專利名稱：：一種白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種白蛋白/角蛋白(ALB/CK19)雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系及其建立方法。
背景技術(shù)：
：胚胎干細(xì)胞(ESC)是從哺乳動物囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離得到的全能干細(xì)胞，可以無限增殖并分化為全身200多種細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)情況下可以形成擬胚體(EB)，擬胚體是胚胎干細(xì)胞在體外一定條件下自發(fā)形成的類似早期胚胎的球體，其三胚層的形成與分化基本模擬了體內(nèi)胚胎早期發(fā)育中組織細(xì)胞的分化過程。1996年，日本學(xué)者abe等首先檢測到了在擬胚體發(fā)育過程中內(nèi)胚層基因的表達(dá)，并且其表達(dá)模式與小鼠胚胎發(fā)育相一致，說明小鼠胚胎干細(xì)胞在體外分化為肝細(xì)胞具有可行性。自此，大量有關(guān)體外分化ESC為肝細(xì)胞的研究迅速開展起來。由于胚胎干細(xì)胞肝向分化得到的細(xì)胞復(fù)雜多樣，如果要利用分化得到的肝細(xì)胞來進(jìn)行細(xì)胞移植和治療等用途，則需要對分化細(xì)胞中的肝細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記以利于純化。所以研究人員對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行必要的遺傳修飾，利用報告基因，例如熒光蛋白和細(xì)胞膜蛋白等，來標(biāo)記特定的肝臟發(fā)育基因，以利于分化過程中對肝細(xì)胞的形成進(jìn)行追蹤、分選以及定量。2002年，基因標(biāo)記技術(shù)第一次被應(yīng)用在ES細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化研究中，Yin實驗室利用基因敲入(Knockin)技術(shù)在小鼠ES細(xì)胞的甲胎蛋白(AFP)基因后連接綠色熒光蛋白(EGFP)，用以標(biāo)記在ES細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生的肝祖細(xì)胞。隨后在2003年，Yamamoto等利用白蛋白ALB啟動子調(diào)控的EGFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞，建立基因修飾胚胎干細(xì)胞系，通過綠色熒光檢測分化得到的肝細(xì)胞，并同時證明了標(biāo)記ALB陽性的細(xì)胞具有肝細(xì)胞基因表達(dá)特征和功能。隨后的幾年中，這種利用肝基因調(diào)控的報告基因標(biāo)記分化得到肝細(xì)胞的方法，在體外分化ES細(xì)胞的研究中屢見不鮮。日本科學(xué)家Teratani和Heo利用EGFP標(biāo)記ALB的小鼠胚胎干細(xì)胞，分別采用完全不同的誘導(dǎo)方法，成功誘導(dǎo)得到高比例的肝臟細(xì)胞，Teratani采用單層培養(yǎng)法，第一步，利用RA剌激細(xì)胞為誘導(dǎo)內(nèi)胚層階段；第二步，加入生長因子進(jìn)行誘導(dǎo)則為肝誘導(dǎo)階段；第三步，加入OSM繼續(xù)誘導(dǎo)，為肝細(xì)胞成熟階段；第四步，利用肝細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)分化細(xì)胞，對細(xì)胞進(jìn)一步篩選，通過EGFP分選得到ALB陽性的細(xì)胞，移植入肝纖維化損傷小鼠，發(fā)現(xiàn)綠色熒光細(xì)胞整合入小鼠肝臟同時緩解肝病癥狀；而Heo采用擬胚體誘導(dǎo)法，通過氫化可的松、維生素C、尼克酰胺等化合物誘導(dǎo)得到30%ALB陽性的細(xì)胞，將ALB陽性細(xì)胞分選后，移植入四氯化碳損傷小鼠和尿激酶纖維蛋白溶酶原激活劑缺陷性小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分化得到的ALB陽性細(xì)胞能夠整合入小鼠肝臟中，并部分恢復(fù)小鼠肝臟功能。從這些研究可以看出，在體外誘導(dǎo)分化過程中，由肝臟基因啟動子調(diào)控的報告基因可以標(biāo)記和分離類肝臟細(xì)胞。然而，從小鼠胚胎發(fā)育的順序上來看，肝細(xì)胞是由肝祖細(xì)胞(h印atoblast)分化而來，肝祖細(xì)胞則來源于內(nèi)胚層，已經(jīng)有科學(xué)家利用基因敲入技術(shù)標(biāo)記了內(nèi)胚層相關(guān)基因來研究內(nèi)胚層的分化情況，例如Gondern和Nishikawa，可是對肝祖細(xì)胞的標(biāo)記和分選的研究卻鮮有報道。肝祖細(xì)胞是一種在胚胎肝發(fā)育中處于特異時間點的帶有肝細(xì)胞和膽管表皮細(xì)胞雙潛能的細(xì)胞類型，在特定的條件下，既可以分化為肝實質(zhì)細(xì)胞又可以分化為膽管細(xì)胞。在以往有關(guān)于ES細(xì)胞分化為肝祖細(xì)胞的報道中，AFP被作為肝祖細(xì)胞的一個標(biāo)志性基因與EGFP相連，通過檢測AFP的表達(dá)來證明肝祖細(xì)胞的出現(xiàn)，但是實際上，AFP并不僅僅表達(dá)在肝祖細(xì)胞中，它同時在臟壁內(nèi)胚層也有高表達(dá)，而臟壁內(nèi)胚層最終分化為胚外組織并不參與肝臟的分化和發(fā)育，所以AFP的表達(dá)不能準(zhǔn)確地標(biāo)定肝祖細(xì)胞的存在。目前為止，仍然沒有公認(rèn)的識別肝祖細(xì)胞的表面標(biāo)志蛋白，所以這給ES細(xì)胞分化得來的肝祖細(xì)胞追蹤和分選帶來一定的困難。但有一點科學(xué)家們是肯定的，那就是白蛋白ALB和角蛋白CK19雙表達(dá)的細(xì)胞則為肝祖細(xì)胞。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的首要目的在于，提供一種白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系。本發(fā)明的第二個目的在于，提供一種建立白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系的方法。本發(fā)明的第三個目的在于，提供一種白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系的應(yīng)用。本發(fā)明提供的白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系，所述小鼠胚胎干細(xì)胞系由白蛋白/角蛋白雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)建立，所述小鼠胚胎干細(xì)胞整合有紅色熒光/綠色熒光蛋白雙報告基因，所述報告基因由組織特異性啟動子白蛋白ALB或角蛋白CK19調(diào)控。根據(jù)本發(fā)明所述的小鼠胚胎干細(xì)胞系，所述綠色熒光蛋白為GFP。根據(jù)本發(fā)明所述的小鼠胚胎干細(xì)胞系，所述紅色熒光蛋白選自mRFP或tdT0MAT0。根據(jù)本發(fā)明所述的小鼠胚胎干細(xì)胞系，所述小鼠胚胎干細(xì)胞還整合有篩選基因，具體的，所述篩選基因選自新霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。本發(fā)明的建立ALB/CK19雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系的方法，包括以下步驟A)構(gòu)建由啟動子調(diào)控，包含報告基因、篩選基因的兩載體；所述啟動子選自白蛋白ALB或角蛋白CK19;所述報告基因選自紅色熒光蛋白mRFP、tdT0MAT0或綠色熒光蛋白EGFP;所述篩選基因選自新霉素抗性基因Neo或潮霉素抗性基因Hygro;B)將步驟A)所得兩載體共轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞；C)篩選存活的、帶有GFP/mRFP或GFP/tdT0MAT0雙基因標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞；D)將步驟C)所得小鼠胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)，建立ALB/CK19雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞系。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述兩載體為以ALB啟動子調(diào)控的包含mRFP、Hygro基因的載體以及以CK19啟動子調(diào)控的包含EGFP、Neo基因的載體。根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述兩載體為以ALB啟動子調(diào)控的包含EGFP、Neo基因的載體以及CK19啟動子調(diào)控的包含人膜白hCD25基因、tdT0MAT0、Hygro基因的載體。本發(fā)明的白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系的應(yīng)用，用于標(biāo)志小鼠胚胎干細(xì)胞分化得到肝祖細(xì)胞。本發(fā)明選用ALB啟動子和CK19啟動子分別調(diào)控不同的報告基因，建立了兩株基因修飾胚胎干細(xì)胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP和E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0，這兩株胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化時，可以分化為帶有綠色/紅色熒光標(biāo)志的CK19/ALB雙陽性的肝祖細(xì)胞，從而標(biāo)記肝祖細(xì)胞的出現(xiàn)。與基因敲入的方法相比，本發(fā)明利用轉(zhuǎn)染組織特異啟動子操縱報告基因的方法更簡便、更快捷、具有更大的實用性。利用本發(fā)明的白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞分化，可以明確地分選得到發(fā)育階段均一的肝祖細(xì)胞，對接下來的肝祖細(xì)胞分化機(jī)制研究和細(xì)胞移植及治療帶來極大的有益效果。圖1A是pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)載體的結(jié)構(gòu)圖；圖IB是pmCK19-EGFP載體的結(jié)構(gòu)圖；圖1C是pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)載體的結(jié)構(gòu)圖；圖1D是pmALB-EGFP-N2載體的結(jié)構(gòu)圖。圖2是mALB和mCK19啟動子組織特異性的熒光鏡檢結(jié)果(200X)，其中A:轉(zhuǎn)染pmCK19-EGFP的GBC-SD細(xì)胞；B:轉(zhuǎn)染pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)的GBC-SD細(xì)胞；C:轉(zhuǎn)染pmCK19-EGFP的NIH-3T3細(xì)胞；D:轉(zhuǎn)染pmALB-EGFP_N2的Huh7細(xì)胞；E:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)的Huh7細(xì)胞；F:轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)的NIH-3T3細(xì)胞。圖3是基因組PCR檢測轉(zhuǎn)染載體在胚胎干細(xì)胞基因組整合情況的電泳結(jié)果，其中A:pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)與pmCK19-EGFP共同轉(zhuǎn)染組；B:pmALB-EGFP-N2與pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)共同轉(zhuǎn)染組。圖4是基因修飾后胚胎干細(xì)胞形態(tài)學(xué)、全能性及分化潛能的熒光鏡檢結(jié)果，其中A:ALP染色(100X);B:E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP細(xì)胞克隆(100X);C、D:E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP形成2天的擬胚體(40X)(100X);E:E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP細(xì)胞的DAPI染色(100X);F:細(xì)胞膜蛋白SSEA-1染色(100X);G:細(xì)胞核蛋白0ct4染色(100X);H:細(xì)胞免疫組化后可見光視野(100X);1:E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0細(xì)胞的DAPI染色(100X);J:細(xì)胞膜蛋白SSEA-1染色(100X);K:細(xì)胞核蛋白0ct4染色(100X);L:細(xì)胞免疫組化后可見光視野(100X);。圖5是血清誘導(dǎo)E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP向肝祖細(xì)胞分化誘導(dǎo)的熒光鏡檢結(jié)果(200X)，其中A:E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP形成擬胚體兩天后，貼壁22天(總誘導(dǎo)24天)的可見光視野；B:為A圖的ALB紅色熒光表達(dá)；C:為A圖的CK19綠色熒光表達(dá)；D:為B和C合并，可見少量的黃色熒光細(xì)胞(ALB7CK19+)。圖6是無血清誘導(dǎo)E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0向肝祖細(xì)胞分化誘導(dǎo)的熒光鏡檢結(jié)果(200X)，其中A:球狀克隆貼壁培養(yǎng)12天可見光視野；B:為A圖的ALB綠色熒光表達(dá)；C:為B圖的CK19紅色熒光表達(dá)；D:為B和C的合并，黃色細(xì)胞為ALB和CK19雙陽性細(xì)胞；E:FACS分析D圖的分化細(xì)胞八1^-￡6+/0(19-1^025+的分化比例。具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克隆實驗室手冊》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件進(jìn)行。無特別注明外，本發(fā)明所用抗體均購自R&D公司；所用試劑均購自NEB公司。本發(fā)明的實施例中使用的質(zhì)粒pDB587:參考文獻(xiàn)(M.Fischeretal.AbrilliantmonomericredfluorescentproteintovisualizecytoskeletondynamicsinDictyosteli咖.FEBS577(2004)227-232)的方法構(gòu)建。pcDNA3.1/Hygro(-)載體購自invitrogen公司，具有CMV啟動子，氨節(jié)霉素抗性基因。pGE亂BSVPA:參考文獻(xiàn)(Zaretetal.Conditionalenhancementofliver-specificgenetranscription.PNAS85(1988)9076-9080;Shiotaetal.H印atocytegrowthfactorinhibitsgrowthofhepatocellularcarcinomacells.PNAS89(1992)373=377)的方法構(gòu)建，具有ALB啟動子，氨芐霉素抗性。pEGFPCI:購自CL0NTECH公司，具有CMV啟動子，卡那霉素抗性。pcDNA3.l-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-):具有CMV啟動子，氨節(jié)霉素抗性基因，tdTomato片段，其構(gòu)建步驟如下1)根據(jù)質(zhì)粒ptdTomato的序列設(shè)計以下PCR引物，擴(kuò)增tdTomato:Al:5'AGTAGGATCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3';A2:5'ATGACTTAAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG3'2)PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒ptdTomato(通過簽署材料使用協(xié)議materialtransferagreement,MAT獲得)為模板，以Al和A2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下反應(yīng)體系(50ii1):10XBuffer5ii1，dNTP(100iimol/L)4ii1，MgS04(50mM)2ii1，HIFIDNA聚合酶0.5ii1，Pl、P2(10mM)各1ii1，ddH2035.5ii1。反應(yīng)條件94。C，3min;94°C30sec，62。C30sec，68。C90sec，循環(huán)25次；72。C，lOmin。3)pcDNA3.l-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)載體的構(gòu)建將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAGEN公司的試劑盒回收約1.4kb的tdTomato片段，用BamHI和AflII雙酶切。同樣用BamHI和AflII雙酶切pcDNA3.l-hCD25-IRES/Hygro(-)載體(購自invitrogen公司)，得載體的骨架片段，將載體的骨架片段和tdTomato片段用T4DNA連接酶(NEB公司)于16。C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在瓊脂平板上(含氨芐抗生素)，于37t:培養(yǎng)12小時，從平板上挑取陽性單菌落，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切，電泳驗證鑒定大小和方向，送invitrogen公司測序，將所得載體命名為pcDNA3.l-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)，大小約為8.4kb。實施例1、載體構(gòu)建61.1、pcDNA3.l-mAlb-mRFP/hygro(-)載體的構(gòu)建1.1.1、根據(jù)質(zhì)粒pDB587的序列設(shè)計以下PCR引物，擴(kuò)增mRFP:PI:5'ACGCGGCCGCAGATCCACCATGGCCAGCTCCG3'P2:5'CTCAAGCTTTTAGCTTCCAGCGCCTGTGCTATGT3'1.1.2、PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒pDB587為模板，以Pl和P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下反應(yīng)體系(50ii1):10XBuffer5ii1，dNTP(100iimol/L)4ii1，MgS04(50mM)2ii1，HIFIDNA聚合酶0.5ii1，Pl、P2(10iiM)各1ii1，ddH2035.5ii1。反應(yīng)條件94。C，3min;94。C30sec，62。C30sec，68。C60sec，循環(huán)25次；72。C，10min。1.1.3、pcDNA3.1—mRFP/hygro載體的構(gòu)建將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAGEN公司的試劑盒回收約692bp的mRFP片段，用NotI和HindIII雙酶切。同樣用NotI和HindIII雙酶切pcDNA3.1/Hygro(-)載體，得載體的骨架片段，將載體的骨架片段和mRFP片段用iy)NA連接酶(NEB公司)于16t:連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在瓊脂平板上(含氨芐抗生素)，于37°C培養(yǎng)12小時，從平板上挑取陽性單菌落，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切，電泳驗證鑒定大小和方向，送invitrogen公司測序，將所得載體命名為pcDNA3.l-mRFP/hygro，大小約為6230kb。1.1.4、pcDNA3.l-mAlb—mRFP/hygro(-)載體的構(gòu)建MluI和XhoI雙酶切載體pGEMALBSVPA，得到2884bp的mALB啟動子片段，將其克隆入步驟1.1.3所得的載體pcDNA3.1-mRFP/hygro的MluI和XhoI位點，經(jīng)酶切驗證，將得到載體命名為pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)，大小約為8.4kb，該載體具有ALB啟動子、mRFP基因和潮霉素抗性基因，載體結(jié)構(gòu)如圖1A所示。1.2、pmCK19-EGFP載體的構(gòu)建1.2.1、以小鼠尾基因組為模板，設(shè)計以下引物擴(kuò)增CK19的啟動子和5'UTR順序(登記號:AF237661):P3:5'AAATTAATTCTAAGACCCACC3，P4:5'GATAGTCTAGAGAAGTCATGATG3'1.2.2、PCR擴(kuò)增以小鼠尾基因組為模板，以P3和P4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下反應(yīng)體系(50ii1):10XBuffer5ii1，d證(100iimol/U1P1，Taqplus(100mM)1ii1，P3、P4(10iiM)各0.5ii1，ddH2041ii1。反應(yīng)條件94°C，3min;94°C30sec，55°C30sec，72°C3min，循環(huán)25次；72°C，lOmin。1.2.3、pmCK19-EGFP載體的構(gòu)建將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAGEN公司的試劑盒回收約2kb的CK19啟動子片段，經(jīng)測序驗證后用VspI和Xbal雙酶切。用VspI和Nhel雙酶切pEGFPCl載體以去除CMV啟動子，得載體的骨架片段，將載體的骨架片段和CK19啟動子片段用T4DNA連接酶(NEB公司)于16t:連接過夜。7將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在瓊脂平板上(含卡那霉素)，于37°C培養(yǎng)12小時，從平板上挑取陽性單菌落，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切，電泳驗證鑒定大小和方向，送invitrogen公司測序，將所得載體命名為pmCK19-EGFP，大小約為6.2kb，該載體具有CK19啟動子、EGFP基因和卡那霉素抗性基因，載體結(jié)構(gòu)如圖1B所示。1.3、pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)載體的構(gòu)建1.3.1根據(jù)質(zhì)粒pmCK19-EGFP的序列設(shè)計以下PCR引物，擴(kuò)增mCK19啟動子P5:5'AAACGCGTTCTAAGACCCACC3，P6:5'ATACTCGAGGAAGTCATGATG3，1.3.2、PCR擴(kuò)增以質(zhì)粒pmCK19-EGFP為模板，以P5和P6為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體如下反應(yīng)體系(50ii1):10XBuffer5ii1，dNTP(100iimol/L)5ii1，TaqplusDNA聚合酶O.5ii1，P5、P6(10iiM)各lii1，ddH2046.5ii1。反應(yīng)條件94。C，3min;94。C30sec，55。C30sec，68。C150sec，循環(huán)25次；72。C，10min。1.3.3、pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)載體的獲得將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用QIAGEN公司的試劑盒回收約2045bp的mCK19啟動子片段，用Mlul和Xhol雙酶切；同樣用Mlul和Xhol雙酶切pcDNA3.l-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)載體，得載體的骨架片段，將載體的骨架片段和mCK19啟動子片段用T4DNA連接酶(NEB公司)于16。C連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在瓊脂糖平板上(含氨芐抗生素)，于37°C培養(yǎng)12小時，從平板上挑取陽性單菌落，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切，電泳驗證鑒定大小和方向，送invitrogen公司測序，將所得載體命名為pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(_)，大小約為9750kb，該載體具有CK19啟動子、hCD25基因、tdTomato基因和潮霉素抗性基因，載體結(jié)構(gòu)如圖1C所示。1.4、pmalb-EGFP-N2載體的構(gòu)建參考文獻(xiàn)(Heo，J.，etal.，Hepaticprecursorsderivedfrommurineembryonicstemcellscontributetoregenerationofinjuredliver.H印atology，2006.44(6):p.1478-86)的方法構(gòu)建pmalb_EGFP-N2載體，該載體具有ALB啟動子、EGFP基因和卡那霉素抗性基因，載體結(jié)構(gòu)如圖1D所示。實施例2、ALB和CK19啟動子組織特異性表達(dá)2.1、抽提質(zhì)粒將實施例1構(gòu)建的四個載體參照QIAGEN公司大抽試劑盒說明書抽提質(zhì)粒備用。2.2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天將人肝癌細(xì)胞Huh7、小鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3、人膽管癌細(xì)胞GBC-SD(均購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫)鋪于6孔板上，待細(xì)胞長到60%_80%匯合時，使用QIAGEN轉(zhuǎn)染試劑盒，分別將步驟2.1所得質(zhì)粒與8y1增強(qiáng)劑混合，室溫放置5min，加入轉(zhuǎn)染試劑混合5次，室溫放置8min后，與1ml培養(yǎng)液混勻，按照表1所示，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染24-48小時后，顯微鏡下觀察熒光表達(dá)(200X)，結(jié)果如圖2所示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由圖2可知，將載體pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)、pmalb-EGFP-N2瞬時轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系Huh7和小鼠成纖維細(xì)胞系NIH-3T3，由于Huh7特異性表達(dá)ALB，因此僅在Huh7細(xì)胞中檢測到綠色熒光(圖2D)和紅色熒光(2E)，而在NIH-3T3細(xì)胞中檢測不到熒光表達(dá)(圖2F);同理，將載體pmCK19-EGFP、pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)瞬時轉(zhuǎn)染人膽管癌細(xì)胞系GBC-SD和NIH-3T3后，由于GBC-SD特異性表達(dá)CK19，因此僅能在GBC-SD細(xì)胞中檢測到綠色熒光(圖2A)和紅色熒光(2B)，而在NIH-3T3細(xì)胞中檢測不到熒光表達(dá)(圖2C)，由以上結(jié)果可以證明ALB和CK19啟動子具有組織特異性。實施例3、小鼠胚胎干細(xì)胞系的建立3.1、質(zhì)粒線性化取實施例1構(gòu)建的載體pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)和pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)各5iig，加入2ii1的NruI，37。C酶切過夜；取pmalb-EGFP-N2和pmCK19-EGFP各g，加入2iU的Apal1，37。C酶切過夜。所得酶切產(chǎn)物加入1/10體積的醋酸鈉混勻，加入4iil的DNAmate，2.5倍體積的_20°C乙醇，混勻，13000rpm4"離心15min得白色沉淀，用無菌水溶解備用。3.2小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)將胚胎干細(xì)胞E14.1(購自ATCC，保藏號CRL-1821)培養(yǎng)在無滋養(yǎng)層但是鋪有0.1%明膠的培養(yǎng)瓶中，以GMEM(GIBCO公司)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入10%1(0_血清、1%FBS、100XP/S、100X非必需氨基酸、0.lmMP-巰基乙醇、lmM丙酮酸鈉和1，000U/mlLIF進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)2-3天后，利用0.25X的胰酶消化E14.1細(xì)胞，按l:5_8的比例傳代。3.3、轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前12小時，為胚胎干細(xì)胞E14.1換上新鮮培養(yǎng)液，每個樣品需2-4X106細(xì)胞。按表2所示，將皿cleofector(Amaxa公司)的試劑與質(zhì)粒和細(xì)胞混合后，放入電轉(zhuǎn)杯中，置于皿cleofector樣品槽中，選擇電轉(zhuǎn)儀(Amaxa公司)的程序A23進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后馬上將細(xì)胞從電轉(zhuǎn)杯中取出，放入事先預(yù)熱到37t:的培養(yǎng)液中，48小時后，加入終濃度350iig/mlG418和180yg/mlHygromycinB篩選細(xì)胞，兩種抗生素篩選IO天后，挑取單細(xì)胞克隆，消化后放入12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，擴(kuò)增培養(yǎng)到6孔板中。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.4、基因組PCR檢測基因整合情況3.4.1、引物設(shè)計針對mRFP和Neomycin設(shè)計引物P7(mRFP-F):5'ACGCGGCCGCAGATCCACCATGGCCAGCTCCG3'P8(mRFP-R):5'CTCAAGCTTTTAGCTTCCAGCGCCTGTGCTATGT3'P9(Neo-F):5'ATGATTGAACAAGATGGATTGCACG3'P10(Neo-R):5，CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGAT3'P11(EGFP-F):5'CCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3'P12(EGFP-R):5'TTATCTAGATCCGGTGGATC3'P13(IRES-F):5，CCCTAACGTTACTGGCCGAAGC3'P14(IRES-R):5，TGTGCCATATATCATCGTGT3'3.4.2、PCR擴(kuò)增按照基因組試劑盒說明書(上海TIANGEN公司)，提取經(jīng)擴(kuò)增的單細(xì)胞克隆的細(xì)胞基因組，以基因組為模板，選擇元件EGFP(引物P11、P12)和mRFP(引物P7、P8)為一組，IRES(引物P13、P14)和Neomycin(引物P9、P10)為一組，分別對5株單克隆細(xì)胞進(jìn)行PCR檢測，具體如下反應(yīng)體系(50ii1):10XBuffer5ii1，dNTP(100iimol/L)5ii1，TaqplusDNA聚合酶O.5iU，上下游引物(10iiM)各lyl，ddH2046.5iU。反應(yīng)條件95。C，5min;94。C30sec，退火溫度30sec，72。C30sec，循環(huán)36-38次；72°C，10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測載體在細(xì)胞基因組中的整合情況，結(jié)果如圖3所示。由圖3A可以看出，在轉(zhuǎn)染組A中，挑取的5個單克隆細(xì)胞中有3個呈雙陽性，說明pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)和pmCK19-EGFP都已經(jīng)整合入基因組。由此，建立了ALB啟動子調(diào)控紅色熒光蛋白(mRFP)和CK19啟動子調(diào)控綠色熒光蛋白(EGFP)的ALB/CK19雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞系，即E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP。由圖3B可以看出，在轉(zhuǎn)染組B中，挑取的5個單克隆細(xì)胞中有4個呈雙陽性，說明p腿lb-EGFP-N2和pcDNA3.l-mCK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0/hygro(-)都已經(jīng)整合入基因組。由此，建立了ALB啟動子調(diào)控綠色熒光蛋白(EGFP)和CK19啟動子調(diào)控人膜白(hCD25)和紅色熒光蛋白(tdT0MAT0)的ALB/CK19雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞系，即E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0。3.5、胚胎干細(xì)胞系全能性檢測選取pcDNA3.1-mAlb-mRFP/hygro(-)和pmCK19-EGFP共轉(zhuǎn)染得到的3株雙陽性的克隆中的一株建立的胚胎干細(xì)胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP做全能型檢測，結(jié)果見圖4A-4G。3.5.1、形態(tài)學(xué)觀察用顯微鏡觀察(100X)，結(jié)果如圖4B所示，遺傳修飾后的胚胎干細(xì)胞集落呈鳥巢狀，邊緣清晰，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長，與未轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞形態(tài)無區(qū)別。3.5.2、熒光鏡檢將E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在MEF上，用堿性磷酸酶ALP染色，用熒光顯微鏡觀察(100X)，結(jié)果如圖4A所示。由圖4A可見細(xì)胞克隆成藍(lán)紫色，而MEF未被染色，說明建系后的小鼠胚胎干細(xì)胞具有全能性，而成體細(xì)胞MEF則為陰性結(jié)果。3.5.3、擬胚體(EB)細(xì)胞的形成將E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP小鼠胚胎干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)，用熒光顯微鏡觀察，結(jié)果如圖4C(40X)、4D(100X)所示。由圖4C、4D可見，建系的小鼠胚胎干細(xì)胞懸滴培養(yǎng)形成擬胚體，成球狀，表面有結(jié)節(jié)狀突起。3.5.4、免疫組化檢測0CT4和SSEA-1的表達(dá)將滅菌后的蓋玻片置于培養(yǎng)皿中，鋪上0.1%明膠，將建系后的小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)在上面，48小時后去除培養(yǎng)液。用PBS清洗三次，加入4%多聚甲醛，室溫固定30min，再次用含1%BSA的PBS清洗三次，每次5min，加入封閉液，室溫放置30min，加入細(xì)胞膜蛋白SSEA-1抗體(1:200)和細(xì)胞核蛋白0CT4抗體(1:400)，4t:過夜，含1%BSA的PBS清洗三次后，加入二抗(Cy3-IgG，1:100，Cy2-IgG，1:50)，室溫反應(yīng)lh，PBS洗三次，加入終濃度5iig/mlDAPI，室溫避光放置10min，PBS清洗后，用中性樹脂膠封片，熒光顯微鏡觀察(100X)，DAPI染色結(jié)果如圖4E所示，細(xì)胞膜蛋白SSEA-1染色結(jié)果如圖4F所示，細(xì)胞核蛋白0ct4染色結(jié)果如圖4G所示，細(xì)胞免疫組化后可見光視野如圖4H所示。由圖4F、4G的結(jié)果可知，E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白SSEA-1和細(xì)胞核蛋白0ct4均得到表達(dá)。選取pmalb-EGFP-N2禾口pcDNA3.l_mCK19_hCD25_IRES_tdT0MAT0/hygro(_)共轉(zhuǎn)染得到的4株雙陽性的克隆中的一株建立的胚胎干細(xì)胞系E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0做全能型檢測，其免疫組化檢測0CT4和SSEA-1的表達(dá)結(jié)果見圖4I-4L。由圖4J、4K的結(jié)果可知，E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0小鼠胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白SSEA-1和細(xì)胞核蛋白0ct4均得到表達(dá)。由檢測結(jié)果可知，通過以上方法建立了帶有雙基因(紅色熒光/綠色熒光)標(biāo)記，即ALB/CK19雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGF和E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0。實施例4、傳統(tǒng)/無血清分化法將建系的小鼠胚胎干細(xì)胞向肝祖細(xì)胞分化誘導(dǎo)4.1、傳統(tǒng)血清分化法4.1.1、懸滴法制備EB細(xì)胞配制血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液82%MDM，15%FBS，1%MTG，1%Glutamin，1%P/S(青鏈霉素)。將E14-ALB-mRFP/CK19-EGFPES細(xì)胞稀釋在血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，按照每滴30yl，1X103cell/30ii1將細(xì)胞懸液滴在培養(yǎng)皿蓋上，置于37t:培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天。4.1.2、誘導(dǎo)EB細(xì)胞分化將培養(yǎng)2天后的EB細(xì)胞貼附于鋪有I型膠原(BD公司)的培養(yǎng)皿中，持續(xù)用血清誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每天換液，鏡檢觀測，結(jié)果見圖5。鏡檢觀察，在誘導(dǎo)分化到第5天的時候，發(fā)現(xiàn)CK19開始表達(dá)，但是第7天時迅速消失。如圖5所示，直到第24天(貼壁培養(yǎng)第22天)又開始表達(dá)；ALB的表達(dá)是從23天開始，但是ALB和CK19雙表達(dá)的細(xì)胞很少，因為在ALB和CK19雙陽性的細(xì)胞群周圍分布著ALB陽性細(xì)胞和CK19陽性細(xì)胞，由此可推斷ALB和CK19雙陽性的細(xì)胞可能是肝祖細(xì)胞一個瞬時的狀態(tài)，由于細(xì)胞分化的不同步性，使得ALB和CK19雙陽性細(xì)胞的捕獲具有"拖尾"現(xiàn)象。由以上結(jié)果可知，E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP胚胎干細(xì)胞可以分化為帶有熒光標(biāo)示的CK19/ALB雙陽性的肝祖細(xì)胞。4.2、無血清分化法4.2.1、懸浮法制備EB細(xì)胞配制無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液75%MDM，25%Ham，sF_12，1%P/S，0.05%BSA，0.5%Vc，1%MTG，O.5%N-2，1%B_27。用無血清培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)1.0X104cell/mlE14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0ES細(xì)胞于Petri培養(yǎng)皿中，48小時后，加入終濃度50ng/mlactivinA(苯丙酸諾龍A)，繼續(xù)培養(yǎng)2-4天。4.2.2、FACS分選定形內(nèi)胚層細(xì)胞收集EB細(xì)胞，用0.25%胰酶消化后，離心去上清，用含0.5%BSA的PBS重懸細(xì)胞，清洗兩次后，細(xì)胞計數(shù)，取2X105cell/ml，加入2yg大鼠IgG，室溫封閉15min，分為兩管，其中一管加入抗小鼠CXCR4-Allophycocyanin(別藻藍(lán)蛋白)單克隆抗體和抗小鼠C-KIT-Phycoerythrin(藻紅蛋白)單克隆抗體各10iil，另一管力口入Isotypecontrol-Allophycocyanin(別藻藍(lán)蛋白同型對照)、Isotypecontrol-Phycoerythrin(藻紅蛋白同型對照)各10yl作為陰性對照，4t:孵育30min，再次用含0.5%BSA的PBS清洗細(xì)胞三次，用300illPBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀FACS分選(BectonDickinsonFACSCalibur)得到定形內(nèi)胚層細(xì)胞。4.2.3、誘導(dǎo)定形內(nèi)胚層細(xì)胞到肝祖細(xì)胞在實施例4.2.1所述的無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入50ng/mlBMP4(骨形態(tài)蛋白4)，10ng/mlbFGF(堿性纖維生長因子)，10ng/mlEGF(表皮生長因子)，20ng/mlHGF(肝生長因子)繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過FACS分選后得到定形內(nèi)胚層細(xì)胞以4X105cell/ml細(xì)胞濃度懸浮培養(yǎng)在petri培養(yǎng)皿中，懸浮培養(yǎng)2天后，分化的細(xì)胞再次球狀生長，將球狀體貼附于I型膠原涂層的培養(yǎng)皿中繼續(xù)誘導(dǎo)分化，隔天換液，每天鏡檢觀測。鏡檢觀察到在第IO天，克隆周圍的細(xì)胞變成柱狀上皮狀，帶有大量細(xì)胞空泡，同時開始表達(dá)ALB，主要集中在克隆中間，但沒觀察到CK19的表達(dá)，在第12天時，CK19和ALB開始同時表達(dá)，熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖6A-D所示(200X)，其中6A顯示球狀克隆貼壁培養(yǎng)12天可見光視野；圖6B為圖6A的ALB綠色熒光；圖6C為圖6B的CK19紅色熒光；圖6D為圖6B和6C的合并，黃色細(xì)胞為ALB和CK19雙陽性細(xì)胞。利用FACS對第12天的分化細(xì)胞分析ALB-EGFP7CK19-hCD25+細(xì)胞群，以同時分化的E14.1細(xì)胞作為對照，結(jié)果如圖6E所示。利用FACS軟件分析得到雙陽性細(xì)胞占總分化細(xì)胞23%，ALB-EGFP+/CK19-hCD25—細(xì)胞為15%，則ALB陽性細(xì)胞為總分化細(xì)胞的38%。綜上所述，本發(fā)明選用ALB啟動子和CK19啟動子分別調(diào)控不同的報告基因，建立了兩株基因修飾胚胎干細(xì)胞系E14-ALB-mRFP/CK19-EGFP和E14-ALB-EGFP/CK19-hCD25-IRES-tdT0MAT0，這兩株胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化時，可以分化為帶有綠色/紅色熒光標(biāo)志的CK19/ALB雙陽性的肝祖細(xì)胞，從而得到發(fā)育階段均一的肝祖細(xì)胞，對接下來的肝祖細(xì)胞分化機(jī)制研究和細(xì)胞移植及治療帶來極大的有益效果。權(quán)利要求一種白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，所述小鼠胚胎干細(xì)胞系由白蛋白/角蛋白雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)建立，所述小鼠胚胎干細(xì)胞整合有紅色熒光/綠色熒光蛋白雙報告基因，所述報告基因由組織特異性啟動子白蛋白ALB或角蛋白CK19調(diào)控。2.如權(quán)利要求1所述的小鼠胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，所述綠色熒光蛋白為GFP。3.如權(quán)利要求1所述的小鼠胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，所述紅色熒光蛋白選自mRFP或tdT0MAT0。4.如權(quán)利要求l-3所述任一項小鼠胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，所述小鼠胚胎干細(xì)胞還整合有篩選基因。5.如權(quán)利要求4所述小鼠胚胎干細(xì)胞系，其特征在于，所述篩選基因選自新霉素抗性基因或潮霉素抗性基因。6.—種建立如權(quán)利要求1所述ALB/CK19雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系的方法，其特征在于，包括以下步驟A)構(gòu)建由啟動子調(diào)控，包含報告基因、篩選基因的兩載體；所述啟動子選自白蛋白ALB或角蛋白CK19;所述報告基因選自紅色熒光蛋白mRFP、tdT0MAT0或綠色熒光蛋白EGFP;所述篩選基因選自新霉素抗性基因Neo或潮霉素抗性基因Hygro;B)將步驟A)所得兩載體共轉(zhuǎn)染小鼠胚胎干細(xì)胞；C)篩選存活的、帶有GFP/mRFP或GFP/tdT0MAT0雙基因標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞；D)將步驟C)所得小鼠胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)，建立ALB/CK19雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞系。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述兩載體為以ALB啟動子調(diào)控的包含mRFP、Hygro基因的載體以及以CK19啟動子調(diào)控的包含EGFP、Neo基因的載體。8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述兩載體為以ALB啟動子調(diào)控的包含EGFP、Neo基因的載體以及CK19啟動子調(diào)控的包含人膜白hCD25基因、tdT0MAT0、Hygro基因的載體。9.一種如權(quán)利要求1所述白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系的應(yīng)用，其特征在于，用于標(biāo)志小鼠胚胎干細(xì)胞分化得到肝祖細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明公開了一種白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞系及其建立方法，本發(fā)明的小鼠胚胎干細(xì)胞系由白蛋白/角蛋白雙表達(dá)的小鼠胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)建立，所述小鼠胚胎干細(xì)胞整合有紅色熒光/綠色熒光蛋白雙報告基因，所述報告基因由組織特異性啟動子白蛋白ALB或角蛋白CK19調(diào)控。與基因敲入的方法相比，本發(fā)明利用轉(zhuǎn)染組織特異啟動子操縱報告基因的方法更簡便、更快捷、具有更大的實用性。利用本發(fā)明的白蛋白/角蛋白雙表達(dá)小鼠胚胎干細(xì)胞分化，可以明確地分選得到發(fā)育階段均一的肝祖細(xì)胞，對接下來的肝祖細(xì)胞分化機(jī)制研究和細(xì)胞移植及治療帶來極大的有益效果。文檔編號C12N5/10GK101760450SQ20081020286公開日2010年6月30日申請日期2008年11月18日優(yōu)先權(quán)日2008年11月18日發(fā)明者李陽芳,王欣申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院