專利名稱：：血管抑素受體β亞基人源化嵌合及人抗體、其制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗體，具體涉及血管抑素受體e亞基人源化嵌合及人抗體、其制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：血管抑素受體(AngiostatinRec印torF1F0-ATP合成酶)對腫瘤細(xì)胞中ATP合成起重要作用。在正常人體組織中，血管抑素受體主要在線粒體內(nèi)膜上定位，但也有少量存在于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上。相對而言，很多腫瘤細(xì)胞超量表達(dá)血管抑素受體，并大量定位于細(xì)胞膜上。因而腫瘤細(xì)胞膜上的血管抑素受體是一個潛在的抗腫瘤藥物靶標(biāo)。傳統(tǒng)認(rèn)為，血管抑素受體(ATPsynthase)是僅存在于真核細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上的多亞單位復(fù)合酶分子，在氧化磷酸化的過程中，利用電子傳遞鏈酶復(fù)合體建立的質(zhì)子動勢合成ATP，是一個將ATP合成與水解(由Fl亞單位介導(dǎo))同質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)裝置的旋轉(zhuǎn)(由F0亞單位介導(dǎo))耦聯(lián)的機(jī)械化學(xué)酶。該酶由脂溶性的、鑲于線粒體內(nèi)膜中的定位復(fù)合體FO和水溶性的、基質(zhì)側(cè)的合成復(fù)合體F1構(gòu)成。F0由a、b、c、d、e、f、g、A6L、OSCP及偶聯(lián)因子6等亞基構(gòu)成，其中a、b、c為主要構(gòu)成亞基。Fl由亞基a、|3、y、S、e構(gòu)成，其比例為3:3:1:1:i，其中a、e亞基成對存在，該酶的催化位點(diǎn)就位于e亞基。FO是質(zhì)子通道，F(xiàn)1的正常功能是合成ATP，在缺乏質(zhì)子梯度時F1具有水解ATP的非正常生理功能。FO的a亞基含有兩個局部通道，質(zhì)子若要跨膜，需經(jīng)其中一個通道進(jìn)入a亞基的中心，結(jié)合眾多c亞基中的一個，并經(jīng)c亞基的旋轉(zhuǎn)被轉(zhuǎn)移到a亞基的另一個通道。c亞基錨定于Fl的Y亞基(轉(zhuǎn)子的構(gòu)成部分)，而a亞基通過b亞基(定子)錨定于a3l33六聚體。因此，F(xiàn)O上c亞基相對于a亞基的轉(zhuǎn)動將帶動Fl上Y亞基相對于a3133六聚體的轉(zhuǎn)動，合成ATP。IF1(inhibitorofFl)是Fl的內(nèi)源性抑制因子，抑制其ATP水解活性。近年發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶不僅存在于線粒體內(nèi)膜，在內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞質(zhì)膜表面也有表達(dá)。1995年，Mozer和Pizzo對血管抑素(環(huán)餅域1_3)在內(nèi)皮細(xì)胞表面的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。通過對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)膜組分進(jìn)行配體雜交，成功分離了與血管抑素結(jié)合的，大小約55kD的蛋白。通過對蛋白進(jìn)行氨基末端測序、肽指紋圖譜及免疫學(xué)分析表明，抗腫瘤血管新生藥血管抑素在該細(xì)胞表面的受體為人血管抑素受體的亞基(基因名分別為ATP5A1和ATP5B)。這一受體在細(xì)胞表面的存在通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光分析得到了證實。另外，血管抑素能與重組ATP5A1結(jié)合，抗ATP5A1的抗體能將血管抑素的抗細(xì)胞增殖效果抑制掉90%。綜上所述，細(xì)胞表面的ATP5A1/ATP5B是血管抑素在內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，血管抑素可能通過與ATP5A1/ATP5B亞基的結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制血管新生。在Mozer的研究公開前，關(guān)于血管抑素受體在細(xì)胞膜表面定位的報道僅有一例，是定位于腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)549的表面。在Mozer的研究公開后，血管抑素與細(xì)胞表面ATP合成酶的結(jié)合，又被其它的研究團(tuán)體在不同的腫瘤細(xì)胞類型證實。在除內(nèi)皮細(xì)胞外的許多其它類型細(xì)胞，包括腫瘤細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞都發(fā)現(xiàn)了定位于細(xì)胞膜表面的血管抑素受體，這些類型的細(xì)胞都具有較強(qiáng)的增殖力，而在紅細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)。這提示膜表達(dá)的人血管抑素受體可能具有促增殖作用，不僅是腫瘤的標(biāo)志，還可能是癌變的促因，這對腫瘤的早期診斷和預(yù)后具有重大的意義。如果能成功驗證膜表達(dá)的人血管抑素受體對腫瘤的促進(jìn)作用，將使其腫瘤靶標(biāo)的地位進(jìn)一步鞏固，并可針對其促增殖功能設(shè)計相應(yīng)的藥物進(jìn)行抑制，以期特異高效地治療腫瘤。Chi等用純化的E.coliF1-ATP合成酶免疫小鼠，得到21株單克隆抗體(mAb)，其中只有一株mAb是針對催化亞基ATP5B的，其余20株均是針對非催化亞基ATP5A1的，而只有針對13亞基的那株mAb具有抑制Fl-ATP合成酶活性的作用。但是該mAb為鼠源性，在人體中極易產(chǎn)生人抗鼠抗體(HAMA)反應(yīng)，使mAb用于治療的研究受到限制。嵌合抗體是通過基因工程將鼠源單抗可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)拼接的抗體，相對于其它人源化抗體的優(yōu)點(diǎn)在于其技術(shù)路線簡單；抗體完整性好，體內(nèi)潴留期長。利妥昔單抗(rituximab)于1997年獲得FDA批準(zhǔn)，是全球第一個上市的抗腫瘤mAb藥物，用于治療CD20陽性的B淋巴細(xì)胞性非霍奇金淋巴瘤，該抗體就是一個嵌合抗體。第一個用于臨床的嵌合抗體是阿來組單抗(alemtuzumab)，用于治療非何杰金氏淋巴瘤和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。曲妥珠單抗(trastuz咖ab)于1998年獲批，是一種可以抑制HER-2/neu陽性乳腺癌的mAb藥物，該抗體是一個人源化抗體。吉妥單抗(gemtuz咖abozogamicin)于2000年獲批，用于治療CD33陽性的急性復(fù)發(fā)性髓性白血病，該抗體也是一個人源化抗體。近年來，先后獲批用于治療月中瘤的抗體藥物還有90Y_ibritumomab、1311—tositumomab、cetuximab禾卩bevacizumab等，其中嵌合或人源化的抗體所占的比例逐年提升，全人抗體已成為治療類抗體在抗體類型上必然趨勢。目前已有超過20種嵌合抗體已進(jìn)入臨床試驗階段，還有為數(shù)眾多的嵌合或人源化抗體處于臨床前研究中。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體，其制備及應(yīng)用。本發(fā)明一方面提供了一種血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體，其重鏈為鼠抗人血管抑素受體P亞基單克隆抗體的重鏈信號肽區(qū)、鼠抗人血管抑素受體P亞基單克隆抗體的重鏈可變區(qū)與人IgGl的重鏈恒定區(qū)嵌合獲得，其輕鏈為鼠抗人血管抑素受體13亞基單克隆抗體的輕鏈信號肽區(qū)、鼠抗人血管抑素受體P亞基單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)與人IgGl的輕鏈恒定區(qū)嵌合獲得。上述鼠抗人血管抑素受體e亞基單克隆抗體的重鏈信號肽區(qū)的氨基酸序列為SEQIDN0:4，鼠抗人血管抑素受體13亞基單克隆抗體的輕鏈信號肽區(qū)的氨基酸序列為SEQIDN0:3。上述鼠抗人血管抑素受體13亞基單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDN0:l，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:2。上述人IgGl的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:5，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:6。較佳的，上述人源化嵌合抗體的重鏈氨基酸序列為SEQIDNO:7，輕鏈氨基酸序列為SEQIDNO:9。本發(fā)明第二方面，提供了一種多核苷酸序列，其編碼上述血管抑素受體13亞基人5源化嵌合抗體的輕鏈。較佳的，編碼血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列為SEQIDNO:10。本發(fā)明第三方面，提供了一種表達(dá)載體，其含有編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列。本發(fā)明第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其被上述載體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明第五方面，提供了一種多核苷酸序列，其編碼血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈。較佳的，上述編碼血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈的多核苷酸序列為SEQIDNO:8。本發(fā)明第六方面，提供了一種表達(dá)載體，其含有編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈的多核苷酸序列。本發(fā)明第七方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其被上述載體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明第八方面，提供了一種多核苷酸序列，其同時含有編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈和編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列。較佳的，上述編碼血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈和編碼上述血管抑素受體P亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列串聯(lián)。較佳的，上述多核苷酸的序列為SEQIDNO:11。本發(fā)明第九方面，提供了一種表達(dá)載體，其同時含有編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈和編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列。本發(fā)明第十方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其被上述載體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明第十一方面，提供了血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的制備方法，包括下列步驟1.在適合表達(dá)血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的條件下，培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；2.從培養(yǎng)物中分離出具有血管抑素受體13亞基抗體活性的多肽。本發(fā)明第十二方面，提供了血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明中的表達(dá)載體指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。本發(fā)明中的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO，或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。本發(fā)明通過選擇|3亞基構(gòu)建表達(dá)克隆，表達(dá)純化了13亞基蛋白，并以此為抗原獲得了抗人血管抑素受體P亞基的單克隆抗體雜交瘤。在此基礎(chǔ)上，采用嵌合抗體構(gòu)建方法對其進(jìn)行人源化基因工程改造，并在CH0-DG44細(xì)胞中實現(xiàn)人鼠嵌合抗體的表達(dá)。篩選后獲得持續(xù)分泌抗人P亞基人鼠嵌合抗體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，為靶向人P亞基的腫瘤免疫治療提供了必要的前期物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明的嵌合抗體親和力高，且與鼠源的單克隆抗體相比具有更低的免疫原性。圖1ATP5B的克隆1-2:RT-PCR結(jié)果，1:P-actin，2:ATP5B;3-7:PCR檢測ATP5B插入，4，5，7:包含插入片段的陽性克?。?-11:酶切鑒定陽性克隆8:酶切前的質(zhì)粒，9:SacI酶切，10:HindIII酶切，11:SacI和HindIII酶切，證實讀框正確;12:DNAmarker.圖2重組人ATP5B的表達(dá)，純化及復(fù)性1:PageRulerTM預(yù)先染色的蛋白梯(prestainedproteinladder)，2:未誘導(dǎo)的細(xì)胞裂解液，3:誘導(dǎo)后的細(xì)胞裂解液，4:細(xì)胞裂解液上清，5:包涵體，6:變性的包涵體，7:親和純化的rhATP5B，8:純化并復(fù)性的rhATP5B.圖3Westernblot鑒定表達(dá)的rhATP5B蛋白1:PageRulerTM預(yù)染色的蛋白梯(prestainedproteinladder)，2:BL21(DE3)裂解液，3:誘導(dǎo)前的裂解液，4:誘導(dǎo)后的裂解液，5:包涵體；6:純化的rhATP5B.圖4mAb7A8的Westernblot分析1:HUVE細(xì)胞的總蛋白與制得的鼠mAb7A8反應(yīng)；2:純化的rhATP5B與商業(yè)化的鼠ATP5BmAb抗體反應(yīng)作為陽性對照；3:HUVE細(xì)胞總蛋白與二抗直接反應(yīng)，不加7A8作為陰性對照.圖57A8的免疫熒光鑒定A:HUVE細(xì)胞與DAPI反應(yīng)，B:HUVE細(xì)胞與制得的鼠7A8mAb及DAPI反應(yīng)圖6mAb7A8的IHC分析A:在肺癌組織切片中，IHC分析鼠mAb7A8，陽性信號主要出現(xiàn)在肺癌細(xì)胞表面及細(xì)胞質(zhì)中(Envision,DAB，brown);B:不加7A8作為陰性對照.圖7mlOGFab區(qū)的擴(kuò)增1:DNAMarker,2:m7A8IgGl重鏈的Fab區(qū)擴(kuò)增帶，3:用針對IgG2a設(shè)計的引物從m7A8cDNA中擴(kuò)增，4:用針對IgG3設(shè)計的引物從m7A8cDNA中擴(kuò)增，5:m7A8IgGlk鏈的Fab區(qū)擴(kuò)增帶.注意，此處針對IgG2a或IgG3的無擴(kuò)增帶圖8m7A8重、輕鏈可變區(qū)序列分析A:重鏈可變區(qū)，B:輕鏈可變區(qū)，CDR用紅線表示圖9m7A8前導(dǎo)肽區(qū)和人IgGl恒定區(qū)的擴(kuò)增1:DNAMarker,2:人k鏈恒定區(qū)擴(kuò)增帶，3:人IgGl重鏈恒定區(qū)擴(kuò)增帶4:m7A8k鏈前導(dǎo)序列擴(kuò)增帶，5:m7A8IgGl重鏈前導(dǎo)序列擴(kuò)增帶圖10S0E-PCR拼接的c7A8嵌合重、輕鏈1:拼接的m7A8k即paL-V區(qū)；2，4，9:DNAMarker;3:拼接的整條嵌合k鏈；5:m7A8IgGl重鏈前導(dǎo)序列；6:m7A8IgGl重鏈可變區(qū)；7:m7A8IgGl重鏈恒定區(qū)；8:拼接的整條嵌合IgGl重鏈圖11嵌合重、輕鏈的測序驗證A:c7A8嵌合重鏈，B:c7A8嵌合輕鏈，鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)已標(biāo)記圖12:構(gòu)建pCI-dhfr-LH-c7A8-L，圖13:構(gòu)建pSEC-c7A8-H，圖14:構(gòu)建pCI-dhfr-LH-c7A8.具體實施例方式ATP5B是ATP合成酶的催化亞基，具有ATP的合成與水解活性。Chi等制備的一株識別ATP5B催化活性位點(diǎn)的單克隆抗體(mAb)3D5AB1，其內(nèi)皮細(xì)胞血管分化抑制活性比血管抑素更強(qiáng)，故ATP5B可作抑制腫瘤血管新生的靶標(biāo)。本發(fā)明用RT-PCR方法獲得了ATP5B成熟肽的編碼序列，將其克隆入攜帶His-tag的原核表達(dá)載體pET28a(+)中，并在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化及復(fù)性。嵌合抗體可變區(qū)基因的克隆，參考Kabat數(shù)據(jù)庫中的抗體序列，針對抗體可變區(qū)的保守區(qū)域設(shè)計若干套通用引物，采用RT-PCR法從雜交瘤細(xì)胞株的mRNA擴(kuò)增可變區(qū)基因，5'端通用引物設(shè)計在第一骨架區(qū)或前導(dǎo)肽區(qū)；3'端通用引物設(shè)計在恒定區(qū)或J鏈區(qū)。嵌合抗體恒定區(qū)由抗體亞型決定，不同的亞型具有不同的免疫效應(yīng)，故可根據(jù)需要的免疫效應(yīng)選擇不同的亞型恒定區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。IgGl適于介導(dǎo)抗體依賴的細(xì)胞毒作用(ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用(CDC)，而IgG2和IgG4則適于激活或阻斷某一受體。抗體的恒定區(qū)不僅能提供效應(yīng)功能，還能通過于組織細(xì)胞表面的IgGFc受體FcyRn結(jié)合，免受蛋白酶類降解，在體內(nèi)保持較長半衰期(20多天)。嵌合抗體的重輕鏈表達(dá)單位可串聯(lián)于一個表達(dá)載體上，也可分別構(gòu)建于兩個載體上共轉(zhuǎn)染，有文獻(xiàn)報道，串聯(lián)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子中產(chǎn)生抗體的克隆的比例，顯著高于共轉(zhuǎn)染表達(dá)載體。目前用于增加目的基因擴(kuò)增的篩選標(biāo)志主要有二氫葉酸還原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)兩種。而用于臨床治療用抗體表達(dá)的系統(tǒng)主要是CHO細(xì)胞系統(tǒng)，該系統(tǒng)能為嵌合抗體的恒定區(qū)提供有效的糖基化。下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆試驗手冊(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實施例1血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的制備及檢驗1材料1.1質(zhì)粒載體表1實驗中所用的質(zhì)粒載體載體用途載體名稱基因克隆與測序pMD19-T(TaKaRa)原核表達(dá)pET28a(+)(Novagen公司)真核表達(dá)抗體pCI-dhfr-LH構(gòu)建真核表達(dá)載體的中間載體pSEC1.2宿豐菌表2實驗中所用的宿主菌<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.3細(xì)胞株表3實驗中所用的細(xì)胞株<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.4實驗動物表4實驗動物<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1.5引物表5實驗中所用引物(上海捷瑞公司合成)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>區(qū)mouse-kappa-1eading-5CCAAGACCGACAGGCAGGGAGmouse-kappa-1eading-3CAAGACATCMCTTCACCCATTGTC擴(kuò)增人恒定區(qū)鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)拼接引入克隆酶切位點(diǎn)CH-5'CH-3'CL-5'CL-3'IgG卜VC-5'IgGl-VC-3'kappa-VC-5，kappa-VC-3，pSEC-7A8H-5'pSEC-7A8H-3'pCI-dhfr-LH-7A8L-5'pCI-dhfr-LH-7A8L-3'CTAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGGGAACGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCGCTCTAGACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCGGCACCATTCTCACAGTCTCCTCAGCTAGCACCATGGGCCCTTGGTGCTAGCTGAGGAGACTGGGCACCAAGCTGGAAATCMACGAACTGTGGAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGATTTCCCCGGAATTCGCCACCATGAMTGCAGC(EcoRI)AAGG嵐MAGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGA(NotI)CTAGCTAGCGCCACCATGAAGTTGC(NheI)TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTTTTTCCTTCGACGCGTCGCTMCACTCTCCCCTGTTGAAGC(NotI，MluI)1.6豐要試劑1)DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量DGL2000(北京鼎國公司)2)凝膠回收純化試劑盒(上海華舜公司)3)限制性內(nèi)切酶，T4連接酶(NEB公司)4)去內(nèi)毒素質(zhì)粒小抽試劑盒(北京博大泰克公司)5)LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/1，NaCl10g/L，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15g/L。6)Lipofect咖ine2000(Invitrogen公司)7)胎牛血清(GibcoBRL公司)8)10X磷酸鹽緩沖液(PBS):NaCl40g/L，KCllg/L，Na2HP045.75g/L，KH2P04lg/L，調(diào)pH至7.4，ddH20定容，12TC高壓蒸汽滅菌20min備用。9)胰酶-EDTA消化液胰酶2.5g/L，EDTA0.2g/L，1XPBS定容，過濾除菌。10)RPMI-1640，F(xiàn)12，EX-CELL302等細(xì)胞培養(yǎng)基，過濾除菌。ll)TRIzol試劑(Invitrogen公司)12)Superscriptni反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司)13)ChelatingS印haroseFastFlow型填料(GE公司)14)10K麗C0型透析袋(Pierce公司)11:0095]:0096]:0097]:0098]:0099]:0100]:0101]:0102]:0103]:0104]:0105]:0106]15)鼠抗人ATP5BmAb(BDBiosciences公司)16)HRP-羊抗鼠IgG，HRP-羊抗兔IgG(北京鼎國公司)17)熒光素-羊抗兔IgG(Invitrogen公司)18)SDS-PAGE膠配方12X分離膠(20ml)5X濃縮膠(10ml)H2030%丙烯酰胺6.6ml8.Oml6.8ml1.7mlTris-HCl腦SDS腦APSTEMED5.Oml(1.5M，pH8.8)1.25ml(1.0M，pH6.8)0.2ml0.2ml8ii10.1ml0.1ml10li119)5XTris-Gly電泳緩沖液Tris-Base15.lg/L，Gly94g/L，10%SDS50ml/L，ddH20定容。20)2XSDS-PAGE上樣緩沖液0.5MTris-HCl2.Oml，甘油2.Oml，20%(W/V)SDS2.Oml，0.1%(W/V)溴酚藍(lán)0.5ml，P-巰基乙醇1.Oml，ddH20定容至10ml。21)SDS-PAGE染色液甲醇45ml，冰乙酸10ml，考馬斯亮藍(lán)R2500.25g，ddH20定容至100ml。22)SDS-PAGE脫色液甲醇45ml，冰乙酸10ml，ddH20定容至100ml。23)超聲緩沖液:TritonX-10010g/L，PMSF1,1/L，pH8.5，PBS定容。24)包涵體洗滌液尿素2mol/L，ddH20定容。25)包涵體溶解液尿素8mol/L，ddH20定容。26)rhATP5B復(fù)性緩沖液:100ml/Lglycerol,pH7.5，PBS定容。27)Westernblot轉(zhuǎn)膜緩沖液Tris-Base3g/L，Gly14.4g/L，甲醇100ml/L，ddH20定容。28)PBST洗滌緩沖液Tween-200.5ml/L，PBS定容。29)脫脂牛奶封閉緩沖液脫脂奶粉5g，Westernblot洗滌緩沖液定容至100ml。1.7實驗儀器1)iCycler型PCR循環(huán)擴(kuò)增儀器(Bio-Rad公司)2)5417R型臺式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)3)EPS-100型核酸電泳儀(上海天能公司)4)JS380-A型凝膠成像系統(tǒng)(上海培清公司)5)HZ_C型臺式恒溫振蕩器(江蘇太倉科教儀器廠)6)微量加樣器1000ii1/200ii1/20ii1(Eppendorf公司)7)7700型實時熒光定量PCR儀器(ABI公司)8)HERAce11150型C02培養(yǎng)箱(Heraeus公司)9)CX41-32RFL型熒光顯微鏡(Olympus公司)10)VE-186型轉(zhuǎn)移電泳槽(上海天能公司)1.8計算機(jī)分析軟件1)NBCI:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastN，blastP，blastX2)ExPASY:http://www.expasy.org3)0RFFinder:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/4)SMART:http://smart,embl-heidelberg.de/5)PS0RTII:http:〃psort.nibb.ac.jp/psortll/6)VECTORNTIVersion10.0，DNAssistVersion1.0等序列分析軟件7)PhotoshopVersion6.0等圖象處理軟件1.9縮略詞英文縮寫英文全稱中文全稱ADCCAPSATP5Bantibody-dependentcell-mediatedcytotoxicityammoniumpersulfateF1F0-ATPsynthase0subunit抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用過硫酸銨血管抑素受體P亞基13CDCcomplement-dependentcytotoxicity補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用CH0Chinesehamsterovarycell中國倉鼠卵巢細(xì)胞c腿complementaryDNA互補(bǔ)DNADAPI4'，6-diamidino-2-phenylindole4'，6-二脒基-2-苯基吲哚DHFRdihydrofolatereductase二氫葉酸還原酶DTT1，4-dithiothreito11，4-二硫蘇糖醇ELISAenzyme-linkedimmunosorbentassay酶聯(lián)免疫吸附試驗FBSfetalbovineserum胎牛血清GSGlutaminesynthetase谷氨酰胺合成酶HAMAhumananti-mouseantibody人抗鼠抗體HUVEChumanumbilicalveinendothelialcell人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Igimmunoglobulin免疫球蛋白mAbmonoclonalantibody單克隆抗體m腿messageRNA信使RNAORFopenreadingframe開放閱讀框PBSphosphate-bufferedsaline磷酸鹽緩沖液PCRpolymerasechainreaction聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCRreversetranscriptase-polymerasechainreaction反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SDS-PAGEsodiumdodecylsulfate-polyacrylamideelectrophoresis聚丙烯酰胺凝膠電泳TEMEDN，N，N'，N'-tetramethylethylenediamineN，N，N'，N'-四甲基二乙胺2.ATP5B基因的原核表達(dá)、純化與復(fù)性2.1RT-PCR擴(kuò)增ATP5B成熟肽編碼序列分離人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，分離方法見文獻(xiàn)(劉秋英，張美英，羅新，etc.人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)及rhNDPK-A對其增殖的作用[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，(03):257-261.)。HUVEC的cDNA制備用TRIzol試劑抽提細(xì)胞株MCF7、MCF7/Adr、MDA_MB_231、MDA_MB_435、MCF10F的總RNA，操作按TRIzol試劑說明書，簡要的步驟如下收集1Xl(f細(xì)胞，10000g離心lmin，吸棄上清。加入lmlTRIzol充分溶解細(xì)胞，室溫靜置5min后12000g離心lOmin，取上清。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，4。C下12000g離心15min，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中。加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，4。C下12000g離心10min，棄上清，75%乙醇洗滌兩次，空氣干燥，加入50ii1DEPC處理水溶解沉淀。對抽得RNA反轉(zhuǎn)錄，得這5株細(xì)胞的cDNA，操作按Superscripts反轉(zhuǎn)錄試操作。RT擴(kuò)增體系如下總RNA模板5iig50iiMoligo(dT)201ii10.1MDTT2ii110XBuffer2ii110mM(each)d證1ii125mMMgCl224ii1RNaseOUT(40U/ii1)1ii1Superscripts酶(200U/ii1)1ii1DEPC-treatedddH20to20.0illRT擴(kuò)增條件為50°C/lh—85°C/5min，所得產(chǎn)物cDNA凍于-20。C備用。ATP5B成熟肽編碼序列的PCR擴(kuò)增體系與擴(kuò)增條件PCR擴(kuò)增體系如下cDNA模板1ii1lOiiM引物11ii1lOiiM引物21ii110XBuffer2ii1lOmM(each)d證2.5ii125mMMgCl221.6ii1PFU酶(5U/ii1)0.3ii1ddH20to20.Oil1PCR擴(kuò)增條件為:94°C/2min—94°C/30sec—58°C/30sec—72°C/2min30cycles—72°C/10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1X瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠回收試劑盒回收之，并與pMD19-T載體連接。連接體系如下PCR產(chǎn)物(50ng)1.Oil1pMD19-T(50ng)l.OiUT4DNA連接酶10XBuffer1.0ii1T4DNA連接酶(1Weissunit/ii1)l.Oyl_ddH20to10.Oil1連接條件16t:連接過夜。CaCl2法制備大腸桿菌E.coliToplO感受態(tài)細(xì)胞，簡要的步驟如下挑取E.coliToplO單菌落，接種于lmlLB培養(yǎng)基中，225rpm、37t:培養(yǎng)過夜。次日以1/100轉(zhuǎn)接于5mlLB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至0D6。。在0.40.6之間。以lmL/管分裝于1.5mL離心管中，置于冰浴10min后，于4。C以4000g離心10min，棄上清。以500ii1/管加入100mmol/LCaCl2重懸，冰浴30min。4°C以4000g離心10min，棄上清。加入100ii1/管lOOmmol/LCaCl2重懸，冰浴備用，此感受態(tài)細(xì)菌即可用于轉(zhuǎn)化。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化之，簡要的步驟如下取適量連接產(chǎn)物DNA加入lOOiUToplO感受態(tài)細(xì)菌中，旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min后進(jìn)行熱休克。42t:水浴90s，冰浴2min，再加入0.8mlLB培養(yǎng)基，100rpm、37t:振蕩培養(yǎng)45min。取適量菌液涂布于含100mg/LAmp的LB瓊脂平板上37t:倒置培養(yǎng)過夜。用菌落PCR擴(kuò)增法篩選陽性克隆，擴(kuò)增P-actin作為陽性對照，測序。HUVEC細(xì)胞抽提RNA后電泳鑒定其抽提完整性，28s、18s和5srRNA清晰可見，證明抽提的RNA完整性良好。以抽得RNA進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增ATP5B序列，以擴(kuò)增P-actin作為陽性對照。擴(kuò)得ATP5B片段長1600bp，同預(yù)期大小相符；將該片段的測序結(jié)果與hATP5B的GenBank序列比較，所得序列正確無誤。2.2重組表達(dá)載體pET28a(+)-ATP5B的構(gòu)建將載體pMD19-T-ATP5B和pET28a(+)用Sacl/Hind111雙切，膠回收目的片段，T4連接酶連接，所進(jìn)行的是粘端定向克隆。定向克隆連接體系如下PCR產(chǎn)物(100ng)l.OiUpET28a(+)載體片段(100ng)1.0iUT4DNA連接酶10XBuffer1.0ii1T4DNA連接酶(1Weissunit/ii1)l.OiU_ddH20to10.Oil1連接條件16t:連接過夜。轉(zhuǎn)化E.coliToplO，CaCl2法制備大腸桿菌E.coliToplO感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟同上。用菌落PCR擴(kuò)增法篩選陽性克隆，送測序。用DNAssist1.0軟件對克隆的cDNA序列、依據(jù)開放閱讀框(openreadingframe,ORF)推測氨基酸序列。用含50mg/LKan的LB瓊脂平板過夜培養(yǎng)。菌落PCR及酶切鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆并送上海英駿公司測序。測序正確的克隆抽提質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株大腸桿菌E.coliBL21(ADE3)感受態(tài)細(xì)菌。對克隆進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定(圖1)。測序結(jié)果顯示，序列正確且插入載體后讀碼框未改變。2.3rhATP5B亞基在BL21(ADE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)隨機(jī)挑取若干轉(zhuǎn)有重組質(zhì)粒pET28a(+)-ATP5B的單個E.coliBL21(ADE3)菌落，接種于2ml含50mg/LKan的LB培養(yǎng)基中，225rpm、37"C振蕩培養(yǎng)過夜。取1ml過夜培養(yǎng)物接種于100ml含50mg/LKan的LB培養(yǎng)基中，225rpm、37"C振蕩培養(yǎng)至0D600約0.8。加入IPTG至終濃度lmM，225rpm、37。C振蕩培養(yǎng)4h。4。C下4000rpm離心10min，棄上清，收獲細(xì)菌備用。2.4包涵體的制備、純化與復(fù)性向原菌液中加入1/2體積的超聲緩沖液重懸菌體，按300W功率、間歇超聲共15min的超聲條件在冰浴下破碎細(xì)菌。超聲后菌液在4t:下10000g離心15min，棄上清，加入包涵體洗滌液充分重懸包涵體，室溫下洗滌2h，4t:下10000g離心15min，棄上清。洗滌后的包涵體沉淀可放置于_201:備用。加入包涵體溶解液過夜，4t:下15000g離心30min，收上清。按GE公司說明書，用鎳柱親和層析法純化rhATP5，取樣SDS-PAGE。調(diào)整洗脫液濃度至300mg/L，裝入透析袋，用20倍體積的復(fù)性緩沖液透析，fC過夜，用鎳柱濃縮后取樣SDS-PAGE?；叶葤呙枭鲜鯯DS-PAGE凝膠，分析rhATP5B占菌體總蛋白的百分率及純化、復(fù)性后的純度。復(fù)性產(chǎn)物用Bradford法測定蛋白終濃度。用pET28a(+)-ATP5B轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3)，誘導(dǎo)后在Mr約55000處出現(xiàn)1濃染帶，同預(yù)期大小相符(圖2，泳道3)?；叶葤呙栾@示，rhATP5B的表達(dá)量占菌體蛋白總量的36.8%，實現(xiàn)了高效表達(dá)。菌體裂解后上清與沉淀分別電泳，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要分布在裂解沉淀中，說明表達(dá)的rhATP5B蛋白主要以包涵體形式存在。包涵體蛋白經(jīng)純化，純度達(dá)98.3%(圖2，泳道7)。純化蛋白經(jīng)復(fù)性，純度達(dá)99.2%(圖2，泳道8);Bradford法測其濃度為1.2g/L。rhATP5B經(jīng)粗提、純化、復(fù)性后的得率為19.5%(見表6)，說明此方法能夠用于純化、復(fù)性目的蛋白。表6rhATP5B的純化和復(fù)性步驟總蛋白(mg/L)得率(%)總蛋白228.7100.0粗提80.535.2純化55.724.3復(fù)性44.619.5rhATP5B蛋白的Westernblot鑒定用鼠抗人ATP5B的mAb進(jìn)行Westernblot分析，鑒定rhATP5B蛋白。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)4h的pET28a(+)-ATP5B轉(zhuǎn)化菌、超聲裂解沉淀、純化后的蛋白樣品，在Mr約55000處均有一條帶(圖3，泳道4-6)，而在空菌E.coliBL21(ADE3)和誘導(dǎo)前的pET28a(+)-ATP5B轉(zhuǎn)化菌中沒有條帶出現(xiàn)(圖3，泳道2、3)，這說明已成功表達(dá)和純化了rhATP5B蛋白，純化蛋白仍保持其免疫結(jié)合活性。2.5抗ATP5B鼠單抗的制備與鑒定抗ATP5B雜交瘤的制備按常規(guī)方法進(jìn)行，簡要步驟如下取小鼠免疫，初次免疫時將50ygrhATP5B抗原與等體積弗氏完全佐劑充分混合，背部皮下多點(diǎn)注射。每2周加強(qiáng)免疫1次，采用30iigrhATP5B抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分混合，皮下多點(diǎn)注射。每次加強(qiáng)免疫7天后尾靜脈取血，用rhATP5B包被的間接ELISA測定血清抗體效價。待效價達(dá)l:105以上后，采用尾靜脈直接注射30iigrhATP5B抗原的方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，3天后取脾。將剪去脂肪、筋膜組織的脾通過200目的不銹鋼網(wǎng)，收集細(xì)胞于試管中，靜置2-3分鐘，吸取上層分離良好的細(xì)胞于50ml離心管中并計數(shù)，按脾細(xì)胞數(shù)目1/10的量加入對數(shù)生長期的SP2/0細(xì)胞混勻，1000rpm離心5min，棄上清。于lmin內(nèi)加入lml經(jīng)37。C預(yù)溫的50%PEG4000。加完后攪拌30s，靜置30s。再于2min內(nèi)加入4.5ml無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，1000rpm離心5min，棄上清。用含HAT的PPMI-1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，稀釋至2X106細(xì)胞/ml，按0.lml/孔接種于已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中。用rhATP5B包被的間接ELISA檢測上清中的特異性抗體將rhATP5B抗原以ELISA包被緩沖液稀釋至10iig/ml，以100y1/孔的量在4"C下包被酶標(biāo)板過夜。脫脂牛奶封閉緩沖液37t:封閉2h后拍干，加免疫血清作一抗，血清稀釋度為i:ioooi:ioooooo，以免疫前兔血清為陰性對照，反應(yīng)i.5h后，用PBST洗滌緩沖液液洗5次，再加用PBST以1:5000稀釋的羊抗兔IgG(H+L)-HRP酶標(biāo)二抗孵育30min，PBST洗6次。加入100iil/孔的TMB底物，37。C顯色30min，加100iU/孔的2MH2S04終止反應(yīng)，0D45。讀值，以試驗孔比陰性對照孔0D45。值>2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn)。陽性孔以3-4個細(xì)胞/孔的密度亞克隆，3-5輪亞克隆后所有孔的抗體效價相近時，擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存并制備腹水，腹水制備的簡要步驟如下BALB/c小鼠腹腔注射0.5ml無菌石蠟油，7天后注射4X106細(xì)胞/ml的雜交瘤細(xì)胞O.5ml，觀察腹水生長情況并抽取腹水。腹水用ProteinG親和層析柱純化。分泌鼠抗的雜交瘤細(xì)胞即為5BmAb7A8，所得鼠抗用Westernblot，HUVEC免疫熒光染色和IHC鑒定均符合預(yù)期。1)Westernblot:HUVEC裂解后進(jìn)行SDS-PAGE，以純化rhATP5B為陽性對照。濕法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)移后的PVDF膜于封閉液中封閉過夜，以制備單抗為一抗(l:1000)，以HRP-羊抗兔IgG為二抗(1:5000)進(jìn)行孵育，DAB顯色后觀察結(jié)果。2)HUVEC間接免疫熒光染色HUVEC用20g/L多聚甲醛固定，5g/LTritonX-100處理，10g/LBSA封閉。以制備單抗為一抗(含10g/LBSA的PBS稀釋，l:100)，室溫避光lh，含10g/LBSA的PBS洗3次，加熒光素_羊抗兔IgG為二抗，室溫避光20min，含10g/LBSA的PBS洗3次。DAPI染核，封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。3)IHC鑒定取出石蠟包埋的肝癌、肺癌病理組織切片，脫蠟至水，并滅活內(nèi)源性過氧化酶，浸入0.01mol/L，pH6.0的檸檬酸溶液于98。C加熱20min以熱修復(fù)抗原，加10%正常山羊血清封閉20min，加制備單抗(1:100)37t:孵育lh，PBS洗片后加HRP-羊抗兔IgG(l:250)37。C孵育30min，PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色，0.01mol/LPBS終止反應(yīng)后，蘇木精復(fù)染，脫水，封片，透明，鏡檢，拍照。鼠抗ATP5BmAb7A8的鑒定結(jié)果Westernblot顯示，mAb7A8在Mr約55000處與HUVEC中hATP5B有特異性反應(yīng)(圖4，泳道1)，同純化rhATP5B的條帶位置一致(圖4，泳道2)。該單抗與HUVEC中其他蛋白無交叉反應(yīng)(圖4，泳道1)，表明單抗具有高特異性。mAb7A8的HUVEC免疫熒光分析表明，單抗能識別HUVEC中的ATP5B(圖5)，因此具有天然抗原的結(jié)合活性。免疫組化實驗證18明，mAb7A8可與肺癌組織細(xì)胞胞膜和胞質(zhì)中的ATP5B蛋白結(jié)合(圖6)。2.6杭ATP5B人鼠人源化嵌合杭體的構(gòu)律及直核表汰2.6.ImAb7A8可變區(qū)的擴(kuò)增mAb7A8雜交瘤細(xì)胞株cDNA的制備，制備方法同2.1。抗體Fab區(qū)的PCR擴(kuò)增體系同2.1。擴(kuò)增弓l物為4組，分另U為mouseIgG—5'/mouseIgGl—3'，mouseIgG—5'/mouselgG2a-3'，mouseIgG_5，/mouseIgG3_3'，0X1+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mousek即pa-3'，延伸時間lmin。PCR產(chǎn)物電泳回收，并克隆至載體pMD19-T測序。根據(jù)Fab區(qū)測序結(jié)果設(shè)計引物，擴(kuò)增可變區(qū)，并克隆至載體pMD19-T測序。mAb7A8重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:1)mAb7A8輕鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:2)ISRMEAEDAATYYCQQRSSYPLTFGAGTKLEL(101aa)從m7A8雜交瘤細(xì)胞株中提取總RNA，采用0.8X瓊脂糖凝膠電泳分析，18SRNA和28SRNA大小正確，亮度比約1:2，條帶清晰，說明所提總RNA比較完整。以O(shè)ligod(T)18為引物合成cDNA第一鏈，并以此cDNA為模板，采用重鏈引物mouseIgG_5'/mouseIgGl-3'進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出700bp左右大小的重鏈Fab區(qū)基因片段，采用輕鏈引物(LC1+LC2+LC3+LC4+LC5+LC6+LC7)/mousek即pa-3'進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出700bp左右大小的輕鏈Fab區(qū)基因片段，與Fab基因片段的理論推導(dǎo)值一致(圖7，泳道2，5)。引物對mouselgG—5'/mouseIgG2a—3'，mouseIgG—5'/mouseIgG3—3'無擴(kuò)增帶，這在分子水平上驗證了雜交瘤細(xì)胞株m7A8是分泌抗體亞型為IgGl的單克隆細(xì)胞株。2.6.2mAb7A8雜交瘤細(xì)胞信號肽區(qū)擴(kuò)增根據(jù)對重、輕鏈Fab區(qū)序列分析結(jié)果設(shè)計引物，應(yīng)用cRACE法擴(kuò)增mAb7A8雜交瘤細(xì)胞的信號肽區(qū)。PCR產(chǎn)物電泳回收，并克隆至載體pMD19-T測序，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證實符合相應(yīng)抗體編碼基因特征。mAb7A8輕鏈信號肽氨基酸序列(SEQIDNO:3)MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC(22aa)mAb7A8重鏈信號肽氨基酸序列(SEQIDNO:4)MEFGLSWLFLVAILKGVQC(19aa)2.6.3人IgGl重、輕鏈恒定區(qū)擴(kuò)增人脾臟細(xì)胞的cDNA制備同2.1，人IgGl重、輕鏈恒定區(qū)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并克隆至載體pMD19-T測序。抽提人脾細(xì)胞總RNA，并對mRNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增人IgGl恒定區(qū)基因(圖9)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序證實符合相應(yīng)抗體編碼基因特征。人IgGl重鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:5)QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.(330aa)人IgGl輕鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:6)SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(108aa)2.6.4拼接構(gòu)建嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因使用拼接PCR(SOE-PCR)將mAb7A8的信號肽區(qū)、可變區(qū)、人IgGl的重、輕鏈恒定區(qū)進(jìn)行拼接獲得嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因。將兩者的PCR產(chǎn)物電泳回收，并克隆至載體pMD19-T測序。根據(jù)基因測序結(jié)果，設(shè)計特異性引物，用S0E-PCR將m7A8的前導(dǎo)肽、可變區(qū)同人IgGl的恒定區(qū)進(jìn)行拼接，得到嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因。瓊脂糖凝膠電泳顯示，SOE-PCR能成功拼接嵌合基因，所得的嵌合重鏈和嵌合輕鏈基因大小分別約為1500bp和750bp(圖IO)，并測序驗證正確(圖11)。人源化嵌合抗體重鏈氨基酸序列為(SEQIDNO:7)氨基酸(467aa)CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.人源化嵌合抗體重鏈多核苷酸序列為(SEQIDNO:8)KSFNRGEC.(231aa)人源化嵌合抗體輕鏈多核苷酸序列為(SEQIDNO:10)GAGAGTGTTAG(696bp)2.6.5人源化嵌合抗體的真核表達(dá)載體pCI-dhfr-LH-c7A8的構(gòu)建用Nhel和Notl分別酶切嵌合輕鏈的PCR純化產(chǎn)物及表達(dá)載體pCI-dhfr-LH，電泳回收后，R4連接酶16t:連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)菌。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆pCI-dhfr-LH-c7A8-L。用EcoRI和Notl分別酶切嵌合重鏈的PCR純化產(chǎn)物及中間載體pSEC，電泳回收后，T4連接酶16t:連接2h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)菌。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆pSEC-c7A8-H。用Mlul和Notl酶切pSEC-c7A8-H和pCI-dhfr-LH-c7A8_L，將攜帶重鏈和輕鏈的酶切片段用T4連接酶16t:連接6h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)菌。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，篩選出陽性克隆pCI-dhfr-LH-c7A8。將嵌合輕鏈基因克隆入真核表達(dá)載體pCI-dhfr-LH中構(gòu)建pCI-dhfr-LH-c7A8-L(圖12)，將嵌合重鏈基因克隆入中間載體pSEC中構(gòu)建pSEC-c7A8-H(圖13)，從pSEC-c7A8-H酶切由SV40pA、Pcmv、c7A8-H構(gòu)成的片段，插入輕鏈表達(dá)載體pCI-dhfr-LH-c7A8-L，構(gòu)建成重、輕鏈表達(dá)單位串聯(lián)的嵌合抗體真核表達(dá)載體pCI-dhfr-LH-c7A8(圖14)。利用特異性引物進(jìn)行PCR可分別從重組質(zhì)粒中擴(kuò)增出嵌合重、輕鏈基因，測序結(jié)果顯示重組載體構(gòu)建正確。以上結(jié)果表明，已成功構(gòu)建了含人-鼠嵌合重、輕鏈基因的真核共表達(dá)載體pCI-dhfr-LH-c7A8。重、輕鏈表達(dá)單位串聯(lián)的多核苷酸序列(SEQIDNO:11)212.6.6CH0-DG44細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與加壓篩選CH0-DG44細(xì)胞采用含10%FBS、0.03mmol/L次黃嘌呤(H)、0.003mmol/L胸腺嘧啶脫氧核苷(T)、0.lmmol/L脯氨酸(Pro)、0.lmmol/L甘氨酸(Gly)、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青鏈霉素的F12完全培養(yǎng)基在37t:、5XC02培養(yǎng)，常規(guī)按l:4傳代。c7A8嵌合表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染1)質(zhì)粒抽提。2)細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞轉(zhuǎn)染按Lipofectamine2000操作說明書進(jìn)行，以6孔板中的1孔為例，簡要步驟如下向該孔接種4乂105細(xì)胞，371:、5%0)2培養(yǎng)18h后換液1次，12h后開始轉(zhuǎn)染，貼壁細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時的理想?yún)R合度為90-95%。將4iig質(zhì)粒DNA和10iULipofectamineTM2000分別用無抗生物、無血清的培養(yǎng)基稀釋至250iU，溫和混勻，室溫靜置15min形成脂質(zhì)體復(fù)合物。用PBS洗滌細(xì)胞一次，并加入2mlF12作培養(yǎng)基，再滴入脂質(zhì)體復(fù)合物，將板前后振蕩，溫和混勻。37°C、5%C02培養(yǎng)6h后更換5ml含10%FBS的F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48-72h，之后用不含H、T、Gly的無血清培養(yǎng)基EX-CELL302培養(yǎng)以篩選必&+表型的細(xì)胞克隆。將在EX-CELL302中培養(yǎng)的細(xì)胞消化，計數(shù)，按1.5個細(xì)胞/孔接種于96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆，采用羊抗人IgG(H+L)多抗包被的夾心ELISA篩選嵌合抗體高表達(dá)的克隆。挑選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆，按l:5傳代后換含30nmol/L氨甲喋呤(MTX)的EX-CELL302選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞適應(yīng)了30nmol/LMTX后，如前所述繼續(xù)進(jìn)行亞克隆，篩選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆，按同樣方法相繼換含100nmol/LMTX、liimol/LMTX的EX-CELL302選擇培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn)行亞克隆，待96孔板細(xì)胞基本長滿后，換液繼續(xù)培養(yǎng)2d，取上清測定其嵌合抗體含量，以此法篩選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆。將細(xì)胞克隆移至25cm2培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，換液繼續(xù)培養(yǎng)4天，取上清測定其嵌合抗體含量，并以此次測得的抗體含量值為準(zhǔn)，挑選嵌合抗體表達(dá)最高的細(xì)胞克隆。本發(fā)明構(gòu)建了抗ATP5B人鼠嵌合抗體基因c7A8，并在CH0-DG44細(xì)胞成功表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物保持了親本鼠抗的抗原結(jié)合性，同時在恒定區(qū)以人源代替了鼠源，在分泌克隆上清中表達(dá)量為40ng/ml。2.6.7ELISA檢測c7A8的表達(dá)1)間接ELISA檢測c7A8的抗原結(jié)合性和人源性，具體方法同2.5，每個樣品都用羊抗人IgG(H+L)-HRP酶標(biāo)二抗和羊抗鼠IgG(H+L)-HRP分別進(jìn)行檢測。2)雙抗體夾心ELISA，方法同2.5，但以10ug/ml的羊抗人IgG(H+L)多抗包被酶標(biāo)板過夜，以羊抗人IgG(H+L)-服P酶標(biāo)二抗。以rhATP5B包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA實驗，用羊抗人IgG(H+L)-HRP為二抗時，轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆El培養(yǎng)上清中的c7A8既可結(jié)合包被的rhATP5B，也可被羊抗人IgG(H+L)識別，呈現(xiàn)陽性反應(yīng)。用羊抗鼠IgG(H+L)-HRP為二抗時，親本m7A8呈陽性反應(yīng)，而嵌合抗體c7A8呈陰性反應(yīng)(結(jié)果見表7)。這證明c7A8含有人抗體的恒定區(qū)片段，并與m7A8—樣可以結(jié)合rhATP5B。表7間接ELISA檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞株嵌合抗體c7A8的抗原結(jié)合性和人源性A:羊抗人IgG(H+L)-服P為二抗，B:羊抗鼠IgG(H+L)-冊P為二抗<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>采用雙抗體夾心ELISA，以羊抗人IgG(H+L)多抗包被酶標(biāo)板，用羊抗人IgG(H+L)-HRP為二抗，人IgGl作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得克隆El培養(yǎng)上清中c7A8表達(dá)量為40.05ng/ml(結(jié)果見表8)。表8雙抗體夾心ELISA檢測嵌合抗體c7A8的表達(dá)樣本OD柳Concentration(ng/ml)PBS對照0.070±0.0020.003.91ng/ml人IgGl0.446±0.0063.917.81ng/ml人IgGl0.695±0.0077.8115.63ng/ml人IgGl0.977±0.01015.6331.25ng/ml人IgGl1.281±0.02131.2562.50ng/ral人IgGl1.561±0.03262.50125.00ng/ml人IgGl1.759±0.047125.00亞克隆El培養(yǎng)上清1.354±0.02540.05亞克隆El培養(yǎng)上清(l:lO稀釋)0.671±0.0077.00CH0-DG44細(xì)胞培養(yǎng)上清0.010±0.0030.00序列表〈110〉蘇州工業(yè)園區(qū)晨健抗體組藥物開發(fā)有限公司〈120〉血管抑素受體|3亞基人源化嵌合及人抗體、其制備及應(yīng)用〈130>081073〈160>11〈170〉Patentlnversion3.1〈210>1〈211>118〈212>PRT〈213>artificialsequence〈220〉〈223>mAb7A8雜交瘤細(xì)胞株重鏈可變區(qū)氨基酸序列〈400〉1GluValGin1SerValLysTyrMetTyr3524LeuLeuGluSerGlyAlaGluLeuValLysProGlyAla51015LeuSerCysThrAlaSerGlyPheAsnlieLysAspAla202530TrpValArgGinArgProGluGinGlyLeuGluTrplie4045GlyArglieAspProAlaAsnAspAsnThrLysTyrAspProLysPhe505560GinGlyArgAlaThrlieThrAlaAspThrSerSerAsnThrAlaTyr65707580LeuGinLeuSerSerLeuThrSerGluAspThrAlaValHisTyrCys859095AlaArgPheTyrSerValTyrAlaMetAspTyrTrpGlyGinGlyThr100105110SerValThrValSerSer115〈210>2〈211>101〈212>PRT〈213>Artificialsequence〈220〉〈223>mAb7A8雜交瘤細(xì)胞株輕鏈可變區(qū)氨基酸序列〈400>2ThrGinSerProAlalieMetSerAlaSerProGlyGluLysValThr151015lieThrCysSerAlaSerSerSerValSerTyrMetHisTrpPheGin202530GinGinProGlyThrSerProLysLeuTrpValTyrThrThrSerAsn354045LeuAlaPheGlyValProAlaArgPheSerGlySerGlyProGlyThr505560SerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGluAlaGluAspAlaAlaThr65707580TyrTyrCysGinGinArgSerSerTyrProLeuThrPheGlyAlaGly859095ThrLysLeuGluLeu100〈210>3〈211>22〈212>PRT〈213>Artificialsequence〈220〉〈223>mAb7A8雜交瘤細(xì)胞輕鏈信號肽氨基酸序列〈400>3MetAspMetArgValProAlaGinLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp151015LeuArgGlyAlaArgCys20〈210>4〈211>19〈212>PRT〈213>Artificialsequence〈220〉〈223>mAb7A8雜交瘤細(xì)胞重鏈信號肽氨基酸序列〈400>4MetGluPheGlyLeuSerTrpLeuPheLeuValAlalieLeuLysGly151015ValGinCys〈210>5〈211>330〈212>PRT〈213>Homosapiens〈400>5AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys151015SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr202530PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer354045GlyValHisThrPheProAlaValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSer505560LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGinThr65707580TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys859095ArgValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys100105110ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro115120125LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys130135140ValValValAspValSerHisGluAspProGluValLysPheAsnTrp145150155160TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu165170175GluGinTyrAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrValLeu180185190HisGinAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn195200205LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysAlaLysGly210215220GinProArgGluProGinValTyrThrLeuProProSerArgAspGlu225230235240LeuThrLysAsnGinValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr245250255ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGinProGluAsn260265270AsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhePhe275280285LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGinGinGlyAsn290295300ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr305310315320GinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys325330〈210>6〈211>108〈212>PRT〈213>Homosapiens〈400>6ThrArgThrValAlaAlaProSerValPheliePheProProSerAsp151015GluGinLeuLysSerGlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsn202530PheTyrProArgGluAlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeu354045GinSerGlyAsnSerGinGluSerValThrGluGinAspSerLysAsp505560SerThrTyrSerLeuSerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyr65707580GluLysHisLysValTyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSer859095SerProValThrLysSerPheAsnArgGlyGluCys100105〈210>7〈211>467〈212>PRT〈213〉A(chǔ)rtificialsequence〈220〉〈223〉嵌合抗體重鏈氨基酸序列〈400>7MetGluPheGlyLeuSerTrpLeuPheLeuValAlalieLeuLysGly151015ValGinCysGluValGinLeuLeuGluSerGlyAlaGluLeuValLys202530ProGlyAlaSerValLysLeuSerCysThrAlaSerGlyPheAsnlie354045LysAspAlaTyrMetTyrTrpValArgGinArgProGluGinGlyLeu505560GluTrplieGlyArglieAspProAlaAsnAspAsnThrLysTyrAsp65707580ProLysPheGinGlyArgAlaThrlieThrAlaAspThrSerSerAsn859095ThrAlaTyrLeuGinLeuSerSerLeuThrSerGluAspThrAlaVal100105110HisTyrCysAlaArgPheTyrSerValTyrAlaMetAspTyrTrpGly115120125GinGlyThrSerValThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSer130135140ValPheProLeuAlaProSerSerLysSerThrSerGlyGlyThrAla145150155160AlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyrPheProGluProValThrVal165170175SerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAla180185190ValLeuGinSerSerGlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrVal195200205ProSerSerSerLeuGlyThrGinThrTyrlieCysAsnValAsnHis210215220LysProSerAsnThrLysValAspLysArgValGluProLysSerCys225230235240AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaProGluLeuLeuGly245250255GlyProSerValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMet260265270lieSerArgThrProGluValThrCysValValValAspValSerHis275280285GluAspProGluValLysPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluVal290295300HisAsnAlaLysThrLysProArgGluGluGinTyrAsnSerThrTyr305310315320ArgValValSerValLeuThrValLeuHisGinAspTrpLeuAsnGly325330335LysGluTyrLysCysLysValSerAsnLysAlaLeuProAlaProlie340345350GluLysThrlieSerLysAlaLysGlyGinProArgGluProGinVal355360365TyrThrLeuProProSerArgAspGluLeuThrLysAsnGinValSer370375380LeuThrCysLeuValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGlu385390395400TrpGluSerAsnGlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProPro405410415ValLeuAspSerAspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal420425430AspLysSerArgTrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMet435440445HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSer450455460ProGlyLys465〈210>8〈211>1403〈212>DNA〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉嵌合抗體重鏈多核苷酸序列〈400>8atggagtttgggctgagctggctttttcttgtggctetttteaaaggtgt:ccagtgtgag60gtccaactgctcgagtctggggcagagcttgtgaagccaggggcctcagt:caagttgtcc120tgcacagcttctggcttc朋catte朋gacgcctetetgtactgggtgagacagaggcct18029gaacagggcctggagtggattggteggattgatcctgcgaatgateatecte皿tetgac240ccgaagttcc3gggC3gggCgctgacacatcctccaacacagcctecctg300cagctcagcagcctgacatctgaggacactgccgtccattactgtgcteggttttectcc360gtctetgctetggactectggggt咖ggaacctcagtcaccgtctcctcagctegcacc420朋gggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggc織gcg■gccctgggctgcctggtcaaggactecttccccgaaccggtgacggtgtcgtgg皿ctca540ggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctecagtcctcaggactctec600tccctcagcagcgtggtgaccgtgccctcc3gC3gCttgggC3CCC3g3Cctecatctgc660朋cgtg朋tc3C朋gCCC3gC皿C3CC皿ggtggac皿gagagttgagcccaaatcttgt720gac朋朋ctcacacatgcccaccgtgcccagcacctg皿ctcctggggggaccgtcagtc780ttcctcttcccccc朋朋ccC皿gg3C3CCctcatgatctcccggacccc840tgCgtggtggtggacgtgagCC3Cg皿g3Ccctgaggtcaagttcaactggtecgtggac■ggcgtgg郷tgcateatgcccgcgggagg3gcagtec皿cagcacgtec960cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg皿tggc皿ggagtec皿g1020tgcaaggtctcc朋c朋agccctcccagcccccatcgagaaaaccatctc1080gggcagccccg3g朋CC3C3ggtgtecaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag1140朋CC3ggtC3gcctgacctgcctggtcaaaggcttctetcccagcgacatcgccgtggag1200tggg卿gC3atgggcagccggag皿c皿ctecaagaccacgcctcccgtgctggactcc1260gacggctccttcttcctctacagcaagctc紅gtgg織卿gc郷tggragc郷gg1320aacgtcttctcatgctccgtgctctgcacaaccactecacgcag^gagc1380ctctccctgtctccgggtaaatg1403〈210>9〈211>231〈212>PRT〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉嵌合抗體輕鏈氨基酸序列〈400>9MetAspMetArgValProAlaGinLeuLeuGlyLeuLeuLeuLeuTrp151015LeuArgGlyAlaArgCysThrGinSerProAlalieMetSerAlaSer202530ProGlyGluLysValThrlieThrCysSerAlaSerSerSerValSer354045TyrMetHisTrpPheGinGinGinProGlyThrSerProLysLeuTrp505560ValTyrThrThrSerAsnLeuAlaPheGlyValProAlaArgPheSer65707580GlySerGlyProGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerArgMetGlu859095AlaGluAspAlaAlaThrTyrTyrCysGinGinArgSerSerTyrPro100105110LeuThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuThrArgThrValAla115120125AlaProSerValPheliePheProProSerAspGluGinLeuLysSer130135140GlyThrAlaSerValValCysLeuLeuAsnAsnPheTyrProArgGlu145150155160AlaLysValGinTrpLysValAspAsnAlaLeuGinSerGlyAsnSer165170175GinGluSerValThrGluGinAspSerLysAspSerThrTyrSerLeu180185190SerSerThrLeuThrLeuSerLysAlaAspTyrGluLysHisLysVal195200205TyrAlaCysGluValThrHisGinGlyLeuSerSerProValThrLys210215220SerPheAsnArgGlyGluCys225230〈210>10〈211>696〈212>DNA〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉嵌合抗體輕鏈多核苷酸序列〈400>103tgg3C3tg3gggtccccgctcagctcctggggctcctgctectctggctccgaggtgccagatgtecccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggag朋ggtC3ccateacctgcagtgccagctcaagtgtaagttecatgcactggttccagcagcagccaggcacttctcccaaactctgggtttetecC3C3tCC朋Cctggcttttggagtccctgctcgcttcagtggcagtggacctgggacctcttactctctc3C朋tC3gCCg朋tggaggctg朋gatgctgccacttettactgccagca朋gg3gtegttecccgctcactttcggtgctgggaccaagctggagctgacccgtecggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagC3gttg3朋tctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaateacttctetcccagagaggcca朋gtecElgtgg朋ggtggateacgccctccaatcgggteactcccaggagagtgtc3C3g3gC3gg3C3gC朋gg3cagcacctec3gCCtC3gC3gcaccctgacgctgagc朋3gcagactecgagtctecgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttc朋c郷gg卿gtgtteg〈210>1160120180240300360420■540600660696〈211>1406〈212>DNA〈213>Artificialsequence〈220〉〈223〉重、輕鏈表達(dá)單位串聯(lián)的多核苷酸序列〈400〉11cgcgtttccctttegtg郷gtteatgcttCg3gC3g3C3tgateagatecattgatgag60ccacaactegttetttgtgaaatttgtgat120gctettgctttetttgteaccatteteagccaacaattgc180attcattttetgtttcaggttc郷gggagatgtggg郷tttttteaagc皿gtea皿c240ctctecaaatgtggtea皿tccgateaggtcaatettggccattegccatattettcatt300ggttetetegtettggctettggccattgcatecgttgtetctetetcat360皿tetgtecatttetettggctcatgtccaatetgaccgccatgttggcattgattettg420actegttett皿tegteatc皿ttecggggtcattegttcategcccatetetggagttc■cgcgttecataacttecggta皿tggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgccca540ttgacgtcaateatgacgtetgttcccategteacgcc皿tegggactttccattgacgt600咖tgggtggagtetttecggteaactgcccacttggcagtecatcaagtgtetcatetg660ccaagtccgccccctettgacgtcaatgacggt腿tggcccgcctggcattetgcccag720tecatgaccttecgggactttcctecttggcagtecatctacgtettegtcatcgctett780tgcggttttggcagtecacc皿tgggcgtggategcggtttgactcacgg840ggatttccaagtctccaccccattgacgtc皿tgggagtttgttttggca■cgggactttcteacaactgcgatcgcccgccccgttgacgca皿tgggcg960gteggcgtgtacggtgggaggtcteteteagcagagctcgtttegtg皿ccgtcagatca1020ctagaagctttattgcggtegtttetcacagtteaattgcteacgcagtcagtgcttctg1080ctcgaactteagctgcagtgactctctteaggtegccttgcagaagttgg1140ctgggcaggt朋gtetc皿ggttec皿gacaggttteaggagacc皿teg1200a朋ctgggcttgtcgagacagag皿gactcttgcgtttctgateggcacctettggtctt1260actgacatccactttgcctttctctccacaggtgtccactcccagttcaattecagctct1320t朋ggctegagtecttaatecgactcacteteggctegcctcgag皿ttcacgcgtggte1380cctctagagtcgagcccggcj級ccgc140權(quán)利要求一種血管抑素受體β亞基人源化嵌合抗體，其重鏈為鼠抗人血管抑素受體β亞基單克隆抗體的重鏈信號肽區(qū)、鼠抗人血管抑素受體β亞基單克隆抗體的重鏈可變區(qū)與人IgG1的重鏈恒定區(qū)嵌合獲得，其輕鏈為鼠抗人血管抑素受體β亞基單克隆抗體的輕鏈信號肽區(qū)、鼠抗人血管抑素受體β亞基單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)與人IgG1的輕鏈恒定區(qū)嵌合獲得。2.如權(quán)利要求1所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體，其特征在于，所述鼠抗人血管抑素受體P亞基單克隆抗體的重鏈信號肽區(qū)的氨基酸序列為SEQIDN0:4，其輕鏈信號肽區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:3。3.如權(quán)利要求1所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體，其特征在于，所述鼠抗人血管抑素受體P亞基單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:l，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:2。4.如權(quán)利要求1所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體，其特征在于，所述人IgGl的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:5，輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列為SEQIDNO:6。5.如權(quán)利要求1所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體，其特征在于，所述人源化嵌合抗體的重鏈氨基酸序列為SEQIDN0:7，輕鏈氨基酸序列為SEQIDNO:9。6.—種多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求l-5中任一權(quán)利要求所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈。7.如權(quán)利要求6所述多核苷酸序列，其特征在于，所述編碼血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列為SEQIDNO:10。8.—種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求6或7所述多核苷酸序列。9.一種宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求8所述載體轉(zhuǎn)化。10.—種多核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈。11.如權(quán)利要求io所述多核苷酸序列，其特征在于，所述編碼血管抑素受體e亞基人源化嵌合抗體的重鏈的多核苷酸序列為SEQIDNO:8。12.—種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求10或11所述多核苷酸序列。13.—種宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求12所述載體轉(zhuǎn)化。14.一種多核苷酸序列，其同時含有編碼權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈和編碼權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述血管抑素受體|3亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列。15.如權(quán)利要求14所述多核苷酸序列，其特征在于，所述編碼血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的重鏈和編碼上述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的輕鏈的多核苷酸序列串聯(lián)。16.如權(quán)利要求14或15所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸的序列為SEQIDN0:11。17.—種表達(dá)載體，其含有權(quán)利要求14-16任一權(quán)利要求所述多核苷酸序列。18.—種宿主細(xì)胞，其被權(quán)利要求17所述載體轉(zhuǎn)化。19.權(quán)利要求l-5中任一權(quán)利要求所述血管抑素受體13亞基人源化嵌合抗體的制備方法，包括下列步驟1)在適合表達(dá)血管抑素受體0亞基人源化嵌合抗體的條件下，培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；2)從培養(yǎng)物中分離出具有血管抑素受體e亞基抗體活性的多肽。20.權(quán)利要求l-5中任一權(quán)利要求所述血管抑素受體P亞基人源化嵌合抗體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開了一種血管抑素受體β亞基人源化嵌合抗體，為鼠抗人血管抑素受體β亞基單克隆抗體的信號肽區(qū)和可變區(qū)與人IgG1的恒定區(qū)嵌合獲得。本發(fā)明還具體公開了該人源化嵌合抗體的制備方法及其在抗腫瘤上的應(yīng)用。本發(fā)明的人源化嵌合抗體與鼠源的血管抑素受體β亞基單克隆抗體相比，免疫原性低，副作用小，在保持其抗血管抑素受體β亞基活性的同時，更適于體內(nèi)應(yīng)用。文檔編號C12N1/15GK101724074SQ20081020208公開日2010年6月9日申請日期2008年10月31日優(yōu)先權(quán)日2008年10月31日發(fā)明者倪健,高鋒申請人:蘇州工業(yè)園區(qū)晨健抗體組藥物開發(fā)有限公司