專利名稱：一種定量指導(dǎo)孕前及孕期葉酸補(bǔ)充劑量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種定量指導(dǎo)孕前及 孕期葉酸補(bǔ)充劑量的試劑盒，通過(guò)同時(shí)檢測(cè)與葉酸代謝能力密切相關(guān)的5，10-亞甲基四氫 葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)上的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基 因型來(lái)確定適合不同人群的葉酸補(bǔ)充劑量。
背景技術(shù)：
葉酸是機(jī)體所需的重要營(yíng)養(yǎng)素，為水溶性B族維生素，在綠葉蔬菜、水果及動(dòng)物肝 臟中含量豐富。葉酸在人體內(nèi)以四氫葉酸的形式起作用，四氫葉酸是一碳單位的運(yùn)載體，可 運(yùn)載甲基、甲烯基、甲醛基等一碳單位，參與體內(nèi)氨基酸、嘌呤、嘧啶的合成。因而葉酸對(duì)細(xì) 胞分裂增殖、組織修復(fù)和機(jī)體發(fā)育等都是不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素。 對(duì)于孕婦，補(bǔ)充葉酸尤其重要。葉酸缺乏會(huì)導(dǎo)致兩種結(jié)果第一，使同型半胱氨酸 向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致高同型半胱氨酸血癥，后者可引起血管內(nèi)皮損傷、促進(jìn) 血管平滑肌細(xì)胞增生，引起凝血和纖溶系統(tǒng)功能失調(diào)，使血液處于高凝狀態(tài)，也是引起妊娠 高血壓綜合征的重要因素；第二，引起S-腺苷甲硫氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸比值降低，抑 制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性和DNA甲基化，造成染色體不分離現(xiàn)象，引起多種胎兒畸形。近年來(lái) 發(fā)現(xiàn)，血漿中同型半胱氨酸水平升高與習(xí)慣性流產(chǎn)、妊娠高血壓綜合征(妊高征)、胎盤早 剝、胎兒生長(zhǎng)受限、胎兒畸形、死胎、早產(chǎn)、低體重兒等現(xiàn)象的發(fā)生密切相關(guān)。
妊娠頭4周是胎兒神經(jīng)管分化和形成的重要時(shí)期，此期葉酸缺乏可增加胎兒神經(jīng) 管畸形及早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，而很多受孕者在早孕期并沒(méi)意識(shí)到自己已經(jīng)懷孕；更有研究顯示，婦 女在服用葉酸4周后，體內(nèi)葉酸缺乏的狀態(tài)才能得到明顯的改善。因此，育齡婦女至少應(yīng)在 孕前3個(gè)月開(kāi)始，適當(dāng)多吃富含葉酸的食物和補(bǔ)充葉酸，以確保胚胎早期有一個(gè)較好的葉 酸營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，預(yù)防胎兒神經(jīng)管及其他器官畸形的發(fā)生。 育齡婦女服用葉酸增補(bǔ)劑時(shí)由于個(gè)人的遺傳體質(zhì)不同，存在葉酸代謝能力的差 異，不同人群所需葉酸劑量不能一概而論。如服用劑量不足實(shí)際需求，達(dá)不到補(bǔ)充葉酸的效 果；而盲目過(guò)量服用高濃度葉酸，會(huì)干擾孕婦的營(yíng)養(yǎng)元素代謝，同樣會(huì)影響胎兒發(fā)育，超量 服用葉酸也會(huì)引起藥品不良反應(yīng)，反而會(huì)對(duì)孕婦和胎兒造成嚴(yán)重不良后果。所以不同身體 狀況與素質(zhì)的育齡婦女必須根據(jù)自身情況，有的放矢地準(zhǔn)備與補(bǔ)充所需要的葉酸。
因此，選取與育齡婦女孕前/孕期以及胎兒發(fā)育所需的葉酸代謝密切相關(guān)且研究 明確的一些重要基因位點(diǎn)，綜合利用現(xiàn)代科學(xué)研究成果，開(kāi)發(fā)一項(xiàng)基于分子遺傳基礎(chǔ)的葉 酸增補(bǔ)劑服用定量指導(dǎo)產(chǎn)品，將能夠針對(duì)不同遺傳體質(zhì)人群提出適合其自身需求的葉酸補(bǔ) 充劑量指導(dǎo)，具有很強(qiáng)的社會(huì)意義和廣闊的市場(chǎng)前景。 目前，經(jīng)證實(shí)并且機(jī)理研究清楚的與葉酸代謝密切相關(guān)的基因有5，10-亞甲基 四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)。 MTHFR為5， lO—methylenetetrahydrofolate reductase (NADPH)(亞甲基四氫葉 酸還原酶)蛋白編碼基因，主要作用是在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5_甲基四氫葉酸鹽。5-甲基四氫葉酸鹽可以進(jìn)一步進(jìn)入甲基傳遞通路， 通過(guò)同型半胱氨酸的重新甲基化過(guò)程間接的為DNA甲基化和蛋白質(zhì)甲基化提供甲基并且 使血液中的同型半胱氨酸量保持在一個(gè)較低的水平。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因存在多種多態(tài) 型，影響MTHFR活性和熱穩(wěn)定性。常見(jiàn)的變異包括(1) 677C-T :MTHFR基因第677位密碼子 胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)替代，編碼后酶分子中丙氨酸被纈氨酸替代，引起MTHFR熱穩(wěn)定 性和活性降低，相對(duì)于正常的C/C基因型，純合子T/T基因型MTHFR活性在37攝氏度降低 50 % 60 % ，在46攝氏度降低65 %; (2) 1298A-C :編碼后酶分子中谷氨酸被丙氨酸替代，弓I 起MTHFR活性降低。1298A-C與677C-T不同的是，純合子和雜合子血槳同型半胱氨酸升高 和葉酸降低均不明顯。然而，如果同時(shí)存在1298A-C和677C-T復(fù)合變異的雜合子，則MTHFR 活性低于野生型40%。 甲硫氨酸是蛋白質(zhì)合成和一碳代謝的必需氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶 (MTR編碼)催化的，而甲硫氨酸合酶因?yàn)檩o助因子維生素B12被氧化而最終失活。MTRR編 碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過(guò)還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨 酸合酶。MTRR能夠保持甲基鈷銨III在一定水平，而甲基鈷銨III是激活蛋氨酸合成酶的 輔助因子，它可催化同型半胱氨酸再甲基化生成蛋氨酸。MTRR變異是造成葉酸/甲基維生 素缺乏癥E型的主要原因。MTRR 66A —G多態(tài)性，導(dǎo)致蛋氨酸被異亮氨酸替代，使該酶活性 降低。該基因型對(duì)同型半胱氨酸水平有顯著影響。有研究指出，MTRR基因A66G多態(tài)，血漿 同型半胱氨酸增高，基因型為MTRR 66GG， MTRR 66AG的孕婦或胎兒發(fā)生神經(jīng)管畸形的危險(xiǎn) 性較正常對(duì)照組增加。

發(fā)明內(nèi)容
基于5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因 (MTRR)上的3個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性可用來(lái)評(píng)估葉酸代謝遺傳能力的基礎(chǔ)，本發(fā)明提供一種定 量指導(dǎo)孕前及孕期葉酸補(bǔ)充劑量的試劑盒。
該試劑盒包括 檢測(cè)5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異 性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 檢測(cè)5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801131號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異 性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 檢測(cè)甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號(hào)SNP多態(tài)性基因型的特異性引物 對(duì)及特異性熒光探針對(duì)； 熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。 本試劑盒中所述的特異性引物對(duì)是指針對(duì)5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上 rsl801133號(hào)和rsl801131號(hào)SNP位點(diǎn)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號(hào)SNP位 點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能特異性擴(kuò)增出包含這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的DNA片段的引物對(duì)。設(shè)計(jì)這類引物對(duì)是 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性引物對(duì)可用常規(guī)的合成技術(shù)進(jìn)行合成。
本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是指針對(duì)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基 因上rsl801133號(hào)和rsl801131號(hào)SNP位點(diǎn)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rsl801394號(hào)SNP位點(diǎn)而設(shè)計(jì)，能通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)特異性檢測(cè)出這三個(gè)SNP位點(diǎn)基因型的T叫man
探針對(duì)。設(shè)計(jì)這類探針是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易完成的。特異性熒光探針對(duì)可用常規(guī)的
探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。所有可用于熒光定量PCR法檢測(cè)本發(fā)明中所述的三個(gè)SNP位點(diǎn)的
探針均在本發(fā)明范圍內(nèi)。 本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括 3 ill IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液， 0. 3 ii 1 25mM dNTP混合液， 1. 8 ii 1 25mM MgCl2溶液， 0. 075 ii 1 (5units/ ii 1) Taq DNA聚合酶， 20iiM特異性引物對(duì)每條引物各0. 225iU， 10 ii M特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25 ill ， 去離子水15. 975 ii 1 。 本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C 。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。
實(shí)施例1.檢測(cè)試劑盒的使用
步驟l:DNA模板的抽取 用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。
步驟2 :熒光定量PCR反應(yīng) 使用檢測(cè)試劑盒，進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR反應(yīng)，每次反應(yīng)的體系為總體 積lOiU，包含濃度為20ng/iil的DNA模板2iil、lii1 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 ii 1 25mM dNTP混合液、0. 6 ii 1 25mM MgCl2溶液、0. 025 ii 1 (5units/ ii 1) Taq DNA聚合 酶、20 ii M的有義引物和反義引物各0. 225 iil、10 ii M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各O. 25ii 1，去離子水5. 325 ii 1。 在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50C、2分鐘，95°C 、 10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒，6(TC、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。
步驟3 :SNP基因型分析 根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。
熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過(guò)辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示的 最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針VIC和FAM熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測(cè)的SNP位 點(diǎn)的基因型。 實(shí)施例2.應(yīng)用檢測(cè)試劑盒進(jìn)行葉酸增補(bǔ)劑定量指導(dǎo)的服務(wù)
步驟1 :DNA提取 由醫(yī)院檢驗(yàn)科醫(yī)師指導(dǎo)被檢者使用口腔采樣拭進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞取樣，采用硅膠 吸附法進(jìn)行口腔上皮細(xì)胞的DNA抽提。
步驟2 :基因分型檢測(cè) 使用本發(fā)明提供的試劑盒，對(duì)被檢測(cè)者基因組DNA的5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rsl801133號(hào)和rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394 號(hào)SNP位點(diǎn)分別進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，確定這3個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型。
步驟3 :葉酸增補(bǔ)劑定量指導(dǎo) 通過(guò)對(duì)被檢測(cè)者SNP基因型的分析，出具葉酸代謝遺傳能力的分析報(bào)告單。報(bào)告 中詳細(xì)說(shuō)明了被檢測(cè)者葉酸代謝遺傳能力的高低，并由醫(yī)師向被檢者詳細(xì)說(shuō)明和解讀葉酸 代謝遺傳能力評(píng)估分析報(bào)告單，給予葉酸增補(bǔ)劑服用定量指導(dǎo)。
權(quán)利要求
一種定量指導(dǎo)孕前及孕期葉酸補(bǔ)充劑量的試劑盒，其特征在于包括同時(shí)檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因上rs1801133號(hào)SNP位點(diǎn)和rs1801131號(hào)SNP位點(diǎn)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因上rs1801394號(hào)SNP位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括3iU 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、0. 3iU 25mM dNTP混合液、1. 8 yl 25mM MgCl2溶液、 0.075ii 1(5units/ii l)Taq DNA聚合酶、20 ii M特異性引物對(duì)每條引物各0. 225 ii 1、10iiM 特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25iU、去離子水15. 975 iU。本試劑盒供一人份檢測(cè)應(yīng) 用，試劑盒的保存溫度為_(kāi)20°C。
3. 權(quán)利要求1所述的試劑盒在定量指導(dǎo)孕前及孕期葉酸補(bǔ)充劑量上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種定量指導(dǎo)孕前及孕期葉酸補(bǔ)充劑量的試劑盒及其應(yīng)用。該試劑盒包括同時(shí)檢測(cè)5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶基因(MTRR)上的3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、用于熒光定量PCR檢測(cè)的常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒可用于定量指導(dǎo)孕前及孕期葉酸補(bǔ)充劑量。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101760526SQ200810207840
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請(qǐng)人:海南主健生物醫(yī)學(xué)科技有限公司