專利名稱：密紋薄芝種菌株或子實(shí)體特異分子標(biāo)記及獲得方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬靈芝菌株鑒別領(lǐng)域，特別是涉及一種密紋薄芝種菌株或子實(shí)體特異性分 子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
密紋薄芝人治療神經(jīng)衰弱、心悸、失眠、急性肝炎和慢性肝炎。
隨著對(duì)靈芝的生物學(xué)功效的不斷了解，以其為原料開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品越來(lái)越多，銷售量也越 來(lái)越大，靈芝原料的質(zhì)量越來(lái)越受到重視。近年來(lái)，隨著靈芝各種產(chǎn)品的商品化，大大帶 動(dòng)了中國(guó)靈芝栽培生產(chǎn)的迅速發(fā)展，同時(shí)靈芝的種質(zhì)資源也在不斷擴(kuò)大，但是由于我國(guó)食 藥用菌品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產(chǎn)用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的 現(xiàn)象在栽培生產(chǎn)上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來(lái)了難度，也給以靈芝為原料的保健 品及藥品等的相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失?，F(xiàn)在因?yàn)榫N問(wèn)題常常造成我國(guó)靈芝產(chǎn)品 質(zhì)量難以穩(wěn)定的局面，也嚴(yán)重地制約了我國(guó)靈芝產(chǎn)品走出國(guó)門(mén)，走向國(guó)際市場(chǎng)的步伐。
傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征來(lái)進(jìn)行，包括擔(dān)孢子的大小和子實(shí)體真 皮菌絲的形態(tài)特征，但是子實(shí)體的許多形態(tài)學(xué)特征往往隨著生長(zhǎng)條件的不同而發(fā)生變化， 而且許多鑒別性特征經(jīng)常是幾個(gè)種所共有的，這給傳統(tǒng)的分類學(xué)帶來(lái)了很大的困難，僅僅 依據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行菌種鑒定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑒定手段，對(duì)靈芝產(chǎn)業(yè)的進(jìn) 一步發(fā)展尤為重要。
近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)栽培靈芝菌株的分類研究也越來(lái)越多，主要是集中在應(yīng)用拮抗實(shí)驗(yàn)、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA)分析及同工酶分析 技術(shù)方面。
張松等(1995)通過(guò)對(duì)4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發(fā)現(xiàn)，供試的四個(gè)菌株 存在5條相同的酶帶，說(shuō)明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特征，在其代謝過(guò)程中具有某 些相似的生理活動(dòng)，但各菌株在酶帶數(shù)目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的 特征酶帶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)子實(shí)體形態(tài)學(xué)特征相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關(guān)系比較近， 這些說(shuō)酯酶同工酶分析對(duì)于靈芝的分類鑒定有一定的價(jià)值。
趙明文等(2003)利用RAPD技術(shù)對(duì)生產(chǎn)中常用的靈芝屬8個(gè)菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了 分析。根據(jù)UPGMA構(gòu)建的樹(shù)狀圖將8個(gè)菌株在較低的相似水平上分成3個(gè)明顯不同的組 第1會(huì)且包手舌黑芝(C "wod^vw" )、1^杉靈芝((3awo^ferw" "wg"e)、 圓芝(G^wo^fer附" ra^mfo^附)、靈芝0770 /wczV/w附0770)禾口韓國(guó)靈芝(G^wocferma /wczV/ww HG);第2組包括密紋靈芝(Ga"o血nwtfcre6m^/加ww)和紫芝(Ga"oArwaw'"erae);第3組為 樹(shù)舌靈芝(G朋oArwaa;^/a舶加/n)。這一結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果基本相符，表明RAPD技術(shù) 可以用來(lái)區(qū)分生產(chǎn)中一些常用的靈芝種，同時(shí)說(shuō)明靈芝生產(chǎn)用種之間遺傳差異較大，可能 是造成靈芝產(chǎn)品研究比較混亂的重要原因。
1999年我國(guó)簽署了《國(guó)際植物新品種保護(hù)法》，這不僅要求我們尊重其它國(guó)家的品種 知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)也要加強(qiáng)保護(hù)我們國(guó)家自己的品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)，為了建立食用菌新品種登記 制度來(lái)真正保護(hù)我國(guó)的品種產(chǎn)權(quán)，必須首先建立成熟的品種鑒定技術(shù)，為新品種登記奠定 g石出。
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分于標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立與成熟，為 發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的鑒定技術(shù)提供了有效手段。SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)標(biāo)記是一種十分穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在應(yīng)用上具有迅速、簡(jiǎn)便、低成本的特點(diǎn)，本發(fā) 明建立了密紋薄芝種的SCAR分子標(biāo)記，能對(duì)密紋薄藝種進(jìn)行快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種密紋薄芝種菌株或子實(shí)體特異性分子標(biāo)記 及其獲得方法與應(yīng)用，通過(guò)該分子標(biāo)記能簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的鑒定和檢測(cè)密紋薄芝菌種。
本發(fā)明的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記，是一種基因SCAR分子標(biāo)記， 是PCR擴(kuò)增后為469bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對(duì)序列為 5'cgtcgtaaagcgagtctcttc 3'禾口 5'ggtcataaagttgtcccagac 3'。
本發(fā)明的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，包括如下步驟 I.菌株或子實(shí)體基因組DNA的提取
(1) 菌株基因組DNA的提取 將4-6'C的密紋薄芝菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴
薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;
(2) 子實(shí)體基因組DNA的提取
將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡處理20-30小時(shí)，過(guò)濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000pLpH8.0CNETS 溶液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時(shí)，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實(shí)體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS;II. 密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實(shí)體ITS片段的獲得、測(cè)序及比對(duì)
用ITS-PCR法，其中ITS引物對(duì)為ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，； ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實(shí)體ITS片段；然后測(cè)序并比對(duì)各個(gè)靈芝屬種的代表性的序列。
III. 特異性PCR引物的獲得
根據(jù)ITS序列的比對(duì)結(jié)果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)下面序 列的紅色加粗部分)，并設(shè)計(jì)出特異性PCR引物對(duì)為5'cgtcgtaaagcgagtctcttc 3'和 5'ggtcataaagttgtcccagac 3、
IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對(duì)對(duì)密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8)aL，與0.5nL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上， 于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝 膠成像儀上照相。
所述步驟I (l)中所述的LETS提取法
① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無(wú)菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個(gè)1.5ml的離心管中；
② 向每個(gè)管中加入600-800^iL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫(xiě)為PCI)(比例為25:24:1)上下 顛倒，充分混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘;
③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500nL的PCI， 4°C 16000g離心8-I5分鐘;
④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒(méi)有雜質(zhì)為止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的己-20"預(yù)冷的無(wú)水乙醇或95%乙醇，輕輕混勻， 置于-20'C冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4'C16000g離心10-15分鐘；
⑦ 倒去上清，再向管中加入50(^L預(yù)冷的70。/0 (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會(huì)兒，4'C16000g離心IO分鐘；
⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；
⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液(pH8.0),按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；
⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過(guò)ITS-PCR擴(kuò)增后再通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)，以確定頁(yè)
其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括
① 將已經(jīng)預(yù)處理過(guò)得子實(shí)體置于預(yù)冷的無(wú)菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個(gè)2.0 ml的離心管中；
② 向每個(gè)離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；
取上清，加入600-800^L 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30nL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；
⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過(guò)ITS-PCR擴(kuò)增后再通過(guò)1.0n/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)，以確定
其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
所述步驟II中，ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25u 1): 10 XPCR buffer (Promega) 2.5ixl， 25mmol/LMgC12(Pro鵬ga) 2. 1， 10ramol/L dNTPs 0. 5 n L,引物ITS1F/ITS4( 10 u mol/L) 各lul， Taq酶(5U"1) (Promega) 0.25yl， DNA模板(IO ng/u L) 1 u L，加無(wú)菌雙蒸 水補(bǔ)足，PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62。C30s， 72°C 1 min， 28個(gè)循環(huán)； 72°C 5min，密紋薄芝種菌株或子實(shí)體ITS序列，大小為642bp:
GTAGGACTACCCGCTGAACTTATACATATCAATAAGACGGAGGAA 。
所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25nL: 10XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/LMgCl22.(^L， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， lOpmol/L特異引物對(duì)各lpL， 5U/nLTaq酶0.3(HiL， 10-20ng/RLDNA模板lnL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足25pL; PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL，與0.5^L加樣緩沖 液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電 泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
本發(fā)明的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測(cè)密紋薄 芝種菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?本發(fā)明的有益效果
(O只有密紋薄芝種能PCR擴(kuò)增出分子量為469bp的專一擴(kuò)增條帶，而靈芝屬的其它菌 種均未出現(xiàn)該特異性片斷；
(2)采用這種特異性分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比， 具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，該檢測(cè)所需時(shí)間只需要2-3天，而常規(guī)的拮抗試驗(yàn)所 需時(shí)間至少需要兩周時(shí)間，出菇試驗(yàn)則需要5-6個(gè)月的時(shí)間。


圖1是ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜；
圖2是密紋薄芝特異引物對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜。
其中，生產(chǎn)用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49, 52， 54， 59, 60， 62， 63, 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來(lái)自ATCC (24支):121-126， 128-145;
標(biāo)號(hào)中間有斷開(kāi)的，這是因?yàn)樵诰N保藏過(guò)程中失去活力了，但并未因此改變其他菌株的 編號(hào)。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限 定的范圍。
實(shí)施例1
菌種收集到來(lái)自國(guó)內(nèi)的140支靈芝屬生產(chǎn)用菌種以及來(lái)自ATCC24支共計(jì)164支菌株，它們分屬于赤芝、紫芝、樹(shù)舌、松杉靈芝、樹(shù)舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無(wú)柄靈芝等IO余個(gè)種。對(duì)它們的基因組DNA和密紋薄芝24子實(shí)體基因 組(編號(hào)190) I)NA共計(jì)165個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
一、 基因組DNA的提取
1. 菌絲培養(yǎng)和基因組DNA的提取 (1)菌株基因組DNA的提取
將4-6。C的密紋薄芝菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28'C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴 薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA， DNA 稀釋至10-20ng^L， -20°。保存；
2. 子實(shí)體基因組DNA的提取
① 將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時(shí)，過(guò)濾；
② 過(guò)濾后用滅過(guò)菌的雙蒸水沖洗，放在滅過(guò)菌的研缽中用液氮處理并進(jìn)行研磨；
③ 向每個(gè)離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min; 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800pL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉淀中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30pL的TE緩沖液(pH8.0)，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；
⑨ DNA稀釋至10-20 ng4iL， -20°。保存。
二、 特異性PCR擴(kuò)增
擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5pL， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0nL， dNTP (10纖ol/L) 0.5pL， lOpmol/L特異引物對(duì)(5'cgtcgtaaagcgagtctctte 3'和 5'ggtcataaagttgtcccagac 3')各lpL， Taq酶(5U/pL) 0.30^L， DNA模板(10-20ng^L) lpL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足25pL。
PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
取特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-8pL,與0.5piL加樣緩沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖 凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，自來(lái)水沖洗后在凝膠成像儀上照相。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在這些樣品中只有密紋薄芝種能擴(kuò)增出大小為469bp的專一擴(kuò)增條帶，而
靈芝屬的其它菌種均未出現(xiàn)該特異性片斷。
權(quán)利要求
1.一種密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異性分子標(biāo)記，其特征在于該標(biāo)記是一種基因SCAR分子標(biāo)記，是PCR擴(kuò)增后為469bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對(duì)序列為5′cgtcgtaaagcgagtctcttc 3′和5′ggtcataaagttgtcccagac 3′。
2. 密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，包括步驟I.菌株或子實(shí)體基因組DNA的提取(1) 菌株基因組DNA的提取 將4-6。C的密紋薄芝菌種轉(zhuǎn)接到PDA斜面上，26-28。C培養(yǎng)活化，5-7天后轉(zhuǎn)接到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液中，26-28振蕩培養(yǎng)10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;(2) 子實(shí)體基因組DNA的提取將子實(shí)體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA 'Na2混合 物浸泡處理20-30小時(shí)，過(guò)濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1 OOOpL pH 8.0 CNETS溶 液分裝于2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時(shí)，畫(huà)0-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實(shí)體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 1Ommol/LEDTA、 20 mmol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實(shí)體ITS片段的獲得、測(cè)序及序列比對(duì) 用ITS-PCR法，其中ITS弓I物對(duì)為ITS 1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA陽(yáng)3 ，；ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實(shí)體ITS片段；然后測(cè)序并比對(duì)各個(gè)靈芝屬種的代表性的序列。III. 特異性PCR引物的獲得根據(jù)ITS序列的比對(duì)結(jié)果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結(jié)合位點(diǎn)，利用Primer Premier5.0 設(shè)計(jì)出特異性 PCR 引物對(duì)為 5'cgtcgtaaagcgagtctcttc 3'和 5'ggtcataaagttgtcccagac 3';IV. 用特異PCR擴(kuò)增引物對(duì)對(duì)密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò) 增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特 征在于所述步驟I(1)中所述的LETS提取法① 將凍干的菌絲大約20-30mg置于預(yù)冷的無(wú)菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個(gè)1.5ml的離心管中；② 向每個(gè)管中加入600-800pL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下顛倒，充分混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清于新的離心管中，加入50(HiL的PCI, 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重復(fù)步驟③，直到兩相的界面沒(méi)有雜質(zhì)為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預(yù)冷的無(wú)水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置于-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4'C16000g離心10-15分鐘；⑦ 倒去上清，再向管中加入50(HiL預(yù)冷的70。/。V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會(huì)兒，4。C16000g離心IO分鐘;⑧ 重復(fù)步驟⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；⑩ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過(guò)ITS-PCR擴(kuò)增后再通過(guò)1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)，以確定其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特 征在于所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將已經(jīng)預(yù)處理過(guò)得子實(shí)體置于預(yù)冷的無(wú)菌研缽中迅速研磨成細(xì)粉，后迅速向研缽中加入1000ml已配制定好的CNETS緩沖液，分裝于2個(gè)2.0 ml的離心管中；② 向每個(gè)離心管中加入600-80(HiL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;③ 取上清，重復(fù)重復(fù)步驟②1-2次；④ 取上清，加入600-800nL 1:1V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-600pL 49:1 V/V氯仿異戊醇混勻，1200(M4000g離心10-15 min; 去上清，向沉淀中加入70y。V/V的酒精，振蕩；1000(M2000g離心5-15min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發(fā)后，加入20-30HL的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個(gè)小時(shí)；⑧ 將獲得的基因組DNA經(jīng)過(guò)ITS-PCR擴(kuò)增后再通過(guò)1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測(cè)，以確定其質(zhì)量是否滿足試驗(yàn)需要。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異性分子標(biāo)記的獲得方法， 其特征在于所述步驟II中，ITS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25ul: 10XPCR buffer Promega 2.5tU， 25mmol/LMgC12 Protnega 2.0nl，10mmol/L dNTPs 0.5uL，引物ITS1F/ITS4 10umol/L各lu 1， Taq酶5U/ul PromegaO. 25ix 1 ， DNA模板10 ng/yL luL，加無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足，PCR反應(yīng)條件為94°C 2 min; 94°C 15s, 62。C30s， 72°C 1 min， 28個(gè)循 環(huán)；72 °C 5min ;密紋薄芝種菌株或子實(shí)體ITS序列，大小為642bp :TAGGACTACCCGCTGAACTTATACATATCAATAAGACGGAGGAA。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特 征在于所述步驟IV中，PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5nL， 25mmol/L MgCl22.0nL, 10讓ol/L dNTP 0.5nL， lO^mol/L特異引物對(duì)各lpL， 5U/pL Taq 酶0.3(HiL， 10-20ng/nLDNA模板lpL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足25pL; PCR反應(yīng)條件為94'C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個(gè)循環(huán)；72°C 5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記的獲得方法，其特征 在于所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的條件是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6-^iL，與0.5pL加樣緩 沖液混勻，點(diǎn)樣于1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，于1.0XTAE緩沖液中，5V/cm電壓下電泳， 電泳結(jié)束后，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
8. —種密紋薄芝種菌株或子實(shí)體的特異分子標(biāo)記應(yīng)用于快速鑒定和檢測(cè)密紋薄芝種 菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)巍?br> 全文摘要
本發(fā)明涉及一種密紋薄芝種菌株或子實(shí)體特異分子標(biāo)記及其獲得方法與應(yīng)用，該標(biāo)記是PCR擴(kuò)增后為469bp的特異DNA片斷，其PCR擴(kuò)增引物對(duì)序列為5′cgtcgtaaagcgagtctcttc 3′和5′ggtcataaagttgtcccagac 3′；獲得方法1)菌株或子實(shí)體基因組DNA的提??；2)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴(kuò)增引物；4)用特異PCR擴(kuò)增引物對(duì)對(duì)菌株或子實(shí)體的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；應(yīng)用用于快速鑒定和檢測(cè)密紋薄芝種菌株及市售靈芝類產(chǎn)品的真?zhèn)?。本發(fā)明的方法常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)、拮抗試驗(yàn)、出菇試驗(yàn)相比，具有檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101514367SQ20081020455
公開(kāi)日2009年8月26日 申請(qǐng)日期2008年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日
發(fā)明者娜 馮, 方 劉, 劉艷芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 蘇春麗, 薇 賈, 郝瑞霞 申請(qǐng)人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院