專利名稱：：柯薩奇病毒a16核酸檢測用引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，特別涉及柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物、探針及試劑盒。
背景技術(shù)：
：柯薩奇病毒A16(Cox^chev/ms爿M，簡稱CA16)為單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科(尸/coraw/rWae)。CA16是導(dǎo)致兒童手足口病的一種重要病原，所引起的臨床癥狀與腸道病毒71型感染引起的手足口病難于區(qū)別，但通常情況下，CA16感染一般不引起嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，由于其亞臨床感染常常被忽略。世界上許多國家和地區(qū)曾報道CA16所致手足口病的流行，且每隔3-5年有一次大流行。近年來由于CA16與心肌炎、心包炎及其它嚴重疾病的相關(guān)而逐漸受到重視，曰本、馬來西亞和臺灣都有CA16引起手足口病暴發(fā)流行的報道。1983-2003年，曰本手足口病的流行是由CA16、CA16地方變異抹和腸道病毒71型交替出現(xiàn)引起。因此，疾病預(yù)防控制機構(gòu)以及醫(yī)院急需特異性強，敏感性高，操作簡便，可用于手足口病等暴發(fā)疫情和臨床病例的早期快速診斷的方法。手足口病于2008年5月2日已被納入傳染病防治法規(guī)定的丙類傳染病進行管理。因此，快速、簡單、高靈敏度的檢測方法對該病的防控極其重要。經(jīng)典的檢測腸病毒的方法多采用細胞培養(yǎng)、特異性抗體檢測，該方法步驟煩瑣，檢測周期長，而且一些腸道病毒難以在細胞中進行增殖，容易出現(xiàn)漏檢；傳統(tǒng)的RT-PCR也被用于檢測EV71和CA16，但檢測時間需要6小時。實時熒光RT-PCR(wa/Wme//wr^a^7r-PO)技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、速度快、抗污染、高通量等優(yōu)點逐漸取代了傳統(tǒng)RT-PCR技術(shù)。本發(fā)明選擇柯薩奇病毒A16VP1基因設(shè)計了用于熒光RTJCR檢測的引物及探針序列，建立了柯薩奇病毒A16熒光RT-PCR檢測技術(shù)，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴增曲線判定是否有柯薩奇病毒A16。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于柯薩奇病毒A16實時熒光RT-PCR檢測的引物、探針序列及試劑盒，使得能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A16,為手足口病的病原學(xué)診斷提供科學(xué)依據(jù)。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明在分析已報道柯薩奇病毒A16VP1基因序列的基礎(chǔ)上，分別設(shè)計引物及焚光探針，所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核苷酸序列如下正向引物5，-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3，；反向引物5'-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3，。本發(fā)明設(shè)計的探針的核苷酸序列如下5'-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3，，該探針一端標(biāo)記有報告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。其中，報告熒光染料可釆用下列熒光基團中的任意一種Fam、Hex、Tet、Joe、Vic、FITC、Cy3和Cy5。淬滅焚光染料可采用下列焚光基團中的任意一種Tamra、Rox、Dabcyl、BHQ1和BHQ2。根據(jù)TaqMan技術(shù)，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了一條標(biāo)記有兩個熒光染料基團的核苷酸探針，例如將報告熒光染料標(biāo)記在探針的5'端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針的3'端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報告焚光染料所發(fā)射的焚光可被淬滅焚光染料吸收，當(dāng)二者距離變遠時，抑制作用減弱，報告熒光染料信號增強。在擴增反應(yīng)過程中，探針同模板上的目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在擴增延伸階段將探針切斷，淬滅焚光染料的抑制作用消失，報告熒光染料信號增強，從而實現(xiàn)對柯薩奇病毒A16的檢測。本發(fā)明進一步給出了應(yīng)用上述引物和探針檢測柯薩奇病毒A16核酸的方法，該方法是以樣品RNA為模板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進行實時熒光RT-PCR擴增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。具體地說本發(fā)明以RNA為摸板，進行實時熒光RT-PCR反應(yīng)，即在25(al反應(yīng)體系加入2.5^il10xOneStepRNAPCRBuffer,2juldNTP(各2.5mM),上述正向引物和反向引物(10|iM)各1.5jil，O，上述探針(lOjiM),0.5|ilTaq酶，0.5^1RNaseInhibitor(40U/pl)，0.5)ilAMVRTaseXL(5U/|al)，5|alRNA，10.5|ilRNaseFreedH20。其中，上述反應(yīng)條件可以是42。C反轉(zhuǎn)錄25min,95。C變性3min,以95。C10s，60°C1min(收集熒光信號)擴增40個循環(huán)。當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物對或者其擴增產(chǎn)物序列設(shè)計其他類型的探針，以適用不同方法的焚光PCR檢測。進一步，還可以將本發(fā)明的引物、探針以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發(fā)明根據(jù)柯薩奇病毒A16VP1基因序列設(shè)計的引物特異性好，用于熒光PCR檢測的靈敏度高。本發(fā)明檢測方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高，其能夠快速簡單地判斷樣品是否有柯薩奇病毒A16,為手足口病的病原學(xué)診斷及鑒別診斷提供了科學(xué)依據(jù)。圖1是實時熒光RT-PCR技術(shù)柯薩奇病毒A16核酸檢測的特異性實驗的檢測結(jié)果圖2是本發(fā)明檢測方法的靈敏度實驗的檢測結(jié)果圖。具體實施例方式下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。引物及探針的設(shè)計和合成根據(jù)GenBank中CA16VP1基因序列，利用生物軟件PrimerExpressV2.0分別在其保守位點設(shè)計引物和Taqman探針，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進行了Blast同源性比對驗證。引物序列為CA16Pf(正向)5，-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3'CA16Pr(反向)5，-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3，探針的序列為5，-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3'該探針的5'端用報告熒光染料VIC標(biāo)記，3'端用淬滅焚光染料BHQ2標(biāo)記。RNA的提取病毒樣品RNA的抽提用RocheHighPureviralRNAkit試劑盒提取，取0.5克左右糞便標(biāo)本，力口TE500jil制成10-20。/。的懸液，8000rpm離心5分鐘；取200(il標(biāo)本上清加400ial結(jié)合液，混合均勻，加入純化過濾管中，10000rpm,15s;棄去過濾液，換一新的收集管，加入500fi1inhibitorremovalbuffer,10000rpm離心l分鐘；棄去過濾液，換一新的收集管，加入450ial洗液，10000rpm離心l分鐘；重洗一次；最后離心，13000rpm,10s,棄去殘余的洗液；去掉收集管，換一個干凈的無RNA的1.5m正ppendrof離心管，用50fil洗脫液加入過濾管中，10000卬m離心l分鐘，將提取的RNA移到一個新的離心管中，于-80°C保存。Real-timeRT-PCR擴增方法的建立:1、實時熒光RT-PCR反應(yīng)體系以RNA為模板，進行實時RT-PCR反應(yīng)。熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、實時熒光RT-PCR反應(yīng)條件將樣品管放入ABI公司7300熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進行反應(yīng)42°C反轉(zhuǎn)錄25min，95。C變性3min，以95°C10s,60°C1min(收集熒光信號)擴增40個循環(huán)。每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。柯薩奇病毒A16核酸Real-timeRT-PCR方法的特異性確定利用建立起的熒光RT-PCR反應(yīng)體系對9抹不同的人類病毒進行檢測，檢測結(jié)果如圖l所示，3林CA16病毒(編號為CA16-SZ13,CA16-GZ07，CA16-SZ08)均出現(xiàn)相應(yīng)的特異性熒光擴增曲線(參見圖中A所指)，呈陽性反應(yīng)。而其他6抹人類病毒(包括3林滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒PolioI、PolioII、PolioIII,兩抹輪狀病毒、1抹諾如病毒。)則均沒有熒光信號產(chǎn)生(參見圖中B所指)，判為陰性。結(jié)果表明，所設(shè)計的引物探針只對目的病毒(即，CA16病毒)特異，與其它^^測對象無交叉反應(yīng)。試驗結(jié)果以柯薩奇病毒A16的RNA為模板，通過實時熒光RT-PCR檢測可觀察到明顯的熒光強度變化，而其他病毒的熒光強度沒有變化。靈敏度實驗:將CA16體外轉(zhuǎn)錄RNA用DEPC處理的水分別稀釋，進行相對靈敏度檢測，在25pl反應(yīng)體系中，RNA分別被稀釋成5.0x107、5.0x106、5.0x105、5.0x104、5.0x103、5.0x102、5.0xl(^拷貝數(shù),檢測結(jié)果如圖2所示，結(jié)果證實CA16病毒檢測的最低檢測限均達到50個模板拷貝。核苷酸序列表<110>何雅青肖性龍<120〉柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物、探針及試劑盒<160〉3<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述<400>1gaaccatcactccacacagg昭<210>2<211〉19<212>DNA<213>人工序列<223〉人工序列的描述<400〉2gtacccgtggtgggcattg<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<223>人工序列的描述探針<400>3cagccattgggaatttctttagccgtg278引物22引物權(quán)利要求1、一種柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物，其特征在于，該引物的核苷酸序列為正向引物5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3’；反向引物5’-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3’。2、一種與權(quán)利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，該探針的核苷酸序列為5'-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3',該探針一端標(biāo)記有報告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。3、如權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于報告熒光染料采用VIC熒光基團，標(biāo)記在探針的5，端，淬滅熒光染料采用BHQ2熒光基團，標(biāo)記在探針的3'端。4、一種檢測柯薩奇病毒A16核酸的方法，其特征在于該方法以樣品RNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的正向引物和反向引物以及權(quán)利要求2或3所述的探針進行實時熒光RT-PCR擴增，每個循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。5、如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，實時焚光RT-PCR擴增反應(yīng)采用25(il反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系的組分如下2.5^110xOneStepRNAPCRBuffer，終濃度為0.4mM的dNTP，終濃度為0.6jiM的所述正向引物，終濃度為0.6(iM的所述反向引物，終濃度為0.2liM的所述探針，終濃度為2.5U的Taq酶，終濃度為20U的RNaseInhibitor,終濃度為2.5U的AMVRTaseXL,5)il樣品脂A,10.5|ilRNaseFreedH20;實時熒光RT-PCR擴增反應(yīng)的反應(yīng)條件如下42。C反轉(zhuǎn)錄25min;95。C變性3min;以95°C10s,60°C1min擴增40個循環(huán)。6、一種柯薩奇病毒A16核酸檢測用試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求1所述的正向引物和反向引物。7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于還包括權(quán)利要求2或3所述的探針。全文摘要本發(fā)明涉及柯薩奇病毒A16核酸檢測用引物、探針及試劑盒，其引物的核苷酸序列為正向引物5’-GAACCATCACTCCACACAGGAG-3’；反向引物5’-GTACCCGTGGTGGGCATTG-3’。其探針的核苷酸為5’-CAGCCATTGGGAATTTCTTTAGCCGTG-3’。還提供了檢測柯薩奇病毒A16核酸的方法，該方法以樣品RNA為摸板，利用上述引物和探針進行實時熒光RT-PCR擴增，每個循環(huán)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為手足口病及相關(guān)疾病的病原學(xué)診斷及鑒別診斷提供了科學(xué)依據(jù)。文檔編號C12Q1/68GK101676406SQ20081021616公開日2010年3月24日申請日期2008年9月18日優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日發(fā)明者何雅青,肖性龍申請人:何雅青;肖性龍