專(zhuān)利名稱(chēng)：：CYP1A2基因的SNPrs11632814及其在相關(guān)藥物代謝活性檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。更具體地涉及細(xì)胞色素氧化酶P4501A2基因(CytochromeP4501A2，CYP1A2)的單核苷酸多態(tài)性(single薦leotid印olymorphism，SNP)及其與藥物代謝活性檢測(cè)之間相關(guān)性。本發(fā)明還涉及檢測(cè)所述SNP的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
：藥物作用效應(yīng)的個(gè)體差異已經(jīng)是一種普遍存在的現(xiàn)象，而由于這種差異造成的藥物無(wú)效或嚴(yán)重藥物毒副反應(yīng)已越來(lái)越引起臨床醫(yī)生和藥物遺傳學(xué)家的關(guān)注。藥物代謝能力和藥物效應(yīng)的差異是藥效個(gè)體差異的主要原因之一，一些藥物代謝和效應(yīng)相關(guān)基因已被發(fā)現(xiàn)在人群中不但存在DNA序列的變異，而且其RNA表達(dá)水平也存在很大的個(gè)體差異。負(fù)責(zé)藥物代謝的酶主要有兩大類(lèi)一類(lèi)稱(chēng)為I相藥物代謝酶，它們的作用主要氧化激活藥物分子，為下一步反應(yīng)提供底物；另一類(lèi)是II相藥物代謝酶，它們的作用是在I相代謝酶反應(yīng)產(chǎn)物上加上大極性基團(tuán)，例如糖基，磺酸基，乙?；虬被?，從而增加藥物分子的溶解性，以利于排出體外。I相藥物代謝酶主要包括細(xì)胞色素氧化酶P450(CYP450)和核黃素單氧化酶(FMO)，也包含部分羥化酶，過(guò)氧化物酶以及單胺氧化酶等。細(xì)胞色素氧化酶是最主要的藥物代謝酶，并被廣泛研究。已發(fā)現(xiàn)人類(lèi)基因組中約有55個(gè)這類(lèi)基因，其中4個(gè)基因(CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19和CYP2D6)最為主要。II相藥物代謝酶主要包括UDP糖基轉(zhuǎn)移酶(UGTs)，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)，磺基轉(zhuǎn)移酶(SULTs)和N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(NATs)等。細(xì)胞色素氧化酶P4501A2(cytochromesP4501A2，CYP1A2)是人肝臟中一種重要的氧化還原酶。近年來(lái)，大量研究已發(fā)現(xiàn)，CYP1A2在人體內(nèi)的表達(dá)存在很大的個(gè)體差異。不同個(gè)體間轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)差異可以高達(dá)40倍。因此，了解人類(lèi)藥物代謝和效應(yīng)相關(guān)基因的多樣性的遺傳基礎(chǔ)是生物醫(yī)學(xué)研究中藥物基因組學(xué)研究的主要目的之一。CYP1A2是重要的I相藥物代謝酶，是P450主要代謝酶之一，在人類(lèi)肝臟中，約占P450酶總量的13%。CYP1A2的mRNA表達(dá)量在個(gè)體之間的差異可以高達(dá)40倍，由此導(dǎo)致不同個(gè)體之間對(duì)藥物代謝能力的顯著差異。目前已知，臨床上像theophylline、tacrine、clozapine、olanzapine等藥物是主要由CYP1A2來(lái)進(jìn)行I相藥物代謝的。例如，對(duì)咖啡因(Caffeine)而言，90%是由CYP1A2來(lái)進(jìn)行代謝的；對(duì)clozapine(氯氮平)而言，約30%是由CYP1A2來(lái)進(jìn)行代謝的。目前FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的藥物代謝酶檢測(cè)芯片是羅氏公司與Affymetrix公司共同開(kāi)發(fā)的，它上面整合了CYP2D6和CYP2C19的已報(bào)道的一些功能位點(diǎn)信息，用于判斷個(gè)體對(duì)以這兩個(gè)酶作為主要藥物代謝酶的藥物的代謝能力。CYP1A2在臨床上面參與代謝的藥物種類(lèi)甚多。其在個(gè)體之間的表達(dá)差異可高達(dá)40倍，是其藥代能力個(gè)體差異的一個(gè)主要來(lái)源。因此要想對(duì)個(gè)體CYP1A2的活性做出預(yù)測(cè)，就有必要對(duì)影響其表達(dá)量的或者可以預(yù)測(cè)其表達(dá)量的SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型。以其可以指導(dǎo)臨床合理用藥，提高藥物的安全性和有效性，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療的目標(biāo)。目前的研究表明，CYP1A2基因的一些多態(tài)性與藥物的代謝能力相關(guān)，其中多數(shù)多態(tài)性并不導(dǎo)致CYP1A2蛋白的氨基酸變化。這提示，在CYP1A2酶活性不改變的情況下(因?yàn)槊傅陌被嵝蛄形锤淖?，CYP1A2的這些多態(tài)性(包括SNP)是通過(guò)影響CYP1A2的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)的。因?yàn)榈鞍椎谋磉_(dá)量與其mRNA的數(shù)量基本上呈正比，因此鑒別出與CYPlA2的表達(dá)量相關(guān)的SNP就成為研究重點(diǎn)。W02008032921中公開(kāi)了測(cè)定包括CYP1A2在內(nèi)的多種基因的基因型的SNP以及相應(yīng)的基因芯片，并且用這些SNP和基因芯片進(jìn)行基因分型的應(yīng)用。JP2007006713中公開(kāi)了用于測(cè)定藥物代謝酶CYP1A2基因的多態(tài)性的引物集、引物和探針，以及用于檢測(cè)CYP1A2酶活性的檢測(cè)試劑。在該文獻(xiàn)中，在施用通過(guò)CYP1A2代謝的藥物之前，先檢測(cè)受試者的與CYP1A2相關(guān)的代謝能力相關(guān)的基因多態(tài)性，從而避免或減少與該藥物相關(guān)的不良反應(yīng)或副作用。W003014387中公開(kāi)了一種檢測(cè)基因CYP1A2的基因型的方法，在該文獻(xiàn)中提示，CYP1A2基因與藥物代謝能力相關(guān)。中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200510088646.0中公開(kāi)了一種與藥物代謝能力相關(guān)聯(lián)的基因CYP1A2基因型方法，其中對(duì)CYP1A2基因的G-3860A位點(diǎn)、G-3113A和T5347C位點(diǎn)進(jìn)行檢此外，已有報(bào)道CYP1A2與部分癌癥的發(fā)生有相關(guān)關(guān)系，例如在W003014387和中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200510088646.0中都提及CYP1A2基因與肝癌易感性也存在一定的相關(guān)性。綜上所述，本領(lǐng)域雖然已知CYP1A2酶或CYP1A2基因的多態(tài)性與某些藥物的代謝能力相關(guān)，但是人們尚未影響在CYP1A2中存在那些具體的多態(tài)性(包括SNP)，也不清楚哪些多態(tài)性(包括SNP)與藥物代謝活性或能力的大小相關(guān)。因此，為了減少藥物對(duì)不同個(gè)體的副作用，本領(lǐng)域迫切需要尋找與藥物代謝活性或能力的大小相關(guān)的CYP1A2的SNP，以及相關(guān)的可用于藥物代謝活性檢測(cè)的方法和試劑
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供CYP1A2基因中與藥物代謝活性或能力的大小相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明的另一目的是提供可用于預(yù)先評(píng)估個(gè)體的藥物代謝活性的方法及試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種體外檢測(cè)(尤其是非診斷性檢測(cè))樣品是否存在細(xì)胞色素氧化酶P4501A2基因CYP1A2的單核苷酸多態(tài)性的方法，包括步驟(a)用CYP1A2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的CYP1A2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；禾口(b)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性761位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。在另一優(yōu)選例中，所述的基因特異性引物具有SEQIDNO:2或3的序列。在另一優(yōu)選例中，所述的擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-3000bp，且含有SEQIDNO:1中第4761位。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于預(yù)測(cè)個(gè)體的藥物代謝活性的試劑盒，它包括特異性擴(kuò)增CYP1A2基因或轉(zhuǎn)錄本的引物，所述的引物擴(kuò)增出長(zhǎng)度為50-3000bp且含有SEQIDNO:1中第761位的擴(kuò)增產(chǎn)物。在另一優(yōu)選例中，所述的突變是以下的單核苷酸多態(tài)性761位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDNO:l。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有選自下組的試劑(i)與SEQIDNO:1中第761位的突變結(jié)合的探針；或(ii)識(shí)別SEQIDNO:1中第761位的突變限制性?xún)?nèi)切酶。在另一優(yōu)選例中，所述的引物具有SEQIDNO:2或3的序列。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸的序列為細(xì)胞色素氧化酶P4501A2基因CYP1A2野生型的基因組核苷酸序列，并且存在SEQIDNO:l中第761位A—G突變。在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是第761位為C的SEQIDNO:1所示的序列。在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第三方面中所述的多核苷酸的用途，它用于制備檢測(cè)個(gè)體的藥物代謝活性的試劑或試劑盒。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑為引物、引物集、探針或核酸芯片。在另一優(yōu)選例中，所述的引物或引物集可特異性地?cái)U(kuò)增出含SEQIDNO:l中第761位的擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的探針能夠與含SEQIDNO:1中第761位的核酸發(fā)生特異性結(jié)合；所述的核酸芯片上含有的探針，所述的探針能夠與含SEQIDNO:1中第761位的核酸發(fā)生特異性結(jié)合。在本發(fā)明的第五方面，提供了一種可用于檢測(cè)藥物代謝活性的核酸芯片，所述的芯片包括基板以及固定在基板上的寡核苷酸探針，所述的探針能夠與含SEQIDNO:l中第761位的核酸發(fā)生特異性結(jié)合，并且鑒別出SEQIDNO:1中第761位的核苷酸是A還是G。在另一優(yōu)選例中，所述的藥物選自下組茶堿、他克林、氯氮平、奧氮平、氟他米特、夫羅曲普坦、利多卡因、褪黑激素、美西律、羅哌卡因、替扎尼定、氨苯蝶啶、佐米曲坦；或?qū)σ阴０被印⒛?、阿米替林、氯丙咪嗪、環(huán)苯扎林、三氟戊肟胺、丙米嗪、馬普替林、萘普生、雌二醇、昂丹司瓊、奮乃靜、普羅帕酮、普萘洛爾、利魯唑、硫利達(dá)嗪、維拉帕米、右旋華法林、積璐琛、或佐替平。在本發(fā)明的第六方面，提供了一種對(duì)藥物代謝活性進(jìn)行預(yù)測(cè)的方法，它包括步驟檢測(cè)待檢個(gè)體的CYP1A2基因和/或轉(zhuǎn)錄本，并與正常的CYP1A2基因和/或轉(zhuǎn)錄本相比較是否存在以下的單核苷酸多態(tài)性761位A—G;其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1，如果存在所述的單核苷酸多態(tài)性就表明對(duì)該個(gè)體而言其藥物代謝活性高于普通人群。5應(yīng)理解，上述的以及本文下文中所詳述的任二個(gè)或多個(gè)技術(shù)特征都可相互組合，以構(gòu)成新的技術(shù)方案。在此申請(qǐng)中，為了節(jié)省篇幅，不再一一列出。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入而廣泛的研究，對(duì)CYP1A2基因的SNP進(jìn)行了測(cè)定和分析。首次發(fā)現(xiàn)和證明了CYP1A2基因的部分SNP可顯著影響CYP1A2的mRNA拷貝數(shù)，進(jìn)而影響藥物代謝活性。關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，在CYP1A2的SEQIDNO:1所示序列的第761位的SNP(761位A—G)可顯著導(dǎo)致CYP1A2的mRNA拷貝數(shù)(P<0.01)，因此可作為預(yù)測(cè)藥物代謝活性的特異性SNP。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。CYP1A2基因如本文所用，"CYP1A2基因"指編碼細(xì)胞色素氧化酶P4501A2的多核苷酸分子，包括DNA和RNA。該術(shù)語(yǔ)還包括CYP1A2的基因組序列，尤其是含有啟動(dòng)子區(qū)域的多核苷酸。如本文所用，"CYP1A2蛋白"或"CYP1A2酶"可互換使用，指細(xì)胞色素氧化酶P4501A2。人的細(xì)胞色素氧化酶P4501A2基因(CYP1A2)的詳細(xì)序列可參見(jiàn)網(wǎng)址htto:〃w麗.ncbi.nlm.nih.gov/)。在SEQIDNO:1中給出了人CYP1A2基因啟動(dòng)區(qū)的部分序列。本發(fā)明的研究表明，當(dāng)細(xì)胞色素氧化酶P4501A2在SEQIDNO:1中的第761位發(fā)生761位A—G時(shí)，導(dǎo)致CYP1A2的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量明顯上升，進(jìn)而導(dǎo)致翻譯產(chǎn)生的CYP1A2蛋白數(shù)量增加。由于該SNP不會(huì)導(dǎo)致CYP1A2蛋白的氨基酸發(fā)生變化，故該SNP不會(huì)導(dǎo)致CYP1A2蛋白的酶活性發(fā)生變化，因此具有第761位A—G所示SNP的細(xì)胞或個(gè)體，其藥物代謝能力大于該位點(diǎn)為野生型的細(xì)胞或個(gè)體。主要或者部分由CYP1A2代謝的藥物目前已知在藥物代謝中涉及CYP1A2的藥物很多，主要分為以下二類(lèi)—、主要或者部分由CYP1A2代謝，并且已經(jīng)提示CYP1A2各種表型產(chǎn)生不同臨床意義的藥物，其中包括(但并不限于)theophylline(茶堿)(Sarkaretal.1992)，tacrine(他克林)(Spaldinetal.1994)，clozapine(氯氮平)(Bertilssonetal.1994)，olanzapine(奧氮平)(Callaghanetal.1999)，F(xiàn)lutamide(氟他米特)，F(xiàn)rovatriptan(夫羅曲普坦)，Lidocaine(利多卡因)，Melatonin(褪黑激素)，Mexiletine(美西律)，Ropivacaine(羅哌卡因)，Tizanidine(替扎尼定)，Triamterene(氨苯蝶啶)，Zolmitriptan(佐米曲坦)。二、部分由CYP1A2進(jìn)行代謝，而CYP1A2各表型臨床意義尚不明朗或者影響較弱的藥物，其中包括(但并不限于)Acetaminophen(對(duì)乙酰氨基酚)，Almotriptan(阿莫曲坦)，Amitriptyline(阿米替林)，Clomipramine(氯丙咪嗪)，Cyclobenzaprine(環(huán)苯扎林)，F(xiàn)luvoxamine(三氣戊月虧胺)，Imipramine(丙米嚷)，Maprotiline(馬普替林)，Naproxen(萘普生)，Oestrogen(雌二酉享)，Ondansetron(昂丹司瓊)，Perphenazine(奮乃靜)，Propafenone(普羅帕酮)，Propranolol(普萘洛爾)，Riluzole(利魯唑)，Thioridazine(硫利達(dá)嗪)，Verapamil(維拉帕米)，(R)-Warfarin(右旋華法林)，Zileuton(積璐琛)，Zot印ine(佐替平)。本發(fā)明人對(duì)CYP1A2基因的SNP進(jìn)行了測(cè)定和分析，其中對(duì)CYP1A2基因中的幾乎整個(gè)區(qū)域進(jìn)行了測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了許多SNP，其中大部分SNP與藥物代謝活性并不相關(guān)。然而，關(guān)聯(lián)研究表明，SEQIDNO:1中第761位A—G卻是與藥物代謝活性關(guān)聯(lián)性非常高的SNP。CYP1A2蛋白的多聚核苷酸可用于預(yù)先判斷藥物代謝活性。如CYP1A2DNA序列可用于對(duì)活檢標(biāo)本的雜交以判斷CYP1A2蛋白的表達(dá)異常。雜交技術(shù)包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術(shù)方法都是公開(kāi)的成熟技術(shù)，相關(guān)的試劑盒都可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱(chēng)為"基因芯片")上，用于分析組織中基因的差異表達(dá)分析和基因檢測(cè)。用CYP1A2蛋白特異的引物進(jìn)行RNA-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)體外擴(kuò)增也可檢測(cè)CYP1A2蛋白的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。檢測(cè)CYP1A2基因的突變也可用于預(yù)先判斷藥物代謝活性檢測(cè)。檢測(cè)可以針對(duì)cDNA，也可針對(duì)基因組DNA。CYP1A2蛋白突變的形式包括與正常野生型CYP1A2DNA序列相比的點(diǎn)突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等?？捎靡延械募夹g(shù)如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測(cè)突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達(dá)，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無(wú)突變。最方便的檢測(cè)本發(fā)明SNP的方法，是通過(guò)用CYP1A2基因特異性引物擴(kuò)增樣品的CYP1A2基因，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；然后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物中是否存在以下單核苷酸多態(tài)性第761位A—G，其中，核苷酸位置編號(hào)基于SEQIDN0:1。應(yīng)理解，在本發(fā)明首次揭示了CYP1A2基因的SNP與藥物代謝活性檢測(cè)的相關(guān)性之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地設(shè)計(jì)出可特異性擴(kuò)增出含該SNP位置的擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過(guò)測(cè)序等方法確定是否存在761位A—G。通常，引物的長(zhǎng)度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖然引物與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的擴(kuò)增產(chǎn)物含有本發(fā)明SNP的對(duì)應(yīng)位置。一種優(yōu)選的引物對(duì)具有SEQIDNO:2或3的序列。雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為50-3000bp，較佳地為150-2000bp，更佳地為200-1000bp。這些擴(kuò)增產(chǎn)物都應(yīng)含有SEQIDNO:1中第761位。由于本發(fā)明的SNP與藥物代謝活性檢測(cè)具有非常高的關(guān)聯(lián)性，因此可以用于在給藥前就預(yù)先判斷個(gè)體的藥物代謝活性，而且可以未雨綢繆地減少與由細(xì)胞色素氧化酶P4501A2所全部或部分代謝的藥物的副作用，從而藥物使用的安全性，因此具有極其重大的應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)效益。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:CoIdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)材料和方法在臨床上收集96例正常中國(guó)人肝臟樣本。樣本采集于正常供肝的病理活檢部分，約502Q0mg每例，在采集后立刻浸入lmLRNALater中，4。C過(guò)夜，待樣本被RNALater充7分浸透后，轉(zhuǎn)移至-701:保存。本研究工作樣本采集及使用均得到倫理學(xué)批準(zhǔn)。將-7(TC保存的樣本于室溫復(fù)溶后，從RNALater中取出，在DEPC-處理的ddH20中漂洗掉R亂ater，轉(zhuǎn)移至lmLTrizol(InvitrogenInc.)中，以Pro200homogenizer(ProscientificInc.)進(jìn)行勻槳。然后依Trizol的方案(protocol)得到DNA和RNA。以Biophotometer(EppendorfInc.)進(jìn)行初步定量。對(duì)得到的RNA以DNaseI(TakaraInc.)進(jìn)行處理，并用酚/氯仿抽提純化，乙醇沉淀。以DEPC-treatedddH20復(fù)溶并稀釋至終濃度約lug/ul。-7(TC保存。以20ii1體系1RT緩沖液，O.5mMdNTP，0.5iiMpoly24dT，5iiMN9，20URnase抑制劑(BIOBASICINC.)，100UM-MLV(H-)逆轉(zhuǎn)錄酶(PromegaInc.)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為25°C10min，42。C60min，然后70°C15min。以人基因組DNA(購(gòu)自Promega，CatalogNo.G152A)作為標(biāo)準(zhǔn)品，GAPDH、ACTB和18srRNA作為參照基因。在ABI7900HT實(shí)時(shí)定量PCR儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)上面進(jìn)行絕對(duì)定量PCR，確定cypla2在各個(gè)樣本中的表達(dá)量。以市售的Primer3軟件設(shè)計(jì)PCR引物，選擇單個(gè)外顯子之內(nèi)的80-180bp大小的片段進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20uL:IXQuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix(Qiagenlnc.)，0.3iiM各引物，2ii1RT稀釋后產(chǎn)物(以18srRNA作為參照基因的40000倍稀釋?zhuān)渌?0倍稀釋)或者倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品基因組DNAG152A。反應(yīng)條件為95°C15min;94。C15s，57。C30s，72。C30s40個(gè)循環(huán)。根據(jù)文獻(xiàn)及H即M即數(shù)據(jù)，利用LD，在cypla2基因區(qū)域及其與cyplal的共享的調(diào)控區(qū)域內(nèi)，共選擇了16個(gè)tagSNP。任兩個(gè)tagSNP之間r2小于0.9。tagSNP12和16作為markerSNP，用于檢測(cè)兩個(gè)等位基因之間的表達(dá)比值。其余12個(gè)tagSNP以測(cè)序手段進(jìn)行分型。10微升PCR體系:lxHotStarTaq緩沖液，2.0mMMg2+，0.2mMdNTP，O.2M引物，0.3UHotStarTaq聚合酶(QiagenInc.)和1微升模板DNA(約10ng/l)，反應(yīng)條件95。C15min;94°C20s，(62°C-0.5°C/循環(huán))40s，72。C80s，ll個(gè)循環(huán)；94。C20s，56。C30s，72。C80s，25個(gè)循環(huán)；72°C5min。PCR產(chǎn)物以SAP和ExoI進(jìn)行純化后，用BigDye3.0進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，在ABI3730XL(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)上進(jìn)行測(cè)序，以Polyphred讀取序列。以SNaPshotMultiplexkit(AppliedBiosystems)對(duì)所有cDNA以及5個(gè)DNA樣本的標(biāo)記SNP(markerSNP)進(jìn)行分型，以DNA樣本兩個(gè)等位基因(allele)峰高比值作為參照，通過(guò)檢測(cè)markerSNP在cDNA樣本中的兩個(gè)allele的比值來(lái)確定兩個(gè)allele表達(dá)量的情況。以此作為后續(xù)關(guān)聯(lián)研究的表現(xiàn)型。這個(gè)步驟重復(fù)4次，取平均值。所有16個(gè)tagSNP的純合與雜合狀態(tài)作為研究的基因型。以SPSSVERSI0N15.O(SPSSInc.，Chicago,IL)對(duì)6)所述基因型和表現(xiàn)型進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，以檢測(cè)是否有與等位基因表達(dá)比值有相關(guān)關(guān)系的tagSNP位點(diǎn)。以Kruska-Wallistest和AN0VA對(duì)tagSNPs和CYP1A2的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析。在秩和檢驗(yàn)得到部分位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步挑取了一個(gè)與較顯著等位基因表達(dá)不平衡(alleleexpressionimbalance,AEI)有顯著相關(guān)的位點(diǎn)tag09，進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。設(shè)計(jì)了一個(gè)包含tag09的650bp的片段，位置從cypla2的5'非翻譯區(qū)。選取一個(gè)tag09的雜合個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該P(yáng)CR上下游引物分別設(shè)計(jì)了Kpnl和Xhol酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物以Kpnl和XhoI進(jìn)行酶切，然后克隆至pGL-3啟動(dòng)子載體(購(gòu)自Promega公司).然后將8其轉(zhuǎn)化至常規(guī)的E.coliDH10B菌株，培養(yǎng)后挑取分別包含兩個(gè)allele的序列的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)，序列以測(cè)序驗(yàn)證無(wú)新發(fā)突變，確證挑取出的菌落只包含tag09位點(diǎn)不同的兩個(gè)序列。細(xì)菌培養(yǎng)后以QIAGENplasmidpurificationkit(Qiagen)進(jìn)行質(zhì)粒抽提。將人類(lèi)H印G2細(xì)胞在24孔培養(yǎng)盤(pán)中進(jìn)行培養(yǎng)，密度為lx105細(xì)胞/孔，培養(yǎng)過(guò)夜使覆蓋率為50-80%作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。以質(zhì)粒和pRL-SV40組成轉(zhuǎn)染DNAmix。用jetPEI轉(zhuǎn)染試劑(PolyplusTransfectionInc.)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后37。C過(guò)夜，然后以0.1%DMS0或10nMTCDD處理過(guò)夜。用市售的luciferase分析試劑盒(TM046，Promega)進(jìn)行細(xì)胞處理后，以Microl咖atPlusLB96Vl咖inometer(BertholdTechnologies,BadWildbach，Germany)進(jìn)行熒光檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明，TagSNP09(rsl1632814)與樣本中的CYP1A2的拷貝數(shù)之間存在顯著相關(guān)性。Tag09(SEQIDNO:1中第761位A—G)的G等位基因比A等位基因多產(chǎn)生約25%的拷貝數(shù)。這提示，SNPrsll632814通過(guò)影響基因表達(dá)，調(diào)控了CYP1A2基因的功能，并影響了該基因所代謝的藥物的代謝情況。實(shí)施例2SNPrsl1632814的驗(yàn)證2.1DNA提取用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正至20ng/ul后，用于常規(guī)PCR擴(kuò)增。2.2PCR及測(cè)序引物的設(shè)計(jì)根據(jù)SEQIDN0:1所示的CYP1A2基因的序列，設(shè)計(jì)和合成以下引物。具體引物如下表l所示。表l引物序列表引物名稱(chēng)序列(5'-3')SEQIDNO:有義引物gcgccactgcactccagcctgggcg2反義引物tcacctcatttcccatcccttcctc31.2.3CYP1A2基因的PCR擴(kuò)增以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp9700PCR儀上以Touchdown程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94t:預(yù)變性2分鐘，94t:變性30秒，63。C退火40秒，72。C延伸40秒，共10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度遞減0.5°C;以后94t:變性30秒，58t:退火40秒，72°C延伸40秒，共30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸7分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果，獲得1620bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。1.2.4SNP的發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)PCR產(chǎn)物經(jīng)Resin樹(shù)脂純化后，用ABI_PRISMTM377DNA測(cè)序儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司即pliedbiosystems(ABI))進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件(美國(guó)華盛頓大學(xué)http:〃droog.mbt.Washington.edu/Polyphred.html)進(jìn)行序列的判讀9和SNP確認(rèn)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在以下SNP:761位A—G。實(shí)施例3個(gè)體的藥物代謝活性測(cè)定因?yàn)橐阎谌梭w中咖啡因約90%由CYP1A2代謝，因此CYP1A2的活性高低與咖啡因的代謝快慢之間存在相關(guān)性。在本實(shí)施例中，應(yīng)用實(shí)施例2的方法，在健康的中國(guó)人群中對(duì)CYP1A2基因基于SEQIDN0:1中的761位A—G的SNP位點(diǎn)進(jìn)行了基因分型。并觀察不同基因型與血槳咖啡因代謝比值之間的關(guān)系。選取20名(男性和女性各10名)年齡為18-30歲(平均年齡21士2歲)的健康受試者參與本試驗(yàn)，其中SEQIDN0:1中的761位為A和G的各IO名。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照國(guó)家人類(lèi)基因組研究倫理學(xué)準(zhǔn)則進(jìn)行，并獲得了所有受試者的知情同意。所有受試者均為非吸煙個(gè)體，在進(jìn)行咖啡因代謝率檢測(cè)前1周之內(nèi)未曾攝入咖啡、茶、可口可樂(lè)、巧克力以及其它含咖啡因的飲料。同時(shí)，所有的受試者試驗(yàn)前l(fā)周之內(nèi)未曾服用任何藥物。以咖啡因?yàn)闇y(cè)試藥物，對(duì)所有受試者CYP1A2的體內(nèi)活性進(jìn)行測(cè)定。受試者晨起(7:007:30AM)空腹口服咖內(nèi)因膠囊100mg。分別在服藥前(0小時(shí))和服藥后(5小H)取靜脈血5ml，用EDTA抗凝。離心分離血漿和血細(xì)胞，并保存于-2(TC，分別用于進(jìn)行咖啡因代謝表型的測(cè)定。應(yīng)用高效液相色譜。紫外檢測(cè)法對(duì)血漿中咖啡因(CMffl)濃度及其代謝產(chǎn)物l，7-二甲基黃嘌呤(C，fft)的濃度按以下方法進(jìn)行測(cè)定0.5ml待測(cè)血漿中加入80iiM的p-羥乙基茶堿(內(nèi)標(biāo))100微升和300mg硫酸胺，然后加入5ml氯仿異丙醇(體積比為9:1)，振蕩2分鐘后于2000g離心8分鐘，取下層有機(jī)相在氮?dú)庀聯(lián)]發(fā)干燥，50微升流動(dòng)相重新溶解，取20微升上色譜柱。高效液相色譜系統(tǒng)包括Agilent1100系列、C18色譜柱(250mmX4mm，顆粒直徑為5微米)。流動(dòng)相的組成包括甲醇(A)、0.05%的醋酸(B)和乙腈(C)。采用梯度洗脫的方式進(jìn)行洗脫，洗出條件為0-8分鐘A:B:C的體積比為IO:82:8，流速為O.75ml/min;8-12分鐘A:B:C的體積比為IO:78:12，流速為lml/min，柱溫恒定在45°C。紫外檢測(cè)的波長(zhǎng)為282nm。結(jié)果表明，按以下公式計(jì)算的口服咖啡因100mg后第5小時(shí)血漿中咖啡因(C咖啡因)濃度及其代謝產(chǎn)物1，7-二甲基黃嘌呤(C代謝產(chǎn)物)的濃度的比值1和2。G咖啡因(A基因型)比值1=比值2=——G咖啡因(G基因型)G代謝產(chǎn)物(A基因型)X100%X100%G代謝產(chǎn)物(G基因型)結(jié)果比值1大于l(約150%)，提示SEQIDNO:1中的761位A—G的SNP位點(diǎn)后，個(gè)體的CYP1A2活性和藥物代謝活性有所提高(高于普通人群)。10比值2小于1，也提示SEQIDNO:l中的761位A—G的SNP位點(diǎn)后，個(gè)體的CYP1A2活性和藥物代謝活性有所提高(高于普通人群)。實(shí)施例4藥物代謝活性檢測(cè)試劑盒如實(shí)施例1所述，SEQIDNO:1中761位A—G的突變與藥物代謝活性檢測(cè)密切相關(guān)。因此，可基于這個(gè)突變?cè)O(shè)計(jì)CYP1A2基因特異性引物在以待測(cè)個(gè)體的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增并進(jìn)行檢測(cè)。制備一試劑盒(IOO人次)，它含有<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>抽取待測(cè)男性病人的血液3ml，使用常規(guī)方法(或使用特定的試劑盒)從血液中提取DNA。將藥物代謝活性檢測(cè)預(yù)測(cè)試劑盒中的PCR引物稀釋到limol/il，以所提取的DNA為模板與所提供的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物純化后，用ABI-PRISMTM377DNA測(cè)序儀進(jìn)行熒光標(biāo)記末端終止法雙向測(cè)序，用Polyphred軟件進(jìn)行序列的判讀和SNP確認(rèn)?；蛘撸瑢U(kuò)增產(chǎn)物與正常對(duì)照用變性高效液相色譜儀(DHPLC)進(jìn)行色譜分析，也可檢測(cè)出761位A—G。結(jié)果表明，含761位A—G的測(cè)試對(duì)象中CYP1A2的mRNA的拷貝數(shù)比正常人群高約25X，且該位點(diǎn)為A的個(gè)體的將咖啡因轉(zhuǎn)化為l，7-二甲基黃嘌呤的能力也比正常人群高(高約20%)。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。參考文獻(xiàn)l)AklilluE，CarrilloJA，Mako皿enE，HellmanK，PitarqueM，BertilssonL禾口Ingelman-SundbergM(2003)GeneticpolymorphismofCYP1A2inEthiopiansaffectinginductionandexpression-characterizationofnovelh即lotypeswithsingle—皿cleotid印olymorphismsinintron1.MolPharmacol64:659—692)BaeSY，ChoiSK，KimKR，ParkCS，LeeSK，RohHK，ShinDW，PieJE，WooZH禾口KangJH(2006)Effectsofgeneticpolymorphismso扁Rl，F(xiàn)M03andCYP1A2onsusceptibilitytocolorectalcancerinKoreans.CancerSci.97:774—93)CarlsonCS，EberleMA，RiederMJ，YiQ，KruglyakL禾卩NickersonDA.(2004)Selectingamaximallyinformativesetofsingle—nucleotidepolymorphismsforassociationanalysesusinglinkagedisequilibrium.AmJHumGenet74:106—204)ChimgI禾口BresnickE(1997)IdentificationofPositiveandNegativeRegulatoryElementsoftheHumanCytochromeP4501A2(CYP1A2)Gene.ArchBiochemBiophys338:220-2265)CirulliET禾口GoldsteinDB(2007)Invitroassaysfailtopredictinvivoeffectsofregulatorypolymorphisms.HumMolGenetl6:1931—96)GhotbiR，ChristensenM，RohHK，Ingelman-SundbergM，AklilluE禾卩BertilssonL(2007)ComparisonsofCYPlA2geneticpolymorphisms，enzymeactivityandthegenotype—phenotyperelationshipinSwedesandKoreans.EurJClinPharmaco163:537-467)GonzalezFJ禾口GelboinHV(1994)RoleofhumancytochromesP450inthemetabolicactivationofchemicalcarcinogensandtoxins.DrugMetabRev26:165-838)JiangZ，DaltonTP，JinL，WangB，Ts騰okaY，ShertzerH.G，DekaR禾口NebertDW(2005)Towardtheevaluationoffunctioningeneticvariability-characterizinghumanSNPfrequenciesandestablishingBAC—transgeniemicecarryingthehumanCYPlAlCYP1A2locus.Hum.Mutat25:196—206.9)KressS，ReichertJ禾口SchwarzM(1998)FunctionalanalysisofthehumancytochromeP4501A1(CYP1A1)geneenhancer.EurJBiochem258:803-812lO)MaQ禾口LuAY(2007)CYP1Ainductionandhumanriskassessment:anevolvingtaleofinvitroandinvivostudies.DrugMetabDispos35:1009—16ll)Marlowe幾禾口PugaA(2005)Arylhydrocarbonreceptor,cellcycleregulation，toxicity,andtumorigenesis.JCellBiochem96:1174—8412)MartinJ，CleakJ，Willis-OwenSA，F(xiàn)lintJ禾卩ShifmanS(2007)Mappingregulatoryvariantsfortheserotonintransportergenebasedonallelicexpressionimbalance.MolPsychiatry12:421—213)MimuraJ禾口Fujii_KuriyamaY(2003)FunctionalroleofAhRintheexpressionoftoxiceffectsbyTCDD.BiochimBiophysActal619:263—26814)NebertDW禾口GonzalezFJ(1987)P450genes:structure，evolutionandregulation.A皿uRevBiochem56:945—99315)0baseY，ShimodaT，KawanoT，SaekiS，TomariSY，Mitsuta-IzakiK，MatsuseH，KinoshitaM禾卩KohnoS(2003)PolymorphismsintheCYPlA2geneandtheophyllinemetabolisminpatientswithasthma.ClinPharmacolTher73:468—7416)Quatt潔hiLc，VuT禾口TukeyRH(1994)ThehumanCYP1A2geneandin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