專(zhuān)利名稱(chēng)：用作醫(yī)療和功能性食品的鹿副產(chǎn)物膠原和功能性膠原蛋白制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及醫(yī)療用活性鹿膠原及功能性食品和化妝品用活性鹿膠原蛋白的 制備方法。
背景技術(shù)：
膠原的提取通常采用酸法或酶法。膠原蛋白的制備可以用加熱、堿法和酶 法。本發(fā)明將鹿副產(chǎn)物先經(jīng)微粉碎和高壓均質(zhì)的輔助提取法處理，使要提取的成分盡可能 釋放，再通過(guò)醋酸和生物酶制劑聯(lián)合處理的方法，提取其中的膠原，經(jīng)水洗和干燥后可以 作為生物材料和醫(yī)用原料。膠原蛋白的制備采用高壓均質(zhì)后的原料經(jīng)生物酶定向酶解技術(shù) 制得，利用膜分離技術(shù)，脫鹽或經(jīng)濃縮和干燥可制備具有抗疲勞和免疫調(diào)節(jié)功能的膠原蛋 白。采用本發(fā)明的方法制備產(chǎn)品具有工業(yè)化程度高，條件溫和，安全性高的特點(diǎn)。對(duì)提高 目前鹿產(chǎn)品尤其是鹿副產(chǎn)品的附加值和利用效果具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種從鹿產(chǎn)品副產(chǎn)物中分離提取膠原和制備具有
抗疲勞和調(diào)節(jié)免疫功能的生物活性膠原蛋白的方法，其特征在于它的制備過(guò)程為
a.原料預(yù)處理原料為脫脂的鹿骨和鹿皮等鹿副產(chǎn)物。預(yù)處理的關(guān)鍵技術(shù)為將原料
經(jīng)微粉碎和高壓均質(zhì)成微小的顆粒，采用高壓均質(zhì)機(jī)在50MPa處理lmin，過(guò)篩，分離得 到處理好的原料。
b. 膠原的提取所有操作都在4(TC條件以下進(jìn)行。原料加入10-15倍體積的0.5M醋 酸溶液中，調(diào)節(jié)pH值至2.0 3.0，加入0.5%-1%胃蛋白酶消化48h，調(diào)節(jié)pH值至7， 去除胃蛋白酶，消化液離心G5,000g， 45min)，收集上清液。向溶液中緩慢加入固體NaCl 使最終濃度為4.1%，連續(xù)緩慢攪拌12hr。沉淀離心(7000g， 45min)后收集，重新溶解 于0.5M醋酸溶液，離心(35,000g， 45min)除去沉淀，在相同溶液透析2d，每天換透析 液2次。直至在透析液中滴加AgN03溶液無(wú)沉淀產(chǎn)生，將透析后溶液冷凍干燥，至此可 以得到高純度的膠原。
c. 膠原蛋白的制備生物酶降解將均質(zhì)原料的溫度調(diào)整到50'C 65'C,加入酸或 堿使其pH值在8.0 8.5，加入占原料質(zhì)量3% 6%的蛋白酶A進(jìn)行水解且不斷攪拌，力口 入堿使反應(yīng)液的pH值維持在8.0 8.5之間，水解1 5h。水解結(jié)束后加入酸調(diào)節(jié)pH值 至4.2 4.6,升溫滅酶活，冷卻至室溫后離心20 40min，取上清液。d. 膜分離采用30KDa分子量的超濾膜，對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行膜分離，獲得分子量〈5KDa 的膠原蛋白，收集膜濾出液。
e. 脫鹽將陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂裝柱，取膜濾出液酶解產(chǎn)物以8 12倍柱體積/h的流 速通過(guò)陽(yáng)、陰離子交換樹(shù)脂，得脫鹽精制的膠原蛋白，即成品。也可對(duì)其進(jìn)行濃縮或干燥。
膠原產(chǎn)品具有膠原的基本特征，純度〉90%，分子量〉100KDa。使用本發(fā)明的方法得 到的膠原無(wú)味，干燥后為白色，無(wú)過(guò)敏性，具有海綿體結(jié)構(gòu)。其制備方法和條件具有工藝 簡(jiǎn)單、易于操作、周期短等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明制備的產(chǎn)品由特殊的氨基酸組成，其中甘氨酸是 鹿膠原的主要氨基酸，占30%左右，其他含量比較高的氨基酸依次是脯氨酸、羥脯氨酸、 谷氨酸、丙氨酸。其生物學(xué)性質(zhì)與功能主要表現(xiàn)在(l)低抗原性與其它具有免疫原性
的蛋白質(zhì)相比，膠原的免疫原性非常低。(2)可生物降解性在膠原酶的作用下，膠原的
肽鍵將被水解而逐漸打斷，膠原肽鏈的斷裂隨即造成螺旋結(jié)構(gòu)的破壞，致使膠原被蛋白酶 徹底水解，這就是膠原的可生物降解性。膠原之所以能作為器官移植材料被利用，正是基
于此特性。(3)生物相容性即膠原與宿主細(xì)胞及組織之間良好的相互作用。(4)細(xì)胞適應(yīng) 性和細(xì)胞增殖作用膠原有利于細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，不僅能促進(jìn)細(xì)胞的增殖分化，而且對(duì) 改善細(xì)胞的分裂機(jī)能也有效果。(5)良好的力學(xué)性能天然膠原緊密的螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)高強(qiáng)度 的力學(xué)性能起重要作用，在生物體中，膠原是為結(jié)締組織提供強(qiáng)度的主要蛋白組分，因而 可在很大范圍內(nèi)滿(mǎn)足肌體對(duì)機(jī)械強(qiáng)度的要求。
對(duì)本發(fā)明制備的膠原進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳分子量測(cè)定，電泳后有3個(gè)條帶，分 子量為116,000Da、 140,000Da和200,000Da以上。對(duì)本發(fā)明制備的膠原用氨基酸自動(dòng)分析 儀進(jìn)行分析，證明具有膠原特征性氨基酸，其中甘氨酸占氨基酸總數(shù)的1/3，羥脯氨酸和 脯氨酸含量高，具備(Gly-Pro-Hyp)n膠原模式，說(shuō)明膠原三螺旋結(jié)構(gòu)完整。
鹿膠原蛋白產(chǎn)品純度>95%，分子量《KDa。使用本發(fā)明的方法得到的膠原蛋白無(wú)味。 其制備方法和條件具有工藝簡(jiǎn)單、易于操作、周期短等優(yōu)點(diǎn)。其功能特性主要表現(xiàn)在抗 衰老、抗腫瘤、抗疲勞、降血壓、抗氧化、護(hù)發(fā)護(hù)膚、養(yǎng)顏、修復(fù)腸胃等。
對(duì)本發(fā)明制備的膠原蛋白進(jìn)行分子量測(cè)定，方法和結(jié)果如下分子量測(cè)定采用凝膠色 譜法。凝膠選用Sephdex-G25，產(chǎn)物加樣量0.1ml，洗脫液為濃度0.1mol/L、 pH值7.0的 磷酸鹽緩沖液，流速lml/min。分子量標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白(68000)、溶菌酶(14400)、 VB12 (1355)、色氨酸(204)，水解產(chǎn)物的分子量在5000Da以下。對(duì)膠原蛋白的免疫調(diào) 節(jié)作用進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各劑量組均能顯著增加小鼠免疫器官的重量，對(duì)小 鼠的細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能和單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能也均有促進(jìn)作用，表明具有免疫調(diào)節(jié)作用。通過(guò)血乳酸、血尿素氮、負(fù)重游泳時(shí)間等小鼠抗疲勞試驗(yàn)證明膠原蛋白具 有明顯的抗疲勞功能。
權(quán)利要求
1、具有生物活性的鹿膠原和具有抗疲勞和調(diào)節(jié)免疫力功能的鹿膠原蛋白的制備方法，其特征在于它的制備過(guò)程為a. 原料預(yù)處理原料為鹿(梅花鹿、馬鹿、梅馬雜交鹿、赤鹿和馴鹿等)副產(chǎn)物，包括鹿骨、鹿皮等。預(yù)處理的關(guān)鍵技術(shù)為將原料經(jīng)微粉碎，使物料粒度<0.2mm。b. 膠原的提取所有操作都在40℃條件以下進(jìn)行。原料經(jīng)微粉碎，浸入10-15倍體積的0.5M醋酸溶液中，經(jīng)30-100Mpa高壓均質(zhì)，調(diào)節(jié)pH值至2.0～3.0，加入0.5％-1％胃蛋白酶消化48h，調(diào)節(jié)pH值至7，去除胃蛋白酶，消化液離心(35,000g，45min)，收集上清液。向溶液中緩慢加入固體NaCl使最終濃度為4.1％，連續(xù)緩慢攪拌12hr。沉淀離心(7000g，45min)后收集，重新溶解于0.5M醋酸溶液，離心(35,000g，45min)除去沉淀，在相同溶液透析2d，每天換透析液2次。直至在透析液中滴加AgNO3溶液無(wú)沉淀產(chǎn)生，將透析后溶液冷凍干燥，至此可以得到高純度的膠原。c. 膠原蛋白的制備將均質(zhì)原料的溫度調(diào)整到50℃～65℃，加入酸或堿使其pH值在8.0～8.5，加入占原料質(zhì)量3％～6％的蛋白酶A進(jìn)行水解且不斷攪拌，加入堿使反應(yīng)液的pH值維持在8.0～8.5之間，水解1～5h。水解結(jié)束后加入酸調(diào)節(jié)pH值至4.2～4.6，升溫滅酶活，冷卻至室溫后離心20～40min，取上清液。d. 膜分離采用1-3萬(wàn)分子量的超濾膜，對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行膜分離，獲得分子量<5KDa的膠原蛋白，收集膜濾出液。e. 脫鹽將陰陽(yáng)離子交換樹(shù)脂裝柱，取膜濾出液酶解產(chǎn)物以8～12倍柱體積/小時(shí)的流速通過(guò)陽(yáng)、陰離子交換樹(shù)脂，得脫鹽精制的膠原蛋白，即成品。也可對(duì)其進(jìn)行濃縮或干燥。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹿產(chǎn)品膠原的制備方法，其特征在于原料預(yù)處理階段需進(jìn) 行微粉碎，浸酸后經(jīng)高壓均質(zhì)(50Mpa)，使原料顆粒度盡可能小(<0.2mm)，以便于更 好的酶解，從中提取更多的膠原和膠原蛋白。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹿產(chǎn)品膠原的制備方法，其特征在于所有操作都在4(TC以 下條件進(jìn)行，防止膠原的變性。
4、 鹿產(chǎn)品膠原其特征在于它是由權(quán)利要求l、 2、 3所述的制備方法分離出膠原，產(chǎn) 品具有膠原的基本特征，膠原的純度>90%，分子量M00KDa。產(chǎn)品具有優(yōu)良的生物相容 性、可降解性、低免疫原性功能，而且在生物體內(nèi)容易被吸收、親水性強(qiáng)、無(wú)毒、安全性好。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的膠原蛋白制備方法，水解應(yīng)用的酶可以為以下酶中的一種 或兩種復(fù)合Neutrase、 Alcalase、 Potamex、中性蛋白酶1398和胰蛋白酶，其中，單獨(dú)使 用Alcalase的效果較好。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l、 5所述的膠原蛋白制備方法，分離得到的膠原蛋白具有純度>95 %，分子量〈5KDa。具有免疫調(diào)節(jié)作用和抗疲勞功能。
全文摘要
本發(fā)明涉及以鹿副產(chǎn)物(鹿骨、鹿皮)為原料制備活性膠原和功能性膠原蛋白的方法。本發(fā)明采用微粉碎和高壓均質(zhì)對(duì)原料進(jìn)行處理，采用酸-酶法提取鹿膠原，經(jīng)水洗和干燥得到純品膠原。采用定位酶解制備活性膠原蛋白，利用膜分離技術(shù)、脫鹽、濃縮和干燥技術(shù)，得到功能性膠原蛋白。本發(fā)明制備的膠原分子量＞100KDa，具有生物活性，制備的膠原蛋白分子量＜5KDa，具有抗疲勞和調(diào)節(jié)免疫力功能，采用的方法成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品可控的特點(diǎn)?？蓱?yīng)用于生物材料、醫(yī)藥、保健食品和化妝品等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12P21/06GK101445821SQ20081020976
公開(kāi)日2009年6月3日 申請(qǐng)日期2008年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月24日
發(fā)明者張立鋼, 趙玉紅, 天 高 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)