專利名稱：無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靈芝菌株鑒別領(lǐng)域，特別是涉及一種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體分子標(biāo) 記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載，靈芝有益心氣、養(yǎng)心生血、助心充脈、安神、 益脾益肺、強(qiáng)筋骨、利關(guān)節(jié)、治耳聾等功效。近代研究發(fā)現(xiàn)靈芝不但對人類三大死因的癌 癥、腦溢血和心臟病有療效，還對胃腸、肝臟、腎臟、白血病、神經(jīng)衰弱、慢性支氣管炎、 哮喘、過敏等疾病有顯著療效。此外靈芝還有強(qiáng)精、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、解毒、利尿、 凈血等多種作用和功效。近年來，國際藥學(xué)界發(fā)現(xiàn)靈芝所含有機(jī)鍺是人參的4一5倍，鍺被 認(rèn)為是"長壽元素"，能促進(jìn)血液循環(huán)，增強(qiáng)血紅蛋白攜氧能力，提高代謝功能、延緩衰 老。因此，靈芝被譽(yù)為"健康食品之冠"(虞和澍，1994)。
隨著對靈芝的生物學(xué)功效的不斷了解，以其為原料開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，銷售量也越 來越大，靈芝原料的質(zhì)量越來越受到重視。近年來，隨著靈芝各種產(chǎn)品的商品化，大大帶 動了中國靈芝栽培生產(chǎn)的迅速發(fā)展，同時靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大，但是由于我國食 藥用菌品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的 現(xiàn)象在栽培生產(chǎn)上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來了難度，也給以靈芝為原料的保健 品及藥品等的相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)在因?yàn)榫N問題常常造成我國靈芝產(chǎn)品 質(zhì)量難以穩(wěn)定的局面，也嚴(yán)重地制約了我國靈芝產(chǎn)品走出國門，走向國際市場的步伐。
傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行，包括擔(dān)孢子的大小和子實(shí)體真 皮菌絲的形態(tài)特征，但是子實(shí)體的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨著生長條件的不同而發(fā)生變化， 而且許多鑒別性特征經(jīng)常是幾個種所共有的，這給傳統(tǒng)的分類學(xué)帶來了很大的困難，僅僅 依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑒定手段，對靈芝產(chǎn)業(yè)的進(jìn) 一步發(fā)展尤為重要。
近年來，國內(nèi)對栽培靈芝菌株的分類研究也越來越多，主要是集中在應(yīng)用拮抗實(shí)驗(yàn)、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)分析及同工酶分析 技術(shù)方面。
張松等(1995)通過對4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，供試的四個菌株 存在5條相同的酶帶，說明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特征，在其代謝過程中具有某 些相似的生理活動，但各菌株在酶帶數(shù)目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的特征酶帶，同時發(fā)現(xiàn)子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關(guān)系比較近， 這些說酯酶同工酶分析對于靈芝的分類鑒定有一定的價值。
趙明文等(2003)利用RAPD技術(shù)對生產(chǎn)中常用的靈芝屬8個菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了 分析。根據(jù)UPGMA構(gòu)建的樹狀圖將8個菌株在較低的相似水平上分成3個明顯不同的組 第1鄉(xiāng)且包括黑芝(Ga"ocfenwa c^nw2)、松杉靈芝(Gtfwocfenwa "wgae)、圓芝(Gflwofiferwa ra加"i/o^ww)、靈芝0770 (Gawoderwa 0770)禾卩韓國靈芝(Gtmoc/eww /w"'^/附HG);
第2組包括密紋靈芝(G"ww^w" cre辦my/r&fe附)和紫靈芝(G"wAr附"Wwmye);第3 組為樹舌靈芝(G朋oAr附a印/7/朋^wm)。這一結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果基本相符，表明RAPD 技術(shù)可以用來區(qū)分生產(chǎn)中一些常用的靈芝種，同時說明靈芝生產(chǎn)用種之間遺傳差異較大， 可能是造成靈芝產(chǎn)品研究比較混亂的重要原因。
1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種 知識產(chǎn)權(quán)，同時也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記 制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定 基礎(chǔ)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點(diǎn)，但 目前尚未有對無柄靈芝126的SCAR分子標(biāo)記，以快速鑒定無柄靈芝126。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子 標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，以便對無柄靈芝菌種126進(jìn)行簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢測。
本發(fā)明的一種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記，是一種基因SCAR 分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為1572bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為 5'GACATACCTTGCCAGCGTTC 3'禾n 5'CCCCATCAATACTCCCTACAA 3'。
本發(fā)明的一種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法，包括下 列步驟
I.菌株或子實(shí)體基因組DNA的提取 (1)菌株基因組DNA的提取
將4-6'C保藏的無柄靈芝126菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接 到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28'C振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組
7DNA;
(2)子實(shí)體基因組DNA的提取
將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分裝于2ml離心管中，60-70'C保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實(shí)體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS。
II. 無柄靈芝126菌株或子實(shí)體特異DNA片段的獲得
采用ISSR-PCR法，其中ISSR弓I物為5'TTCCCTTCCCTTCCC3',經(jīng)大量篩選試驗(yàn)， 得無柄靈芝126菌株或子實(shí)體特異DNA片段；
III. 特異性PCR引物的獲得
以得到的特異性DNA片段的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列 5'GACATACCTTGCCAGCGTTC 3'禾口 5'CCCCATCAATACTCCCTACAA 3';
IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測
上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8nL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-l，/。的瓊脂糖凝膠上， 于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝 膠成像儀上照相。
所述步驟I (1)中，LETS法
① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；
② 向每個管中加入600-800piL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫為PCI)(比例為25:24:1)上下 顛倒，充分混勻，4-l(TC 16000g離心8-I5分鐘;
③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入50(VL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；
④ 重復(fù)步驟(D，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-20'C預(yù)冷的無水乙醇或95X乙醇，輕輕混勻， 置于-20'C冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4t:i6000g離心10-15分鐘；
⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL預(yù)冷的70Q/c) (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶解，靜置一會兒，4。Cl6000g離心IO分鐘;
⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；
⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0y。瓊脂糖凝膠電泳、檢領(lǐng)lj，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
所述步驟I(2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括
① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實(shí)體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；
② 向每個離心管中加入600-800^iL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；
④ 取上清，加入600-800pL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0c/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其 質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
所述步驟II中，ISSR-PCR法擴(kuò)增反應(yīng)體系(25nl): 10XPCRbuffer(Promega)2.5nL， 25mmol/LMgC12 (Promega) 2.0)xL， 10mmol/LdNTPs0.5pL，引物QOpmol/L) 2pL， Taq 酶(5U/|iL) (Promega) 0.25nL， DNA模板(10-20ng4iL)2.0nL，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25nl， PCR反應(yīng)條件:94。C 3min; 94。C lmin， 52。C lmin， 72。C lmin， 40個循環(huán);72。C 5min， 無柄靈芝126菌株或子實(shí)體特異DNA片段，大小為1642bp，其序列GCACGGTGAAGGGAAGGGAAGGGAA
所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer (Promega) 2.5pL， 25腿ol/LMgC12 (Promega) L5^iL，引物對(20 u moI/L)各0.5nL， 10mmol/LdNTPs 0.5pL， Taq酶(5U/uL) (Promega) 0.2pL，模板(10-20ng/nL) 2單，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。 PCR反應(yīng)條件為94°C 3min; 94°C 1 min, 62°C 50s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 10mm。
本發(fā)明的無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測無 柄靈芝126菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?有益效果
(1) 只有無柄靈芝126能PCR擴(kuò)增出分子量為1572bp的專一擴(kuò)增條帶，而靈芝屬的其 它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷；
(2) 采用這種特異性分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出燕試驗(yàn)相比， 具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，該檢測所需時間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所 需時間至少需要兩周時間，出菇試驗(yàn)則需要5-6個月的時間。


10圖1是ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖2是無柄靈芝126特異引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。
其中，生產(chǎn)用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103, 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來自ATCC (24支)121-126， 128-145;
標(biāo)號中間有斷開的，這是因?yàn)樵诰N保藏過程中失去活力了，但并未因此改變其他菌株的 編號。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實(shí)施例1
菌種收集到來自國內(nèi)的140支靈芝屬生產(chǎn)用菌種以及來自ATCC24支共計164支菌 株，它們分屬于赤藝、紫芝、樹舌、松杉靈芝、樹舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無柄靈芝等IO余個種。對它們的基因組DNA和無柄靈芝126號的子實(shí)體 基因組(編號190) DNA共計165個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 一、基因組DNA的提取
1. 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取
將4-6。C保藏的無柄靈芝126菌株轉(zhuǎn)接到100mlPDA斜面上，26。C培養(yǎng)活化。5-7天后 轉(zhuǎn)接到100mL馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28。C振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，放入-20。C 冰箱凍存。菌絲基因組DNA采用改良過的LETS法來提取，DNA稀釋至10-20ng4iL， -20 'C保存。
2. 子實(shí)體基因組DNA的提取
① 將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾；
② 過濾后用滅過菌的雙蒸水沖洗，放在滅過菌的研缽中用液氮處理并進(jìn)行研磨；
③ 向每個離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
④ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次
11⑤ 取上清，加入600-800pL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-60(HiL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
◎DNA稀釋至10-20 ng4tL， -20°C保存。
二、 特異性PCR擴(kuò)增
擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCRbuffer 2.5pL， MgCl2 (25mmol/L ) 1.5pL， dNTP (10mmol/L) 0單，特異引物對(20pmol/L)各0單，Taq酶(5U/nL) 0.20pL， 模板(10-20ng/uL) 2.0pL，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。
PCR反應(yīng)條件為94°C 3 min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72 °C 10min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測
取特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5pL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖 凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色 5-10min，自來水沖洗后在凝膠成像儀上照相。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些樣品中只有無柄靈芝126能擴(kuò)增出分子量為1572bp的專一擴(kuò)增條帶， 而靈芝屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷。
權(quán)利要求
1.一種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記，其特征在于該標(biāo)記是一種基因SCAR分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為1572bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′GACATACCTTGCCAGCGTTC 3′和5′CCCCATCAATACTCCCTACAA 3′。
2. —種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法，包括下列步驟I. 菌株或子實(shí)體基因組DNA的提取(1) 菌株基因組DNA的提取 將4-6'C的無柄靈芝126菌株轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA， DNA 稀釋至10-20ng/nL，保存?zhèn)溆茫?2) 子實(shí)體基因組DNA的提取將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1 OOOpL pH 8.0 CNETS溶 液分裝于2ml離心管中，60-70'C保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實(shí)體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 無柄靈芝126菌株或子實(shí)體特異DNA片段的獲得采用ISSR-PCR法，其中ISSR引物為5'TTCCCTTCCCTTCCC3'，得無柄靈芝121 菌株或子實(shí)體特異DNA片段；III. 特異性PCR引物的獲得以得到的特異性DNA片段的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計特異PCR擴(kuò)增引物，引物對的序列 5'GACATACCTTGCCAGCGTTC 3'和5'CCCCATCAATACTCCCTACAA 3';IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟I (1)中，LETS法，①將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無 菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于 2個1.5ml的離心管中；②向每個管中加入600-800nL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下 顛倒，充分混勻，4-10°C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500pL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的己-2(TC預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4'C16000g離心10-15分鐘;⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L預(yù)冷的70Q/oV/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4。C16000g離心10分鐘;⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0y。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定其 質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實(shí)體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；② 向每個離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次； 取上清，加入600-800pL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-60(HiL 49:1 V/V氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。V/V的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.線瓊脂糖凝膠電泳、檢觀ij，以確定其 質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟II中，ISSR-PCR法擴(kuò)增反應(yīng)體系25^1: 10XPCR buffer Promega 2.5pL， 25mmol/LMgC12Promega2.(^L， 10mmol/L dNTPs 0.5tiL，引物20nmol/L2nL， Taq 酶5U/nLPromega0.25pL， DNA模板10-20ng/pL 2.0pL，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25pl， PCR反 應(yīng)條件94°C 3min; 94°C lmin， 52。C lmin， 72°C lmin， 40個循環(huán)；72°C 5min，無柄靈芝126菌株或子實(shí)體特異DNA片段，大小為1642bp，其序列:GCACGGTGAAGGGAAGGGAAGGGAA 。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25^L: 10 XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl21.5pL, 10 mmol/LdNTP 0.5pL， 20pmol/L特異引物對各0.5pL， 5U/pLTaq 酶0.20pL， 10-20ng爾L DNA模板2.0nL，加無菌雙蒸水補(bǔ)足25^1; PCR反應(yīng)條件為94 。C 3min; 94°C 1 min， 62°C 50s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 10min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-^L，與0.5pL加樣緩沖液混勻，于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，在1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳 后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
8.無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測無柄靈芝126 菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種無柄靈芝126菌株或其子實(shí)體分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，該標(biāo)記是PCR擴(kuò)增后為1572bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′GACATACCTTGCCAGCGTTC 3′和5′CCCCATCAATACTCCCTACAA 3′；獲得方法1)菌株或子實(shí)體基因組DNA的提取；2)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴(kuò)增引物；4)用特異PCR擴(kuò)增引物對對無柄靈芝126菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測；應(yīng)用用于快速鑒定和檢測無柄靈芝126菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍１痉椒ㄅc常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/04GK101550443SQ20081020454
公開日2009年10月7日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者娜 馮, 方 劉, 劉艷芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 許美燕, 薇 賈, 郝瑞霞 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院