專利名稱：腸道病毒71型核酸檢測用引物、探針及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測技術(shù)，特別涉及腸道病毒71型核酸檢測用引物、探針及 試劑盒。
背景技術(shù)：
腸道病毒71型CeWeraWrw (y， 7/，簡稱EV71)為單股正鏈RNA病毒，屬于 小RNA病毒科CP/coram^W&e)。 EV71是嗜神經(jīng)性病毒，除了引起兒童手足口病夕卜， 容易導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)并發(fā)癥，如無菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水 腫等，EV71致死率高。EV71感染一年四季均可發(fā)生，亞熱帶地區(qū)在夏秋季易于 造成流行。托幼機(jī)構(gòu)是EV71流行、爆發(fā)的主要場所。造成EV71感染與流行除了 宿主因素外，還與病毒的種類、侵入易感者的病毒量、病毒毒性強(qiáng)弱以及人群的抗 體水平有關(guān)。另外，低劣的衛(wèi)生條件和過度擁擠的居住環(huán)境在病毒的傳播中起重要 作用。EV71主要通過糞-口途徑在人群中傳播，帶毒的糞便可通過污染的手、餐具、 食物經(jīng)口進(jìn)入人體，咳嗽、打噴口囊形成的飛沫可直接或間接進(jìn)行傳播，另外，接觸 病人破潰的皰瘆液等也受到感染。幼兒普遍易感，易感性隨年齡增長而降低。10 歲以下兒童比較容易受到感染，幼兒發(fā)病最多，3歲以下比較容易出現(xiàn)并發(fā)癥，成 人患此病者較少，免疫功能不全的成人感染后，也有可能出現(xiàn)并發(fā)癥。
自1974年從美國加利福尼亞爆發(fā)的表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者首次分離到 EV71,許多國家和地區(qū)相繼報(bào)道了 EV71在不同地區(qū)的流行情況，1975年保加利 亞和1978年匈牙利發(fā)生嚴(yán)重EV71爆發(fā)流行，分別導(dǎo)致44例和45例死亡。近年 來，EV71在亞洲太平洋地區(qū)特別是東南亞地區(qū)的流行呈上升趨勢，在過去的七年 間就發(fā)生過多次爆發(fā)流行，其中最為嚴(yán)重的有四次，分別是1997年，馬來西亞， 30例死亡；1998年，臺(tái)灣，78例死亡；2000年，臺(tái)灣，25例死亡及2001年，臺(tái) 灣，26例死亡。EV71已經(jīng)取代脊髓灰質(zhì)炎病毒成為腸道病毒中最受矚目的成員。 2008年安徽、廣東、浙江等28個(gè)省市受EV71病毒感染嚴(yán)重，超過三萬兒童感染該病，將近50人因該病而死亡，手足口病在2008年5月2日已被中華人民共和國 衛(wèi)生部定為丙類傳染病。
本發(fā)明選擇腸道病毒71型VP1基因設(shè)計(jì)的用于焚光RT-PCR檢測的引物及探 針序列，建立了腸道病毒71型熒光RT-PCR檢測技術(shù)，反應(yīng)結(jié)束即可根據(jù)擴(kuò)增曲 線判定是否有腸道病毒71型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于腸道病毒71型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢 測的引物、探針序列及試劑盒，使得能夠快速簡單地判斷樣品是否有腸道病毒71 型，為手足口病的病原學(xué)診斷提供科學(xué)依據(jù)。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明在分析已報(bào)道腸道病毒71型VP1基因序列的 基礎(chǔ)上，分別設(shè)計(jì)引物及焚光探針。所述的引物由正向引物和反向引物組成，其核 普酸序列如下
正向引物5，-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3，； 反向引物5'-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3'。
本發(fā)明設(shè)計(jì)的探針的核苷酸序列如下 5,-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3',
該探針一端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。其中，報(bào)告熒 光染料可采用下列熒光基團(tuán)中的任意一種Fam 、 Hex 、 Tet 、 Joe 、 Vic 、 FITC 、 Cy3和Cy5 。淬滅熒光染料可釆用下列熒光基團(tuán)中的任意一種Tamra 、 Rox 、 Dabcyl 、 BHQ1和BHQ2 。
根據(jù)TaqMan技術(shù)，在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上添加了 一條標(biāo)記有兩個(gè)熒光染料基團(tuán) 的核苷酸探針，例如將報(bào)告熒光染料標(biāo)記在探針的5'端，淬滅熒光染料標(biāo)記在探針 的3，端，兩者構(gòu)成能量轉(zhuǎn)移結(jié)構(gòu)，即報(bào)告熒光染料所發(fā)射的熒光可被淬滅熒光染料 吸收，當(dāng)二者距離變遠(yuǎn)時(shí)，抑制作用減弱，報(bào)告熒光染料信號(hào)增強(qiáng)。在擴(kuò)增反應(yīng)過 程中，探針同模板上的目的擴(kuò)增片段雜交，由于Taq酶具有5，端到3，端的外切酶活 性，在擴(kuò)增延伸階段將探針切斷，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報(bào)告熒光染料信 號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)對腸道病毒71型的檢測。
本發(fā)明還進(jìn)一步給出了應(yīng)用上述引物和探針檢測腸道病毒71型核酸的方法，該方法是以樣品RNA為摸板，利用上述的正向引物、反向引物以及探針進(jìn)行實(shí) 時(shí)焚光RT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。 具體地說本發(fā)明以RNA為摸板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，即在25 fil反應(yīng) 體系加入2.5^1 10xOne Step RNA PCR Buffer, 2(il dNTP (各2.5mM),上述正向引 物和反向引物(10 |LiM)各1.5jil， 0.5^1上述探針(10 |LiM), 0.5filTaq酶，0.5|al RNase Inhibitor (40 U/pl) , 0.5^1 AMV RJase XL (5 U/|il)， 5^1 RNA , 10.5p 1 RNase Free dH20。
其中，上述反應(yīng)條件可以是42。C反轉(zhuǎn)錄25min, 95。C變性3min,以95。C 10 s， 60°C 1 min(收集熒光信號(hào))擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
當(dāng)然，可以根據(jù)本發(fā)明給出的引物對或者其擴(kuò)增產(chǎn)物序列設(shè)計(jì)其他類型的探 針，以適用不同方法的熒光PCR檢測。
進(jìn)一步，還可以將本發(fā)明的引物、探針以及相關(guān)試劑組裝成試劑盒，以方便使用。
本發(fā)明根據(jù)腸道病毒71型VP1基因序列設(shè)計(jì)了引物及熒光探針，該引物特異 性好，用于熒光PCR檢測的靈敏度高。本發(fā)明檢測方法準(zhǔn)確性高、靈敏度高，其 能夠快速簡單地判斷樣品是否有腸道病毒71型，為手足口病的病原學(xué)診斷及中樞 神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的鑒別診斷提供了科學(xué)依據(jù)。


圖1是實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)腸道病毒71型核酸檢測的特異性實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果
圖2是本發(fā)明檢測方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)的檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面實(shí)施例用于對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。 引物及探針的設(shè)計(jì)和合成
根據(jù)GenBank中EV71 VP1基因序列,利用生物軟件Primer Express V2.0分 別在其保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物和Taqman探針，并通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了 Blast同源性 比對驗(yàn)證。設(shè)計(jì)的《1物序列為
EV71 Pf (正向)5'-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3'針的序列為5'-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3， 該探針的5'端用報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3'端用淬滅熒光染料BHQ1標(biāo)記。 RNA的提取
病毒樣品RNA的抽提用Roche High Pure viral RNAkit試劑盒提取，取0.5克左右 糞便標(biāo)本，力口TE 500|^1制成10-20%的懸液，8000rpm離心5分鐘；取200|^1標(biāo)本上清 加400jil結(jié)合液，混合均勻，加入純化過濾管中，10000rpm, 15s;棄去過濾液，換 一新的收集管，力口入500j^1 inhibitor removal buffer, 1 OOOOrpm離心1分鐘；棄去過濾 液，換一新的收集管，加入450fil洗液，10000rpm離心l分鐘；重洗一次；最后離 心，13000rpm， 10s,棄去殘余的洗液；去掉收集管，換一個(gè)干凈的無RNA的 1.5m正ppendrof離心管，用50fil洗脫液加入過濾管中，10000rpm離心l分鐘，將提取 的RNA移到一個(gè)新的離心管中，于-8(TC保存。 Real-timeRT-PCR擴(kuò)增方法的建立 1 、 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系
以RNA為摸板，進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR反應(yīng)。
熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系如下表
組分25 |il體積終濃度
10xOne Step脂A PCR Buffer2.5lx
dNTP (各2.5mM)20.4 mM
正、反向引物(lOpM)各1.5各0.6pM
探針(10 )iM)0.50.2 (iM
Taq酶0.52.5U
RNase Inhibitor (40 U/|il)0.520 U
AMV RTase XL (5 U/|il)0.52.5U
RNA5
RNase Free dH2010.5
2 、 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)條件
將樣品管放入ABI公司7300熒光PCR儀后，設(shè)置如下條件進(jìn)行反應(yīng)42°C 反轉(zhuǎn)錄25min, 95。C變性3min,以95。C10s, 60°C 1 min(收集焚光信號(hào)FAM)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)結(jié)束采集數(shù)據(jù)。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。 腸道病毒71型核酸Real-time RT-PCR方法的特異性確定
利用建立起的熒光RT-PCR反應(yīng)體系分別對10抹不同的人類病毒進(jìn)行檢測，檢 測結(jié)果如圖l所示，4抹EV71病毒(編號(hào)分別為EV71-SZ98, EV71-SZ01, EV71-SZ03 ， EV71-GZ05)出現(xiàn)相應(yīng)的特異性熒光擴(kuò)增曲線(參見圖中A所指)，呈陽性反應(yīng)。而 其他6林人類病毒(包括3抹滅活的脊髓灰質(zhì)炎病毒Polio I 、 PolioII、 Polioin,兩 抹輪狀病毒、l抹諾如病毒。)則均沒有熒光信號(hào)產(chǎn)生，為一平直的線(參見圖中B 所指)，判為陰性。結(jié)果表明，所設(shè)計(jì)的引物探針只對目的病毒(即，EV71病毒) 特異，與其它檢測對象無交叉反應(yīng)。
試驗(yàn)結(jié)果
以腸道病毒71型的RNA為模板，通過實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測可觀察到明顯的 熒光強(qiáng)度變化，而其他病毒的焚光強(qiáng)度沒有變化。 靈敏度實(shí)驗(yàn)
將EV71體外轉(zhuǎn)錄RNA用DEPC處理的水分別稀釋，進(jìn)行相對靈敏度4企測，在 25fil反應(yīng)體系中，RNA分別被稀釋成5.0x107、 5.0x106、 5.0x105、 5.0x104、 5.0x103、 5.0x102、 5.0xlQi拷貝數(shù),檢測結(jié)果如圖2所示，最低檢測限為50個(gè)模板拷貝。核苷酸序列表
<110> 何雅青
肖性龍
<120>腸道病毒71型核酸檢測用引物、探針及試劑盒 <160> 3
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述引物
<400> 1
agtgatgaga gtatgattga gacacg 26
<210> 2
<211〉 20
<212> DNA
<213〉 人工序列
<223> 人工序列的描述
<400> 2
cccgctctgc tgaagaaact
<210〉 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 <223>人工序列的描述探針
<400> 3
tcgcacagca cagctgagac cactc 25
引物
20
權(quán)利要求
1、一種腸道病毒71型核酸檢測用引物，其特征在于，該引物的核苷酸序列為正向引物5’-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3’；反向引物5’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’。
2、 一種與權(quán)利要求1所述引物配合使用的探針，其特征在于，該探針的核普 酸序列為5，-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3，，該4笨針一端標(biāo)記有報(bào)告 熒光染料，另一端標(biāo)記有淬滅熒光染料。
3、 如權(quán)利要求2所述的探針，其特征在于報(bào)告熒光染料采用FAM熒光基團(tuán)， 標(biāo)記在探針的5，端，淬滅熒光染料采用BHQ1熒光基團(tuán)，標(biāo)記在纟笨針的3，端。
4、 一種檢測腸道病毒71型核酸的方法，該方法以樣品RNA為摸板，利用權(quán) 利要求1的引物以及權(quán)利要求2或3所述的探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，每個(gè) 循環(huán)結(jié)束釆集數(shù)據(jù)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用 25 (il反應(yīng)體系，該反應(yīng)體系的組分如下2.5^1 10xOne Step RNA PCR Buffer , 終濃度為0.4 mM的dNTP ，終濃度為0.6pM的所述正向引物，終濃度為0.6fiM 的所述反向引物，終濃度為0.2 的所述探針，終濃度為2.5U的Taq酶，終 濃度為20 U的RNase Inhibitor ，終濃度為2.5U的AMV RTase XL , 5|il樣品 RNA , 10,5jal RNase Free dH2〇；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)條件如下42t:反轉(zhuǎn)錄25min; 95。C變性3 min;以95°C 10 s， 60°C 1 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。
6、 一種腸道病毒71型核酸檢測用試劑盒，其特征在于含有權(quán)利要求l所述 的正向引物和反向引物。
7、 如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于還包括權(quán)利要求2或3所述的 探針。
全文摘要
本發(fā)明涉及腸道病毒71型核酸檢測用引物、探針及試劑盒，其引物的核苷酸序列為正向引物5’-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3’；反向引物5’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’。其探針的核苷酸序列為5’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’。還提供了檢測腸道病毒71型核酸的方法，該方法以樣品RNA為摸板，利用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后根據(jù)擴(kuò)增曲線判定結(jié)果。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速簡單，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，為手足口病的病原學(xué)診斷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的鑒別診斷提供了科學(xué)依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101676407SQ20081021616
公開日2010年3月24日 申請日期2008年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月18日
發(fā)明者何雅青, 肖性龍 申請人:何雅青;肖性龍