專利名稱：近擬鹿角靈芝種菌株或子實體特異分子標(biāo)記及獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靈芝菌株鑒別領(lǐng)域，特別是涉及一種近擬鹿角靈芝(Gwoc/e，fl wkw6o/"ewe J種菌株或子實體特異性分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用。 肖髓*
據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載，靈芝有益心氣、養(yǎng)心生血、助心充脈、安神、 益脾益肺、強(qiáng)筋骨、利關(guān)節(jié)、治耳聾等功效。近代研究發(fā)現(xiàn)靈芝不但對人類三大死因的癌癥、 腦溢血和心臟病有療效，還對胃腸、肝臟、腎臟、白血病、神經(jīng)衰弱、慢性支氣管炎、哮喘、 過敏等疾病有顯著療效。此外靈芝還有強(qiáng)精、消炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、解毒、利尿、凈血等多種 作用和功效。近年來，國際藥學(xué)界發(fā)現(xiàn)靈芝所含有機(jī)鍺是人參的4-5倍，鍺被認(rèn)為是"長壽元 素"，能促進(jìn)血液循環(huán)，增強(qiáng)血紅蛋白攜氧能力，提高代謝功能、延緩衰老。因此，靈芝被 譽(yù)為"健康食品之冠"(虞和澍，1994)。
周月琴等(2005)利用流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Ga"o&nwaw6am6o^朋e乙醇提取物能明顯 誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞產(chǎn)生凋亡。陳春鋒(2007)發(fā)現(xiàn)G..subamboinense也能顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞 Raw264.7吞噬中性紅顆粒、釋放NO,促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞的增殖；菌絲體多糖提取物的免疫活性 菌絲體多糖提取物與子實體多糖提取物一樣表現(xiàn)出較強(qiáng)的激活巨噬細(xì)胞免疫活性作用。
隨著對靈芝的生物學(xué)功效的不斷了解，以其為原料開發(fā)的產(chǎn)品越來越多，銷售量也越來 越大，靈芝原料的質(zhì)量越來越受到重視。近年來，隨著靈芝各種產(chǎn)品的商品化，大大帶動了 中國靈芝栽培生產(chǎn)的迅速發(fā)展，同時靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大，但是由于我國食藥用菌 品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的現(xiàn)象在栽 培生產(chǎn)上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來了難度，也給以靈芝為原料的保健品及藥品等 的相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)在因為菌種問題常常造成我國靈芝產(chǎn)品質(zhì)量難以穩(wěn)定 的局面，也嚴(yán)重地制約了我國靈芝產(chǎn)品走出國門，走向國際市場的步伐。
傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實體的形態(tài)學(xué)特征來進(jìn)行，包括擔(dān)孢子的大小和子實體真皮 菌絲的形態(tài)特征，但是子實體的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨著生長條件的不同而發(fā)生變化，而且 許多鑒別性特征經(jīng)常是幾個種所共有的，這給傳統(tǒng)的分類學(xué)帶來了很大的困難，僅僅依據(jù)形 態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑒定手段，對靈芝產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展 尤為重要。
近年來，國內(nèi)對栽培靈芝菌株的分類研究也越來越多，主要是集中在應(yīng)用拮抗實驗、
5RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA )分析及同工酶分析 技術(shù)方面。
張松等(1995)通過對4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，供試的四個菌株 存在5條相同的酶帶，說明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特征，在其代謝過程中具有某 些相似的生理活動，但各菌株在酶帶數(shù)目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的 特征酶帶，同時發(fā)現(xiàn)子實體形態(tài)學(xué)特征相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關(guān)系比較近， 這些說酯酶同工酶分析對于靈芝的分類鑒定有一定的價值。
趙明文等(2003)利用RAPD技術(shù)對生產(chǎn)中常用的靈芝屬8個菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了 分析。根據(jù)UPGMA構(gòu)建的樹狀圖將8個菌株在較低的相似水平上分成3個明顯不同的組 第1鄉(xiāng)且包括黑芝(Gfl"o^fer/wa tf/n/附)、松杉靈芝(Gawo^fe/vwa "wgae)、 圓芝(Gawo<iCT7Wfl rart/wfi a/ww)、靈芝0770 (Ga"oder附fl /wdc/ww 0770)禾卩卓韋國靈芝(Gawocfe vwaf /wc^wm HG); 第2組包括密紋靈芝(G""0(ie 7na cre6raw〃'a,wm)禾口紫芝(Ga"ocfermar s7ne;we);第3纟且為 樹舌靈芝(Gfl"o&r附aa;^/朋加ww)。這一結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果基本相符，表明RAPD技術(shù) 可以用來區(qū)分生產(chǎn)中一些常用的靈芝種，同時說明靈芝生產(chǎn)用種之間遺傳差異較大，可能 是造成靈芝產(chǎn)品研究比較混亂的重要原因。
1999年我國簽署了《國際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種 知識產(chǎn)權(quán)，同時也要加強(qiáng)保護(hù)我們國家自己的品種知識產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記 制度來真正保護(hù)我國的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定 基礎(chǔ)。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡便、低成本的特點，本發(fā) 明建立了Ganoderma subamboinense禾中的SCAR分子標(biāo)記，能對Ganoderma subamboinense禾中 進(jìn)行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種Ganoderma subamboinense種菌株或子實體 特異性分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，通過該分子標(biāo)記能簡便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢 湖!l Ganoderma subamboinense菌禾中。
本發(fā)明的Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記，是一種基因SCAR分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為461bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列 為5'tcgcgaagcgggctctttact 3'和5'ggtcataaagctgtccaaacg 3'。
本發(fā)明的Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，
包括如下步驟
I. 菌株或子實體基因組DNA的提取
(1) 菌株基因組DNA的提取
將4-6。C的Ganoderma subamboinense菌種轉(zhuǎn)接至!jPDA斜面上，26-28。C培養(yǎng)活化，5-7 天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基 因組DNA;
(2) 子實體基因組DNA的提取
將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS;
II. Ganoderma subamboinense種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、 測序及比對
用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F: 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，； ITS4: 5 '國TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得Gcmoc^rma sw&am6o!"e"w種及靈芝
屬其他種的菌株或子實體ITS片段；然后測序并比對各個靈芝屬種的代表性的序列。
III. 特異性PCR引物的獲得
根據(jù)ITS序列的比對結(jié)果，找到Ganoderma subamboinense的ITS序列上特異性的結(jié)合 位點(見下面序列的紅色加粗部分)，并設(shè)計出特異性PCR引物對為 5'tcgcgaagcgggctctttact 3'禾口 5'ggtcataaagctgtccaaacg 3';
IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5nL加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝 膠成像儀上照相。所述步驟I (l)中所述的LETS提取法
① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；
② 向每個管中加入600-800nL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫為PCI)(比例為25:24:1)上下 顛倒，充分混勻，4-10°C 16000g離心8-15分鐘；
③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500^iL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；
④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；
取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-20'C冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4'C16000g離心10-15分鐘；
⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L預(yù)冷的70。/。 (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4'C16000g離心IO分鐘；
⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；
⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括
① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml己配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；
② 向每個離心管中加入600-800^L飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；
④ 取上清，加入600-800|xL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600^L49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0。/Q瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
所述步驟II中，ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25iU): 10XPCR buffer (Promega) 2. 5ul，25mmol/LMgC12(Promega) 2. 0u 1， 10mmol/L dNTPs 0. 5u L，引物ITS1F/ITS4(10 " mol/L) 各lul， Taq酶(5U/ul) (Pr匿ga) 0.25"， DNA模板(10 ng/u L) 1 u L，加無菌雙蒸 水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62。C30s， 72°C 1 min， 28個循環(huán)； 72°C 5min， Ganoderma subamboinense種菌株或子實體ITS序列，大小為678bp:
AGCATATCAATAAGC 。
所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl22.0nL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL, 10pmol/L特異引物對各l^L, 5U/pLTaq 酶0.30pL， 10-20ng/pLDNA模板"L，無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL; PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 5min。
所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5^L加樣緩沖 液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電 泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
本發(fā)明的Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒 定和檢測Ganoderma subamboinense禾中菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?本發(fā)明的有益效果
(1) 只有Ganoderma subamboinense種能PCR擴(kuò)增出分子量為461bp的專一擴(kuò)增條帶， 而靈芝屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷；
(2) 采用這種特異性分子標(biāo)記進(jìn)行檢測，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比， 具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，該檢測所需時間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗所 需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要5-6個月的時間。


圖1是ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
圖2是Ganoderma subamboinense特異引物對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。 其中，生產(chǎn)用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62， 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113, 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來自ATCC (24支)121-126， 128-145;
標(biāo)號中間有斷開的，這是因為在菌種保藏過程中失去活力了，但并未因此改變其他菌株的 編號。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限 定的范圍。
實施例1
菌種收集到來自國內(nèi)的140支靈芝屬生產(chǎn)用菌種以及來自ATCC 24支共計164支菌 株，它們分屬于赤芝、紫芝、樹舌、松杉靈芝、樹舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無柄靈藝等10余個種。對它們的基因組DNA和Ga"0&，" sw6aw6o&ewe136子實體基因組(編號190) DNA共計165個樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 一、基因組DNA的提取
1. 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取 (1)菌株基因組DNA的提取
將4-6。C的Ganoderma subamboinense菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28。C培養(yǎng)活化，5-7 天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基 因組DNA， DNA稀釋至10-20ng/nL， -20°〇保存；
2. 子實體基因組DNA的提取
① 將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾；
② 過濾后用滅過菌的雙蒸水沖洗，放在滅過菌的研缽中用液氮處理并進(jìn)行研磨；
③ 向每個離心管中加入600-800nL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
10④ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800nL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30nL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑨ DNA稀釋至10-20 ng/pL， .20。C保存。
二、 特異性PCR擴(kuò)增
擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5nL， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0pL， dNTP (10 mmol/L) 0.5fiL ， 10pmol/L特異引物對(5'tcgcgaagcgggctctttact 3'禾口 5'ggtcataaagctgtccaaacg 3')各lpL， Taq酶(5U/pL) 0.30pL， DNA模板(10-20ng批) lpL，無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。
PCR反應(yīng)條件為94。C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 5min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測
取特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5^L加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖 凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色 5-10min，自來水沖洗后在凝膠成像儀上照相。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些樣品中只有Ganoderma subamboinense種能擴(kuò)增出大小為461bp的專 一擴(kuò)增條帶，而靈芝屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷。
1權(quán)利要求
1.一種Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異性分子標(biāo)記，其特征在于該標(biāo)記是一種基因SCAR分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為461bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′tcgcgaagcgggctctttact 3′和5′ggtcataaagctgtccaaacg 3′。
2. Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，包括步驟 I.菌株或子實體基因組DNA的提取(1) 菌株基因組DNA的提取將4-6。C的Ganoderma subamboinense菌種轉(zhuǎn)接至!jPDA斜面上，26-28。C培養(yǎng)活化，5-7 天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基 因組DNA;(2) 子實體基因組DNA的提取將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分裝于2ml離心管中，60-7(TC保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是1% m/V CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. Ganoderma subamboinense種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、 測序及序列比對用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'; ITS4: 5 '陽TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得Ganoderma subamboinense種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段；然后測序并比對各個靈芝屬種的代表性的序列。III. 特異性PCR引物的獲得根據(jù)ITS序列的比對結(jié)果，找到Ganoderma subamboinense的ITS序列上特異性的結(jié)合 位點，利用Primer Premier5.0設(shè)計出特異性PCR引物對為5'tcgcgaagcgggctctttact 3'和 5'ggtcataaagctgtccaaacg 3';IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對對Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記 的獲得方法，其特征在于所述步驟I (l)中所述的LETS提取法①將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；② 向每個管中加入600-800pL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下 顛倒，充分混勻，4-10°C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500^L的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒有雜質(zhì)為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預(yù)冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4。Cl6000g離心10-15分鐘；⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L預(yù)冷的70n/。V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4。C16000g離心IO分鐘；⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2|iL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0M瓊脂糖凝膠電泳、檢領(lǐng)ij，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Gflwo^rm" ;yw6flw6o/"e"^種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟I(2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將已經(jīng)預(yù)處理過得子實體置于預(yù)冷的無菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個2.0 ml的離心管中；② 向每個離心管中加入600-80(HiL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；④ 取上清，加入600-800pL 1:1V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 rnin; (D取上清，加入500-600pL 49:1 V/V氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑥ 去上清，向沉淀中加入70。/。V/V的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15 min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過ITS-PCR擴(kuò)增后再通過1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質(zhì)量是否滿足試驗需要。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Gfl朋&rmfl 5"6aw6o/we/we種菌株或子實體的特異性分子 標(biāo)記的獲得方法，其特征在于所述步驟II中，ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25ul: 10XPCRbuffer Promega 2. 5 p 1 ， 25,1/LMgC12 Promega 2. 0ul，10,1/L dNTPs 0. 5uL， 引物ITS1F/ITS4 10 u mol/L各1 P 1 ， Taq酶5U/ y 1 Promega 0. 25 y 1 ， DNA模板10 ng/ u L luL，加無菌雙蒸水補(bǔ)足，PCR反應(yīng)條件為:94°C 2min; 94°C 15s, 62。C30s， 72°C 1 rain， 28個循環(huán)；72°C 5min， Ganoderma subamboinense種菌株或子實體ITS序列，大小為 678bp:AGCATATCA ATAAGC 。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Ga"o""wfl ^Z^w6o/"e""種菌株或子實體的特異分子標(biāo) 記的獲得方法，其特征在于所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10 XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl22.0pL, 10 mmol/L dNTP 0.5pL， 10nmol/L特異引物 對各1^L， 5U4iLTaq酶0.30pL， 10-20ng/pL DNA模板lpL,無菌雙蒸水補(bǔ)足25pL; PCR 反應(yīng)條件為94°C 2min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環(huán)；72°C 5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Ganoderma subamboinense種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記的 獲得方法，其特征在于所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL， 與0.5nL加樣緩沖液混勻，點樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm 電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
8. —種Ga"o&rwa w6am6o/ne"w種菌株或子實體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和 檢測Ga加&rwa sw6aw6oz'we朋e禾中菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種Ganoderma subamboinense種菌株或子實體特異分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，該標(biāo)記是PCR擴(kuò)增后為461bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對序列為5′tcgcgaagcgggctctttact 3′和5′ggtcataaagctgtccaaacg 3′；獲得方法1)菌株或子實體基因組DNA的提?。?)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴(kuò)增引物；4)用特異PCR擴(kuò)增引物對對菌株或子實體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測；應(yīng)用用于快速鑒定和檢測Ganoderma subamboinense種菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)?。本發(fā)明的方法常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點。
文檔編號C12Q1/68GK101514362SQ200810204548
公開日2009年8月26日 申請日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者娜 馮, 方 劉, 劉艷芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 王晨光, 蘇春麗, 薇 賈, 郝瑞霞 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院