專利名稱：：麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白及其編碼基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地，本發(fā)明涉及一種在麻瘋樹(shù)中表達(dá)的JcGGPPs蛋白(麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白，Jatrophacurcasgeranylgeranyldiphosphatesynthase,JcGGPPs)及其核酸序列。
背景技術(shù)：
：麻瘋樹(shù)是一種多用途的植物，常被用在醫(yī)藥、農(nóng)藥、生物柴油、飼料、染料、肥料、水土保持、生態(tài)治理等方面，有可持續(xù)綜合利用的開(kāi)發(fā)潛力。麻瘋樹(shù)毒素-佛波醇脂(12_脫氧-16-羥基佛波醇酯，12-deoxy-16-hydroxyphorbo1)是一種二萜類(lèi)化合物，主要存在于植物種子、樹(shù)皮、葉、根和乳汁中。研究報(bào)道，麻瘋樹(shù)種子油中的佛波醇酯具有雙重作用一方面對(duì)癌細(xì)胞有促長(zhǎng)作用，稱為促癌劑，是劇毒植物毒素，可激發(fā)腫瘤和炎癥；另一方面其還具有抗蟲(chóng)性和抗軟體動(dòng)物的活性。當(dāng)前麻瘋樹(shù)種子油作為生物燃油的研究、開(kāi)發(fā)和應(yīng)用以及最大限度地發(fā)揮其經(jīng)濟(jì)效益和取得良好的生態(tài)環(huán)境效益_其副產(chǎn)物的合理利用已成為生物能源研究的熱點(diǎn)。但由于麻瘋樹(shù)種仁中含有以佛波醇酯為代表的毒素，一方面麻瘋樹(shù)種子油中會(huì)有佛波醇酯(脂溶性)的殘留，另一方面麻瘋樹(shù)種仁榨油后的籽粕，只能將其用作肥料還田，使得這一對(duì)家畜有潛在利用價(jià)值的植物性蛋白飼料被大量浪費(fèi)。因此由于麻瘋樹(shù)毒素的存在限制了麻瘋樹(shù)油的開(kāi)發(fā)和麻瘋樹(shù)的綜合利用。近年來(lái)植物基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，為利用現(xiàn)代生物技術(shù)調(diào)節(jié)麻瘋樹(shù)毒素或其前體的含量開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。利用現(xiàn)代生物技術(shù)一方面可采用RNA干擾技術(shù)將佛波醇酯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因(或轉(zhuǎn)錄因子)導(dǎo)入麻瘋樹(shù)中，獲得轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系、組織或再生植株，以達(dá)到借助基因工程手段培育低毒麻瘋樹(shù)優(yōu)良品種，另一方面可采用轉(zhuǎn)基因植物過(guò)量表達(dá)技術(shù)，將佛波醇酯生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因(或轉(zhuǎn)錄因子)導(dǎo)入麻瘋樹(shù)中，獲得轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞系、組織或再生植株，以達(dá)到借助基因工程手段培育高毒麻瘋樹(shù)優(yōu)良品種?，F(xiàn)有技術(shù)公開(kāi)了香葉基香葉基焦磷酸合成酶(GGPPsynthase)是一種能夠催化法尼基焦磷酸(FPP)和異戊烯基焦磷酸(IPP)發(fā)生電子耦化作用的戊烯基轉(zhuǎn)運(yùn)酶。其能將15碳的FPP和5碳的IPP縮合生成20碳的香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)，香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)是所有二萜類(lèi)化合物的共同前體。佛波醇酯的二萜骨架是由通用的二萜前體GGPP環(huán)化而來(lái)，因此GGPP為佛波醇酯的合成提供了通用前體?，F(xiàn)有技術(shù)("Biochim.Biophys.Acta(生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào))2003，1625(2):214-220"和"Chem.Pharm.Bull(化學(xué)藥理學(xué)報(bào))2001,49(2):197-202"等)先后報(bào)道從三葉橡膠樹(shù)和巴豆中克隆了香葉基香葉基焦磷酸合成酶基因，由于這個(gè)基因編碼的酶催化二萜合成的第一步，并對(duì)二萜合成效率具有重要影響，因此，這第一步是基因工程遺傳改良麻瘋樹(shù)的重要切入點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白編碼序列。本發(fā)明的JcGGPPs蛋白編碼序列包含所說(shuō)基因的保守片斷的構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的RNA干擾載體，被所說(shuō)的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說(shuō)基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物將具有降低的佛波醇酯含量；或，包含所說(shuō)基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達(dá)載體，被所說(shuō)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，以及由轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生的所說(shuō)基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物將具有顯著提高的佛波醇酯含量。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所分離出的DNA分子包括編碼具有麻瘋樹(shù)JcGGPPs活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列有至少70%的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55t:條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列。本發(fā)明分離出的麻瘋樹(shù)JcGGPPs多肽，它包括具有SEQIDN0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDN0.4序列的多肽。本發(fā)明所提供的載體DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。本發(fā)明用上述載體，在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是麻瘋樹(shù)。在本發(fā)明中，"分離的"、"純化的"DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"麻瘋樹(shù)JcGGPPs(或多肽)的編碼基因"指編碼具有麻瘋樹(shù)JcGGPPs活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.l中第39-1148位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQIDNO.l序列的編碼框第39-1148位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQIDNO.1中第39-1148位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%，最佳地至少95%的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的麻瘋樹(shù)JcGGPPs相同功能的蛋白的SEQIDNO.1中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"麻瘋樹(shù)JcGGPPs或多肽"指具有麻瘋樹(shù)JcGGPPs活性的SEQIDNO.2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然麻瘋樹(shù)JcGGPPs相同功能的SEQIDNO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為l-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括麻瘋樹(shù)JcGGPPs的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的麻瘋樹(shù)JcGGPPs多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與麻瘋樹(shù)JcGGPPsDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用麻瘋樹(shù)JcGGPPs多肽的血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，"麻瘋樹(shù)JcGGPPs保守性變異多肽"指與SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2為本發(fā)明的麻瘋樹(shù)JcGGPP蛋白與三葉橡膠JcGGPP蛋白的核苷酸序列的同源(GAP)表。表279%identityin386ntoverlapQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuerySbjctQuery59261CATTCTGGCCGGCGATGCTCTCCTCTCATTCTCCTTTGAACATGTAGCT-GCAGCAACCA119711TCAGAAGGACTTGTTGCAGGTCAAATTGTCGACGTTTG-CAGTGAGGGGAAAGAGGTMA769180-CAGCAGGGCTAGTGGCAGGCCAAATTGTAGAC-ATTGAAAGCGAGGGGAAACAAGT-M236770CGTGA-MGATTTAGAGTATATCCATATTC-ATAAAACTG-CAAAGCTTTTAGAAGCAGC826237CTTTAGAGGACTTAGAGTATATCCACA-TCAACAAGAC-GTCGAAGCTTTTAGAAGCAGC294827AGTTGTTTGCGGAGCCATAGCAGGCGGAGCCGATGATGAGAGCATC-GAAAGAGTGAGM885295AGTTGTTTGCGGGGCGATAATTGGAGGGGCAGATGATGAAAGCA-CAGAAAGAGTTAGM353886AATATGCAAGGTGTATAGGATTATTA911Sbjct354AATATGCGAGGTGTATAGGGTTGTTA379Query:麻瘋樹(shù)JcGGPP蛋白的核酸序列Sbjct:三葉橡膠HbGGPP蛋白的核酸序列(GenBankAccessionNo.AB041631)表3為本發(fā)明的麻瘋樹(shù)JcGGPP與番茄SIGGPP蛋白氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。為了得到與麻瘋樹(shù)JcGGPPs基因相關(guān)的麻瘋樹(shù)cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選麻瘋樹(shù)cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)麻瘋樹(shù)JcGGPPs的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自麻瘋樹(shù)的文庫(kù)。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買(mǎi)到，例如購(gòu)自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與麻瘋樹(shù)JcGGPPs的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的麻瘋樹(shù)JcGGPPs核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起?！┇@得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變弓I入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而力口以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhaseP印tideSynthesis,WHFreemanCo.，SanFrancisco;MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc85:2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。利用本發(fā)明的麻瘋樹(shù)JcGGPPs，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與麻瘋樹(shù)JcGGPPs發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮劑等。本發(fā)明催化法尼基焦磷酸(FPP)和異戊烯基焦磷酸(IPP)生成香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的酶，在抗性試驗(yàn)中具有8明顯的作用，對(duì)保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)有所幫助。因此，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1麻瘋樹(shù)JcGGPPs基因的克隆1.組織分離(isolation)麻瘋樹(shù)種子來(lái)源于四川省攀枝花地區(qū)，麻瘋樹(shù)種子采集后，放在實(shí)驗(yàn)室保存。2.RNA的分離(RNAisolation)將麻瘋樹(shù)種子的種皮剝掉，取出種仁，用研缽研碎，加入液氮后，研磨成粉后，取lOOmg移至1.5mLEP管中，抽提總RNA(兩步裂解法)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。3.基因的全長(zhǎng)克隆(CloningofFull-lengthcDNA)根據(jù)一些植物GGPP的氨基酸保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用同源性基因克隆原理，采用SMARTTMRACEcDNA擴(kuò)增方法(Clontech試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分四個(gè)階段進(jìn)行(1)核心序列的克隆PCR(GGPPF+GGPPR)得到JcGGPP-1(510bp)，回收，連接到pMD_18T載體上，用M13F或M13R作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsingroup,USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneBank+EMBL)，知其核苷酸序列及編碼蛋白與已知的木本植物如三葉橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)等的GGPP基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)GGPP基因。(2)3，-RACE根據(jù)核心序列擴(kuò)增的結(jié)果，設(shè)計(jì)兩個(gè)正向特異引物(Jcgg卯Fl和Jcgg卯F2)。采用二次PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行。第一次PCR(Jcgg卯Fl+AP)得到PCR產(chǎn)物，稀釋100倍后，用其做模板，進(jìn)行第二次PCR(Jcgg卯F2+AP)，得到JcGGPP-2(523bp)，回收，連接，測(cè)序過(guò)程同(1))。(3)5，-RACE根據(jù)核心序列的擴(kuò)增的結(jié)果，設(shè)計(jì)兩個(gè)反向特異引物(Jcgg卯Rl和Jcgg卯R2)。采用二次PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行。第一次PCR(Jcgg卯Rl+UPM)得到PCR產(chǎn)物，稀釋100倍后，用其做模板，進(jìn)行第二次PCR(Jcgg卯R2+NUP)，得到JcGGPP-3(722bp)，回收，連接，測(cè)序(過(guò)程同(l))。(4)編碼序列的克隆將核心序列、5'RACE與3'RACE測(cè)序結(jié)果序列比對(duì)并進(jìn)行拼接，得到全長(zhǎng)片段序列信息，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物進(jìn)行Jc-gg卯編碼區(qū)(Jcggppfull-F+Jcgg卯full-R)PCR擴(kuò)增，得到JcGGPPs編碼區(qū)(lllObp)(過(guò)程同(l))。9BLAST的結(jié)果證明從麻瘋樹(shù)中新得到的基因確為一個(gè)植物GGPP基因。由于已知的巖薔薇(Cistuscreticus)的CcGGPPs具有催化法尼基焦磷酸(FPP)和異戊烯基焦磷酸(IPP)生成香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的酶的功能(PaterakiandKanellisMontamat，2008)，故推測(cè)此新克隆的基因具有相同的功能。通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開(kāi)放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物Jcgg卯full-F5'-AAGTATCAAGAATTCAAAACCCATTGT-3'(SEQIDNO.3)為正向弓|物，Jcggppfull-R5，-GTGATATATATCCATCCCATCTTAGTA-3，(SEQIDNO.4)為反向引物，以總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR條件為94°C5分鐘，隨之以94°C1分鐘、58"1分鐘和72°C2分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72t:延伸10分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1397bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQIDNO.1所示的序列。實(shí)施例2麻瘋樹(shù)JcGGPPs基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的麻瘋樹(shù)JcGGPPs全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為1414bp，詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO.1，其中開(kāi)放讀框位于39-1148位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出麻瘋樹(shù)JcGGPPs的氨基酸序列，共370個(gè)氨基酸殘基，分子量40371.12，pl為6.03。詳細(xì)序列見(jiàn)SEQIDNO.2。將麻瘋樹(shù)JcGGPPs的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non_redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB禾口Non_redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與三葉橡膠HbGGPPs蛋白的核酸序列(AB041631)在核苷酸水平上具有79%的同源性(附表2);在氨基酸水平上，它與番茄SlGGPPs基因(ABB82554)有62%的相同性和77%的相似性(見(jiàn)表3)。由此可見(jiàn)，麻瘋樹(shù)JcGGPPs與植物的GGPPs無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認(rèn)為麻瘋樹(shù)JcGGPPs在催化法尼基焦磷酸(FPP)和異戊烯基焦磷酸(IPP)生成香葉基香葉基焦磷酸(GGPP)的反應(yīng)上也具有相似的功能。實(shí)施例3麻瘋樹(shù)JcGGPPs在大腸桿菌中進(jìn)行功能驗(yàn)證在該實(shí)施例中，將全長(zhǎng)的麻瘋樹(shù)JcGGPPs編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以鑒定JcGGPPs的活性。麻瘋樹(shù)JcGGPPs原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)麻瘋樹(shù)JcGGPPs的氨基酸序列，設(shè)計(jì)蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pBluescriptIIKS-vector載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將麻瘋樹(shù)JcGGPPs基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pBluescriptIIKS-vector(Stratahene)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B(該菌帶有pACCAR25AcrtE質(zhì)粒，質(zhì)粒上帶有來(lái)源于噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)合成類(lèi)胡蘿卜素的ctr基因簇，但缺失該種中的ctrE即GGPP基因)，篩選鑒定得到含有JcGGPP表達(dá)載體的工程菌DHlOB-JcGGPP。[one]結(jié)果觀察在生長(zhǎng)大腸桿菌的平板上，沒(méi)有轉(zhuǎn)入JcGGPP基因的大腸桿菌DH10B在平板上生長(zhǎng)的顏色為白色，轉(zhuǎn)入了JcGGPP基因的大腸桿菌DH10B在平板上生長(zhǎng)的顏色為黃色，說(shuō)明在轉(zhuǎn)入了JcGGPP基因的轉(zhuǎn)化平板上有類(lèi)胡蘿卜素的生成，進(jìn)一步說(shuō)明JcGGPP能代替噬夏孢歐文氏菌(E.uredovora)中的ctrE基因，促進(jìn)類(lèi)胡蘿卜素的生成。使用來(lái)源于小鼠和擬南芥的GGPP基因做對(duì)照，轉(zhuǎn)入麻瘋樹(shù)JcGGPP基因的菌的顏色比轉(zhuǎn)入小鼠和擬南芥的GGPP基因的菌的顏色深，說(shuō)明麻瘋樹(shù)JcGGPP基因具有較高的活性。實(shí)施例4麻瘋樹(shù)JcGGPPs在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和活性分析在該實(shí)施例中，將全長(zhǎng)的麻瘋樹(shù)IcGGPPs蛋白編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白，用以鑒定重組蛋白具有GGPP合成酶的活性。將麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白多肽以融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白的氨基酸序列，設(shè)計(jì)蛋白編碼區(qū)的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pQE30載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pQE30載體(QIAGEN)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15，篩選鑒定得到含有pQE30-JcGGPPs表達(dá)載體的工程菌M15-pQE30-JJcGGPPs。表達(dá)JcGGPPs重組蛋白(rJcGGPPs)的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的M15-pQE30-JCHMGR工程菌于3ml含100yg/ml氨芐青霉素和50yg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1:100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100g/ml氨芐青霉素和50iig/ml卡那霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至0D6。。達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度lmmol/L繼續(xù)于37t:分別培養(yǎng)0，l，2，4小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2XSDS上樣緩沖液50ill，蒸餾水45ill，二巰基乙醇5yl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，lOOOOrpm離心1分鐘，上清液中加入12%SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)JcGGPPs融合蛋白的工程菌。rJcGGPPs融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)JcGGPPs融合表達(dá)蛋白的工程菌M15-pQE30-JcGGPPs，經(jīng)離心沉淀收集菌體，并根據(jù)廠家(QIAGEN)的說(shuō)明書(shū)用組氨酸結(jié)合(His.Bind)樹(shù)脂進(jìn)行親和層析，并經(jīng)洗脫緩沖液(1Mimidazole,500mMNaCl，20mMTris-HClpH7.9)洗脫來(lái)收集M15-pQE30_JcGGPPs融合蛋白。純化的麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶的活力測(cè)定按Kainou等(Biochim.Biophys.Acta1999,1437:333-340)的方法對(duì)表達(dá)純化的香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白進(jìn)行酶活力的測(cè)定，研究其對(duì)香葉基香葉基焦磷酸生成的影響。測(cè)定的反應(yīng)體系包括1.OmM的MgCl2，0.1%(w/v)的TritonX-IOO，50mM的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)，10iiM的[1-14C]IPP(異戊烯基焦磷酸)(活性為0.92TBq/mol)，5yM的法尼基焦磷酸(FPP)，200yg酶的樣品(濃度0.2mg/ml)。反應(yīng)流程如下樣品混合后，放在3(TC條件下培養(yǎng)120分鐘，反應(yīng)產(chǎn)物，如香葉基香葉基焦磷酸，用丁醇飽和水溶液提取，用酸性磷酸酶水解。水解產(chǎn)物用正己烷提取，用反向薄層層析進(jìn)行分析(丙酮/水=19:l，v/v)。用圖像分析儀BAS1500-Mac(FujiFilmCo.)分析樣品的活性。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了一個(gè)平行對(duì)照。結(jié)果表明，表達(dá)的蛋白的確具有催化異戊烯基焦磷酸(IPP)和法尼基焦磷酸(FPP)生成香葉基香葉基焦磷酸的酶活性。實(shí)施例5麻瘋樹(shù)JcGGPPs基因在麻瘋樹(shù)中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)1.含目的基因(麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白基因)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白的全長(zhǎng)序列(SEQIDNO.1)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如pMD18T)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pCAMBIA1304或改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤(pán)法技術(shù)轉(zhuǎn)化麻瘋樹(shù)。2.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化麻瘋樹(shù)1)用無(wú)菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽(yáng)性菌落，接種于2mlYEB液體(Sm+，Kan+)，28°C，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時(shí)；2)室溫下4，OOOg離心10min;3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的0De。。=0.5左右；4)取生長(zhǎng)一個(gè)月左右的麻瘋樹(shù)的無(wú)菌外植體，將其剪成約1平方厘米見(jiàn)方的小片或小段；5)將步驟(4)的小片或小段放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無(wú)菌濾紙上吸干菌液；6)把經(jīng)浸染的小片或小段放于MS培養(yǎng)基上，28t:暗培養(yǎng)48小時(shí)；7)將小片或小段轉(zhuǎn)到愈傷組織培養(yǎng)基(MS+6-BA1.Omg/L+NAA0.lmg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28。C光照下培養(yǎng)，7-15天可見(jiàn)愈傷組織的形成；8)約40天后可見(jiàn)分化芽長(zhǎng)出，待芽長(zhǎng)大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上進(jìn)行生根培養(yǎng)，10天左右生根；9)等根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開(kāi)始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。3.利用GUS染色和PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)麻瘋樹(shù)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株取一小片葉片放入GUS染液(配置方法①x-gluc:用N，N-二甲基甲酰胺配成20mM的儲(chǔ)存液，分裝成每管100ul，保存于-2(TC;②底物溶液lmMx-gluc于100mM磷酸鈉緩沖液(pH7)含10-100mMEDTA，l-5mM鐵氰化鉀，l-5mM亞鐵氰化鉀，0.l%TritronX-100;③使用時(shí)，將x-gluc用底物溶液稀釋20倍)，37t:反應(yīng)過(guò)夜，75%乙醇脫綠后檢測(cè)。待芽生根并長(zhǎng)至約6cm時(shí)，移栽到裝有l(wèi):1:1的泥炭土、蛭石和珍珠巖混合物小型的塑料花盆中自然生長(zhǎng)，同時(shí)取葉片提取DNA，PCR鑒定陽(yáng)性，將鑒定為陰性的苗丟棄，陽(yáng)性苗繼續(xù)培養(yǎng)。4.利用Northernblotting檢測(cè)JcGGPPs基因在轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)植株中的表達(dá)1)RNA的提取待轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)葉片長(zhǎng)到2-3片葉時(shí)抽取麻瘋樹(shù)葉的RNA。以正常生長(zhǎng)的植株作為對(duì)照(條件同上)，利用TRIzol試劑盒(GIBCOBRL，USA)提取RNA。2)RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測(cè)0D26。；RNA含12量計(jì)算10D26。=40iig/ml。3)總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離①取6ml25(倍)電泳緩沖液，加入117ml無(wú)菌水，混勻。②稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55t:水浴中。③于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55°C的凝膠溶液中，混勻。④迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。⑤將提取的RNA(20iig)溶解于RNA變性溶液中，在65"C下加熱IO分鐘，然后立即放在冰上。⑥在樣品中加入2ulIOX上樣緩沖液，混勻。⑦在電泳液未蓋過(guò)膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。4)RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移①轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10XSSC浸泡。②將濕潤(rùn)的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2XSSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡。③濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。④轉(zhuǎn)移后，將膜于8(TC烘烤2小時(shí)。5)膜上雜交信號(hào)的檢出①將膜浸在5XDendart's，O.1%SDS，O.lmg/ml鮭魚(yú)精DNA，65。C下預(yù)雜交2小時(shí)。②將用GeneImagesContentsCDP-StarTMlabellingmodule標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入(1)的雜交液中，于65t:雜交16-24小時(shí)。③取出膜，置于洗膜液I(1XSSC，1XSDS)中，于65t:漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液11(0.1XSSC，1%SDS)中于65t:漂洗3次，每次15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說(shuō)明書(shū))。Northern雜交表明；轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)的JcGGPPs轉(zhuǎn)錄水平比未轉(zhuǎn)基因的對(duì)照材料的表達(dá)水平明顯高得多。5.轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)中佛波醇酯含量的測(cè)定對(duì)轉(zhuǎn)基因的麻瘋樹(shù)植株中的佛波醇酯含量可通過(guò)下列步驟測(cè)定1)麻瘋樹(shù)種子油的提取。將轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)的種子加液氮研磨成細(xì)粉后，加入石油醚，超聲波振蕩lh。3000r/min下，離心10min，取上清液，5(TC左右恒溫水浴加熱至肉眼可見(jiàn)其中的籽油沉積于管底。剩余的沉淀部分再加石油醚，超聲波振蕩lh，同樣條件下離心，取上清液與上一步驟的溶液混合，繼續(xù)恒溫加熱直至管中的石油醚差不多揮發(fā)完全。剩余的溶液即為種子油。2)麻瘋樹(shù)毒素(佛波醇酯)的分離和提取。取一定量的麻瘋樹(shù)種子油，加入制備好的硅膠柱，石油醚和二氯甲烷洗滌后，用甲醇進(jìn)行洗脫液后真空濃縮，分離步驟采用薄層層析(TLC)進(jìn)行檢測(cè)(使用加熱的硫酸香蘭素作為展開(kāi)劑)。3)麻瘋樹(shù)毒素(佛波醇酯)的含量測(cè)定。使用高效液相法進(jìn)行含量的測(cè)定。麻瘋樹(shù)毒素(佛波醇酯)的含量應(yīng)比對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植株)高。實(shí)施例6麻瘋樹(shù)JcGGPPs基因在麻瘋樹(shù)中進(jìn)行RNA干擾1.含目的基因(麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白基因)的RNA干擾載體的構(gòu)建根據(jù)麻瘋樹(shù)JcGGPPs蛋白的全長(zhǎng)序列(SEQIDNO.1)(屬于正義片段)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR擴(kuò)增后得到互補(bǔ)的反義片段，將正義片斷和反義片斷分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)并連上載體pHANNIBAL形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)雙酶切將莖環(huán)結(jié)構(gòu)的片斷連入PCAMBIA1301載體，構(gòu)建成RNA干擾載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化麻瘋樹(shù)。(pHANNIBAL載體含有在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)、CaMV35S啟動(dòng)子，0CS終止子、PDK內(nèi)含子以及一些多克隆位點(diǎn)，并在其它的某些位置含有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(HelliwellandWaterhouse，2003)。2.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化麻瘋樹(shù)方法同實(shí)施例4中的2利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化麻瘋樹(shù)。3.利用GUS染色和PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)麻瘋樹(shù)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株方法同實(shí)施例4中的3利用GUS染色和PCR擴(kuò)增的方法檢測(cè)麻瘋樹(shù)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。4.利用Northernblotting檢測(cè)JcGGPPs基因在轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)植株中的表達(dá)方法同實(shí)施例4中的4利用Northernblotting檢測(cè)JcGGPPs基因在轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)植株中的表達(dá)。5.轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)中佛波醇酯含量的測(cè)定方法同實(shí)施例4中的5轉(zhuǎn)基因麻瘋樹(shù)中佛波醇酯含量的測(cè)定。麻瘋樹(shù)毒素(佛波醇酯)的含量應(yīng)比對(duì)照(非轉(zhuǎn)基因植株)低。序列表〈110>復(fù)旦大學(xué)〈120〉麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白及其編碼基因〈160>4〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>1414〈212>DNA〈213>麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)〈220〉〈221>CDS〈222>(39).(1148)〈223〉〈400>1aagtatcaagaattcaaaacccattgtgaattcttgatatggetttctctgcaacaMetAlaPheSerAlaThr15geccctgettgtaacaatattcttttcaagaaatecaccttcaatggcetcAlaProAlaCysAsnAsnlieLeuPheLysLysSerThrPheAsnGlyLeu101520aagaaccgtcctgaaetcccatttaaccacetcaagtttcattttcgtatgLysAsnArgProGluLeuProPheAsnHisLeuLysPheHisPheArgMet25303540aaaatgaccaccaccactgtccaggtggttteggactectecccggtgacgLysMetThrThrThrThrValGinValValSerAspSerSerProValThr455055caaccacttgaaaccacccaagaatctetctctttctegcccaagattetc14GinProLeuGluThrThrGinGluSerLeuSerPheSerProLyslieLeu606570etccct朋cttcccctttg朋g朋tatEltggt￡lctg朋ggCEl朋tgttLeuProAsnPheProPheGluGluTyrMetValLeuLysAlaAsnAsnVal75808590朋tg朋gCElttagatgCElgt￡lcccttg朋ccatCC3ttaatecatAsnGluAlaLeuAspLysAlaValProLeuAsnHisProLeuLyslieHis95100105gCElgcgEltg3gatactctcttetcgccggcggg朋gcgtgtceggCC3attAlaAlaMetArgTyrSerLeuLeuAlaGlyGlyLysArgValArgProlie110115120125ttatgcattgetgcctgtgagttagt￡lggcgatg朋gccgcggccEltgLeuCyslieAlaAlaCysGluLeuValGlyGlyAspGluAlaAlaAlaMet130135140CC3tctgCEltgcgCElEltgg朋EltgattcatactEltgtctttaateC3Cg￡lCProSerAlaCysAlaMetGluMetlieHisThrMetSerLeulieHisAsp145150155gatcttccttgcEltgg￡lC朋tgatgatcttCg￡leggcct朋tAspLeuProCysMetAspAsnAspAspLeuArgArgGlyLysProThrAsn160165170175catEltgttcggcg朋g朋actgcgatecttgccgatgCElEltgcttHisLysMetPheGlyGluGluThrAlalieLeuAlaGlyAspAlaMetLeu180185190tctttagCElttcgagC3Categet3gagCEl3CC朋g朋tgtttcgccggagSerLeuAlaPheGluHislieAlaArgAlaThrLysAsnValSerProGlu195200205210Cg￡lgtggttCg￡lgtcateactgagcttgg￡itcggetgttgggteag朋ArgValValArgVallieThrGluLeuGlySerAlaValGlySerGluGly215220225cttgttgCElggtc朋attgtcg￡lCgtttgcElgtgagggggaggt￡l朋cLeuValAlaGlyGinlieValAspValCysSerGluGlyLysGluValAsn230235240gtggatttagagtatatecatattcatactgCEl朋gcttttag朋ValLysAspLeuGluTyrlieHislieHisLysThrAlaLysLeuLeuGlu245250255260gCElgC3gttgtttgcgccategCElggcgccgatgatgagageateAlaAlaValValCysGlyAlalieAlaGlyGlyAlaAspAspGluSerlie265270275g朋3gagtg3gatatgCEl￡iggtgtatettattatttc朋gtgattGluArgValArgLysTyrAlaArgCyslieGlyLeuLeuPheGinVallie280285290295gatgatattttggatgtg朋gteategg朋gagetc朋gactgccAspAsplieLeuAspValThrLysSerSerGluGluLeuGlyLysThrAla300305310aaagatttggt￡lElgtgataaagCElacttatcct朋gcttctgattGlyLysAspLeuValSerAspLysAlaThrTyrProLysLeuLeuGlylie315320325g￡lCgaggCEl3gattagCElgcgttggt￡lgatg朋get朋tc朋gagAspGluAlaArgLysLeuAlaAlaLysLeuValAspGluAlaAsnGinGlu330335340345cttgettattttgattctgcc朋ggetgetCC3ctgtaccattttget朋tLeuAlaTyrPheAspSerAlaLysAlaAlaProLeuTyrHisPheAlaAsn350355360tacattgetElgt￡lggc朋朋ttaattagtgggctagttgttttttttttttatgcaatTyrlieAlaSerArgGinAsn365370tgctattattatataattaatgtcacttgcatcaattgttggtttatatgtataatgttttttgatcaataaaattttttttttgtetgeaaaataaatttattttatcatttatacatatagtctaagatgggatgctgtatgetggaggatacte朋ctecteagatgggatggatet〈210>2〈211>370〈212>PRT〈213〉麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)〈400>2MetAlaPheSerAlaThrAlaProAlaCysAsnAsnlieLeuPheLys151015LysSerThrPheAsnGlyLeuLysAsnArgProGluLeuProPheAsn202530HisLeuLysPheHisPheArgMetLysMetThrThrThrThrValGin354045ValValSerAspSerSerProValThrGinProLeuGluThrThrGin505560GluSerLeuSerPheSerProLyslieLeuLeuProAsnPheProPhe65707580GluGluTyrMetValLeuLysAlaAsnAsnValAsnGluAlaLeuAsp859095LysAlaValProLeuAsnHisProLeuLyslieHisAlaAlaMetArg16100105110TyrSerLeuLeuAlaGlyGlyLysArgValArgProlieLeuCyslie115120125AlaAlaCysGluLeuValGlyGlyAspGluAlaAlaAlaMetProSer130135140AlaCysAlaMetGluMetlieHisThrMetSerLeulieHisAspAsp145150155160LeuProCysMetAspAsnAspAspLeuArgArgGlyLysProThrAsn165170175HisLysMetPheGlyGluGluThrAlalieLeuAlaGlyAspAlaMet180185190LeuSerLeuAlaPheGluHislieAlaArgAlaThrLysAsnValSer195200205ProGluArgValValArgVallieThrGluLeuGlySerAlaValGly210215220SerGluGlyLeuValAlaGlyGinlieValAspValCysSerGluGly225230235240LysGluValAsnValLysAspLeuGluTyrlieHislieHisLysThr245250255AlaLysLeuLeuGluAlaAlaValValCysGlyAlalieAlaGlyGly260265270AlaAspAspGluSerlieGluArgValArgLysTyrAlaArgCyslie275280285GlyLeuLeuPheGinVallieAspAsplieLeuAspValThrLysSer290295300SerGluGluLeuGlyLysThrAlaGlyLysAspLeuValSerAspLys305310315320AlaThrTyrProLysLeuLeuGlylieAspGluAlaArgLysLeuAla325330335AlaLysLeuValAspGluAlaAsnGinGluLeuAlaTyrPheAspSer340345350AlaLysAlaAlaProLeuTyrHisPheAlaAsnTyrlieAlaSerArg355360365GinAsn370〈210>3〈211>27〈212>DNA〈213>麻瘋樹(shù)(Jartrophacurcas)〈400>3AAGTATCAAGAATTCAAAACCCATTGT〈210>4〈211>27<212>DNA〈213〉麻瘋樹(shù)(Jatrophacurcas)〈400>4GTGATATATATCCATCCCATCTTAGTA18權(quán)利要求一種編碼麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白的核酸，其特征在于具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.按權(quán)利要求1所述的編碼麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白的核酸，其特征在于所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列有至少70%的同源性。3.按權(quán)利要求1所述的編碼麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白的核酸，其特征在于所述的核苷酸序列在40-55t:條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列雜交。4.一種麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白，其特征在于具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列。5.—種分離的麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白多肽，其特征在于它包括具有SEQIDN0.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。6.按權(quán)利要求5所述的麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白多肽，其特征在于所述的保守性變異多肽是與SEQIDNO.2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。7.按權(quán)利要求5所述的麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白多肽，其特征在于所述的保守性變異多肽是與SEQIDN0.2的氨基酸序列相比，有至多8個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。8.按權(quán)利要求5所述的麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白多肽，其特征在于所述的保守性變異多肽是與SEQIDN0.2的氨基酸序列相比，有至多5個(gè)氨基酸性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。9.一種核酸分子探針，其特征在于該分子具有麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。全文摘要本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體涉及一種在麻瘋樹(shù)中表達(dá)的JcGGPPs蛋白(麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶蛋白，Jatrophacurcasgeranylgeranyldiphosphatesynthase，JcGGPPs)及其及其編碼基因。所分離出的DNA分子包括編碼具有麻瘋樹(shù)香葉基香葉基焦磷酸合成酶活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQIDNO.1中從核苷酸第39-1148位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明是一種催化苯甲酰CoA和去苯甲酰紫杉醇生成紫杉醇的酶，對(duì)保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)有所幫助。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101736019SQ200810202999公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者侯嶸,唐克軒,林娟,金元杰申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)