有序列表中SEQNO2的氨基酸殘基序列或者是將SEQNO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQNO1的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQNO1衍生的蛋白質(zhì)。一種上述的家蠶電壓門控鈉通道基因的克隆方法，其特征在于該方法的具體步驟為a.從家蠶的腦中提取總RNA;b.用SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA;c.借鑒昆蟲Para鈉通道的保守氨基酸序列和家蠶基因組序列設(shè)計(jì)PCR引物，再采用PCR，得到家蠶鈉通道基因和完整開放閱讀框。圖1為家蠶鈉通道克隆策略。圖2為鈉離子通道的氨基酸序列比對圖。其中BomNav—家蠶；OhNavl—蜘蛛;para—果蠅；rNavl.2—鼠腦II型。具體實(shí)施方案實(shí)施例一電壓門控鈉通道基因的克隆1.家蠶腦總RNA的制備用Trizol抽提家蠶組織總RNA，具體方法如下(1)將家蠶蛹腦(約50mg)在液氮中碾磨成粉末狀后，轉(zhuǎn)移到一個無核酸酶的1.5ml離心管中；(2)加入lmlTrizol試劑，室溫下放置3分鐘；(3)加入200Wl的三氯甲垸，劇烈振蕩后，室溫下放置5分鐘；(4)4。C離心(12000rpm)15分鐘，取上清液，并轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中；(5)加入等體積的異丙醇，約500iil，室溫放置l-2小時(shí)；(6)4。C離心(12000rpm)15分鐘，棄上清液，得到白色沉淀；(7)加入lml75%的乙醇，清洗沉淀，略微振蕩后，4'C離心(7500rpm)5分鐘；(8)棄乙醇，37。C放置10分鐘，直到乙醇完全揮發(fā)；(9)加入50ulRnase-free水，溶解RNA。2.家蠶腦cDNA的合成在無核酸酶的PCR管中加入如下物質(zhì)oligodT:l.Ou1totalRNA:l.Oug將混合物65。C加熱5分鐘后，立刻冰上放置2分鐘，加入如下物質(zhì)dNTP(lOmMeach):2u15Xbuffer:4ulRnasin:1P1reverstranscriptase:1u1加水至20ul，混勻后，置PCR儀上按如下程序反應(yīng)；42。C90分鐘99。C5分鐘4°C10分鐘即得到逆轉(zhuǎn)錄的cDNA。3.鈉通道基因片段的克隆根據(jù)鈉通道四個保守區(qū)域的氨基酸組成，利用家蠶基因組草圖，檢索家蠶的同源片段，找到三個同源克隆AADK01011234;AADK01013170;AADK01001488。借鑒昆蟲Para鈉通道的保守氨基酸序列和三個同源克隆，設(shè)計(jì)克隆家蠶鈉離子通道基因的PCR引物，得到各保守片斷S3,S4,S5(PCR儀為PE-2400(Perkin-Elmer，USA));根據(jù)克隆到的保守序列，利用家蠶基因組中相關(guān)的三個同源克隆，設(shè)計(jì)5'端和3'端PCR引物，用PCR的方法的到S1,S2，S6的片段，把S1到S6拼接即得到家蠶鈉通道的完整開放閱讀框的序列。設(shè)計(jì)的各片斷的PCR引物序列見表1。表l:PCR引物及所克隆出的片段<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>實(shí)施例二測序前準(zhǔn)備1.電泳將PCR產(chǎn)物，在1.2%瓊脂糖凝膠，1倍的TAE的電泳緩沖液中，5V/cm電壓下電泳30分鐘左右，在紫外燈下檢測條帶。2.割膠回收具體步驟如下(1)在紫外燈下，用刀片將目的條帶切下，并轉(zhuǎn)移到無菌的1.5ml離心管中，稱重;以每IOOmg膠加入200ul溶膠液后，55。C加熱5分鐘，直至膠塊溶解；(2)膠融化后，將其轉(zhuǎn)入到一個收集管的凝膠吸附柱中，室溫放置2分鐘后，室溫離心(12000rpm)1分鐘；(3)取下凝膠吸附柱，棄收集管中的廢液，在將吸附柱放回后，加入700ul漂洗液，室溫離心(12000rpm)1分鐘；重復(fù)步驟(3)—次；(4)棄收集管中的廢液后，室溫離心(12000rpm)2分鐘;(5)取下吸附柱，將其轉(zhuǎn)入新的無菌的離心管中，37。C放置5分鐘，直至乙醇完全揮發(fā)；(6)加入55。C預(yù)熱的洗脫緩沖液35yl，室溫放置2分鐘，室溫離心(12000rpm)2分鐘，離心管中即為所要回收的DNA片段。3.回收片段連接到T載體在無菌的1.5ml離心管中加入如下物質(zhì)PCR回收產(chǎn)物l.Oul連接液(含連接酶和緩沖液)5.0iUPMD19T-vector:1.On1滅菌蒸餾水3.0ul合計(jì)10Ul混勻后，16'C放置12小時(shí)。4.轉(zhuǎn)化(1)從-7(TC冰箱中取100u1感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上；(2)加入連接產(chǎn)物(含量不超過50ng，體積不超過10ul)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘；(3)42'C水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5分鐘；(4)向管中加入500ulLB液體培養(yǎng)基(不含安卞青霉素)，混勻后37'C振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因；(5)將上述菌液搖勻后取100yl涂布于含安卞青霉素的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37'C培養(yǎng)16-24小時(shí)。5.質(zhì)粒的抽提(1)細(xì)菌培養(yǎng)液置于1.5ml離心管內(nèi)，冰上放置10分鐘，室溫離心(12000rpm)1分鐘，棄上清；(2)細(xì)菌懸浮于250ul溶液I中，劇烈振蕩，至細(xì)菌徹底懸?。?3)向離心管中加入250ul溶液n，溫和的上下翻轉(zhuǎn)4-6次，使細(xì)菌充分裂解；(4)向離心管中加入350ul溶液m，溫和的上下翻轉(zhuǎn)6-8次，完全混勻，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。室溫離心(12000rpm)IO分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀；(5)小心的將上清轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2分鐘，室溫離心(12000rpm)l分鐘，室溫放置2分鐘，室溫離心(12000rpm)1分鐘，倒掉收集管中的廢液，并將吸附柱重新放回收集管；(6)向吸附柱加入700ixl漂洗液，室溫離心(12000rpm)1分鐘，重復(fù)一次；(7)將吸附柱放回收集管中，室溫離心(12000rpm)2分鐘；(8)將吸附柱轉(zhuǎn)移到一個新的1.5ml離心管中，37。C放置5分鐘，直至乙醇完全揮發(fā)；(9)向吸附柱加入35ul洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘后，室溫離心(12000rpm)2分鐘，離心管中收集到的即是所需質(zhì)粒。6.測序?qū)⑸鲜龀樘岬馁|(zhì)粒進(jìn)行測序。家蠶電壓門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)特征分析1.家蠶電壓門控鈉離子通道結(jié)構(gòu)特征分析家蠶電壓門控鈉離子通道(BomNav)蛋白質(zhì)內(nèi)部有四個高度保守的同源結(jié)構(gòu)域(Dl-D4)，且每一結(jié)構(gòu)域含有六個a螺旋跨膜片段(S1-S6)，具有電壓門控鈉通道的所有關(guān)鍵性的結(jié)構(gòu)1)BomNavl的S4片段具有鈉通道電壓感受器的共性，即在每隔2個疏水殘基有一個帶正電的Arg或Lys殘基，且堿性氨基酸殘基數(shù)目和位置基本對應(yīng)；2)BomNav與其它昆蟲電壓門控鈉通道蛋白在結(jié)構(gòu)域TTT和IV之間的短鏈胞內(nèi)環(huán)處(鈉通道失活化門控域)高度保守，它們在對應(yīng)于哺乳動物鈉通道rNav1.2的三個關(guān)鍵殘基I,棚-F，-M，處也存在三個疏水性殘基(MFM);3)B顧av蛋白分子中形成鈉通道選擇性過濾器的胞內(nèi)環(huán)(DEKA)和胞外環(huán)(EEDD)以及與TTX結(jié)合的關(guān)鍵殘基也都是保守的。通過氨基酸序列比對結(jié)果表明，我們克隆到的家蠶基因?qū)儆陔妷洪T控鈉離子通道的基因。2.電壓門控鈉離子通道蛋白序列比對圖2為家蠶鈉離子通道(BomNav)與蜘蛛(OhNavl)，果蠅(para),鼠腦II型(rNavl.2)電壓門控鈉離子通道基因所編碼蛋白序列比對圖。同源結(jié)構(gòu)域(D1-D4)黃色背景標(biāo)記，跨膜片段用框標(biāo)注,S4中電壓感受器中正電荷氨基酸殘基用上劃線P標(biāo)出。序歹U表<110>上海大學(xué)〈120〉蠶電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法<160><210〉1<211>20<212>人工序列<213>引物Navl2s5'2<400>15'-TCCTCCATTGCCTTGAAACA-3，<210>2<211>20<212>人工序列<213>引物Navl2a5'l<400>25'-CATCATCGTAACGCACTTCT-3'<210>3<211>18<212>人工序列<213>引物naV10s5'2<400>35'-TCAGCGAGGAAGAACGAA-3'<210>4<211>24<212>人工序列<213>引物NaV7a5，1<400>45'-TCTATAACAGCACCGACGATCGTC-3，<210〉5<211>20<212>人工序列<213>引物NaV4sl<400>55'-TGGAATTGGCTTGACTTCGT-3'<210>6<211>23<212>DNA<213>引物NaV5as1.1<400>65'-CCCATCACCGCAAATATGAAAAT_3<210>7<211>23<212>人工序列<213>引物NaV4s2.2<400>75'-ATCATTATTTTCATATTTGCGGT-3'<210>8<211>23<212>人工序列<213>引物NaV4as2<400>85'-TTAGAACCCATTTTCTTCATGGC-3<210>9<211>22<212>人工序列<213〉引物NaV4s3.2<400>9'5'-GTGATCATCGACAACTTCAACG-3'<210>10<211>20<212>人工序列<213>引物NaV4as3<400>105'-ATGACGGCGATGTACATGTT-3'<210>11<211>22<212>人工序列<213>引物Navl0s3'2<400>115，-TGTCATTTCTTTTCTCATCGTC-3'<210>12<211>18<212>人工序列<213>引物Navl7a3'l<400〉125,_TTTCGGTACATTGACGTTTT—3<210>13<211>412<212>DNA<213>Sl<400>131tcctccattgccttgaaacatgtt￡Lt3Cttacgttcaac3atagtttacttttctg朋tt61tagtaa犯cg肌tgtgcgtgcgt犯aacag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