專利名稱：一種實時熒光rt-pcr檢測禽流感病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測禽流感病毒的試劑盒，特別是涉及以一步 法實時熒光RT-PCR反應(yīng)技術(shù)早期、快速診斷禽流感病毒感染的試劑盒。本試劑盒可以檢測 咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的AIV。 本發(fā)明的目的是提供一種使用一步法實時熒光RT-PCR技術(shù)來定性及定量檢測樣 品中AIV的試劑盒，特別是涉及AIV的早期感染在實驗室診斷中的應(yīng)用。其基本原理是利 用一對寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、耐熱 DNA聚合酶(Taq酶)、RNA酶抑制劑(RNasin)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及 Mg2+等RT-PCR反應(yīng)緩沖液中，通過DA7600、 ABI7500等市售的熒光PCR擴增儀實現(xiàn)靶多核 苷酸的循環(huán)擴增，從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。 本發(fā)明所提供的檢測樣品中AIV的試劑盒包括(l)分別裝有RNA提取液(即 TRIZOL核酸抽提試劑)、RT-PCR擴增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和定量參考品并加 蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于 RT-PCR擴增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴增的正向引物AIV-F和反向引物AIV-R的序列分別 是5' -CAAAAGCAGGTAGATGTTTAAAGATGA-3' (SEQ ID NO : 1)和5' -GATTGGTCTTGTCTTTAG CCATTCCAT-3' (SEQ ID NO :2)。 根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，RT-PCR擴增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴增和監(jiān) 測體系的寡核苷酸探針AIV-P的序列是5' -GTTTTCTCTATCGTTCCATCAGGCCCCCTCA-3' (SEQ ID NO :3)。 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中RT-PCR擴增反應(yīng)液由(a)耐熱DNA聚合 酶(Taq酶)、(b)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、(c)RNA酶抑制劑(RNasin) 、 (d)脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs) 、 (e)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，(f)能夠與雙鏈靶多核 苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物，(g)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒 光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針組成。 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于RT-PCR擴增反應(yīng)液中的最佳引物 濃度為0. 44 ii mol/L、探針濃度為0. 22 y mol/L ; 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于RT-PCR擴增反應(yīng)液中的鎂離子最佳濃度為2. 0mmol/L、Taq酶最佳用量為5U/反應(yīng)、RT酶最佳用量為100U/反應(yīng)、RNasin最
佳用量為20U/反應(yīng)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳濃度為0. 24mmol/L。 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于RT-PCR擴增的最佳反應(yīng)溫度和時
間為40。C逆轉(zhuǎn)錄25min ;然后94。C預(yù)變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環(huán)。 根據(jù)本發(fā)明的另 一個優(yōu)選實施方案，其中陰性質(zhì)控品為生理鹽水。 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中陽性質(zhì)控品為含有擴增目標片段的體外
轉(zhuǎn)錄RNA，濃度為1.0X1()2個EID50。 根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中定量參考品為含有擴增目標片段的體外 轉(zhuǎn)錄RNA，包括4個濃度梯度1. OX 106個EID50、1. OX 105個EID50、 1. 0X 104個EID50、 1. 0X1()3個EID50。 本發(fā)明提供的一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測出AIV的最低濃度為 1. OX 101個EID50，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。 本發(fā)明針對AIV基因組保守基因片段設(shè)計特異引物和探針，可檢測出AIV，但不能 檢測出非AIV病原體，如新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、鴨肝炎 病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒等，說明本試劑盒具有很好的特異性。 本發(fā)明提供的實時熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉 或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的AIV;可為靈敏、快速早期診斷AIV感染提供可靠的實 驗證據(jù)；同時由于能準確定量，所以可對療效進行有效監(jiān)測。


圖1顯示線性與靈敏度參考品的檢測結(jié)果圖。針對模板數(shù)為1. OX 101 1. OX 107 個EID50的線性與靈敏度參考品進行實時熒光RT-PCR檢測分析，檢測結(jié)果表明，當病毒量 為1.0X1(^個EID50時，檢測樣品的Ct值在35左右，即檢測靈敏度可到達1.0Xl(^個 EID50。 圖2顯示定量參考品擴增結(jié)果的標準曲線圖。針對模板數(shù)為1.0X103 1.0X106 個EID50的定量參考品進行實時熒光RT-PCR檢測分析，繪制得到的標準曲線斜率(Slope) 為-4.6563，在Y軸截距(Interc印t)為50. 1330，相關(guān)系數(shù)的平方(R2) = 0.9986。
圖3顯示10個陽性參考品的檢測結(jié)果圖。10個陽性參考品的熒光擴增曲線有明顯 指數(shù)增長期，并與設(shè)定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值分別為16. 95、19. 60、 20. 08、21. 51、22. 46、25. 37、26. 40、26. 75、27. 09、28. 14，可明確判定為陽性。IO個陽性參考 品分別為AIV-H1、 AIV-H3、 AIV-H4、 AIV-H5、 AIV-H7、 AIV-H9、 AIV-Hll、 AIV-H13、 AIV-H14、 AIV-H15。 圖4顯示10個陰性參考品的檢測結(jié)果圖。10個陰性參考品的擴增曲線平直或斜 向下且與閾值線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。10個陰性參考品分別為與AIV感 染有相似癥狀的6種病毒樣品(新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、 鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒)以及4份正常禽類的咽喉拭子和泄殖腔拭子樣品。
圖5顯示6個臨床陽性標本的擴增曲線。6個標本的Ct值分別是20. 20、21. 23、 22. 44、28. 75、29. 40、31. 85，結(jié)合擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，均能夠判定為陽性。
具體實施例方式
下列實施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。 實施例1 :禽流感病毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑的研制 1、引物和探針的設(shè)計通過對Genbank數(shù)據(jù)庫已有的AIV核酸序列以及國內(nèi)外已
發(fā)表文獻中報導的核酸序列進行序列比對分析，以AIV基因組的基質(zhì)蛋白編碼基因(M基
因)的保守片段為擴增靶位點，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設(shè)計的
基本原則，利用軟件，人工設(shè)計多對引物和探針。 2、樣本的選擇根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻報道表明，可以選擇咽喉拭子、泄殖腔拭子、 肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品。
3、反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 樣品的準備以病毒培養(yǎng)鑒定為陽性的IO份AIV樣品作為陽性參考品，分別為 AIV-H1 、 AIV-H3 、 AIV-H4、 AIV—H5 、 AIV—H7 、 AIV—H9 、 AIV—H11 、 AIV—H13 、 AIV—H14、 AIV—H15 ;以 病毒培養(yǎng)鑒定為陰性的10份非AIV樣品作為陰性參考品，分別為6種病毒樣品(新城疫病 毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒)以及 4份正常禽類的咽喉拭子和泄殖腔拭子樣品。分別用TRIZOL提取上述陽性參考品與陰性參 考品的RNA，待用。 引物探針的篩選以上述1中設(shè)計的多組引物探針分別檢測上述的陽性參考品 與陰性參考品的RNA，經(jīng)反復試驗，篩選出特異性、靈敏度和重復性好的最佳引物探針組合 (如序列表中SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :3)。 引物探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 0. 20 ii mol/L至0. 5 ii mol/L濃度梯度的引物和從0. 10 y mol/L至0. 5 y mol/L濃度梯度的 探針進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的引物濃度為0. 44 ii mol/L、探針濃度 為0. 22iimol/L。 Taq酶用量的優(yōu)化在25 y L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 1U(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復試驗，最終確定 最佳的Taq酶用量為5U/反應(yīng)。 RT酶用量的優(yōu)化在25iiL反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 50U(酶單位)至400U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復試驗，最終確定 最佳的RT酶用量為100U/反應(yīng)。 RNasin用量的優(yōu)化在25y L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復試驗，最終確定 最佳的RNasin用量為20U/反應(yīng)。 dNTPs濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmo1/ L至0. 25mmol/L濃度梯度的dNTPs進行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的 d證s濃度為0. 24,1/L。 反應(yīng)溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和寡多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時 間進行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復試驗，最終確定最佳的反應(yīng)溫度和時間為4(TC逆轉(zhuǎn)錄25min ; 然后94。C預(yù)變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環(huán)。 4、靈敏度實驗將濃度為1. 0 X 108個EID50的滅活A(yù)IV-H5培養(yǎng)上清，10倍梯度稀釋成1. 0X1()7個EID50、1. 0X1()6個EID50、1. 0X1()5個EID50、1. 0X1()4個EID50、1. 0X103 個EID50、 1. OX 102個EID50、 1. OX 101個EID50作為線性與靈敏度參考品，進行實時熒光 RT-PCR檢測分析，當病毒量為1. 0X 101個EID50時，檢測樣品的Ct值在35左右，即檢測靈 敏度可到達1.0X1(^個EID50(如附圖1所示)。 5、標本檢測以咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等作為待檢 標本，分別用TRIZOL提取標本的RNA后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴增體系檢測，結(jié)果表明 本試劑盒可以很靈敏的檢測出臨床標本中的AIV。 實施例2 :禽流感病毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒及其使用 1、制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50m1/管)1管、RT-PCR擴增反應(yīng)
液(20iU/管)24管、陰性質(zhì)控品aooia/管)i管、陽性質(zhì)控品aooia/管)i管、定量
參考品(50iU/管)4管。 2、標本采集、運送和保存 2. 1適用樣本類型咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等。
2. 2樣品采集與前處理(注意無菌操作) 2. 2. 1活禽樣品——取咽喉拭子、泄殖腔拭子或新鮮糞便拭子，具體采集方法如 下 1)咽喉拭子采取時要將拭子深入喉頭及上腭裂來回刮3 5次，取咽喉分泌液；
2)泄殖腔拭子將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；對于易造成損傷的小珍禽， 直接用拭子沾取適量新鮮糞便； 3)將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1. Oml PBS的離心管中，編號備用。
2. 2. 2內(nèi)臟或肌肉樣品——用無菌鑷剪夾取待檢樣品2. Og于研缽中充分研磨，再 加10mlPBS混勻，或置于組織勻漿器中，加入10ml PBS勻漿，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無菌離心 管中3，000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中，編號備用。 2. 2. 3血清或血漿——用無菌注射器直接吸取(不少于400iU)至無菌離心管中， 編號備用。 2. 3保存與運送采集或處理的樣本在2 8t:條件下保存應(yīng)不超過24h ;若需長 期保存，須放置-7(TC冰箱，但應(yīng)避免反復凍融(最多凍融3次)。采集的樣品密封后，采用 保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運送到實驗室。
3、檢測步驟
(l)RNA提取 A.取N個(N = 1管陰性質(zhì)控品+待測樣本數(shù))滅菌的1. 5ml離心管，作好標記。 B.每管分別加入600 ii 1 Trizol試劑，然后分別加入200 y 1的陰性質(zhì)控品或待測
樣品上清液(充分混勻后吸取)，充分振蕩混勻15s，室溫靜置3 5分鐘； C.每管加入200 ii 1氯仿，上下顛倒混勻10秒后，12， OOOrpm離心4分鐘; D.小心吸取無色上層液體(注意不可觸及中間絮狀層)，轉(zhuǎn)移至新滅菌的1. 5ml
離心管，然后加入lOiU RNA提取液A(充分混勻后吸取)，充分吸打混勻，8，000rpm離心1
分鐘后，小心棄去所有液體；E.加入溶液C (確認已加入無水乙醇)800 iil，充分吸打混勻，8， OOOrpm離心1分
鐘，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)；
F.將離心管敞開蓋，擺在通風櫥中風干15分鐘(也可使用開放式加熱器于60°C 干燥5分鐘，需防止樣本交叉污染)，然后加入30 1 DEPC H20，吸打混勻管中沉淀，得到白 色的懸濁液，可直接用于檢測，也可存于-7(TC待用。
(2) RT-PCR反應(yīng)與結(jié)果分析 分別取陰性質(zhì)控品、標本、陽性質(zhì)控品、定量參考品各5iU，加入PCR反應(yīng)管中 進行RT-PCR擴增。RT-PCR循環(huán)條件是40。C逆轉(zhuǎn)錄25min ;然后94。C預(yù)變性3min ;最后 93°C 15s，55。C 45s，40個循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)RT-PCR擴增結(jié)果所得到的曲線圖調(diào)節(jié)分析 參數(shù)，使標準曲線(Std curve)窗口下的定量參考品標準曲線達到最佳(即相關(guān)系數(shù)的平 方(R2) > 0. 97)(參見附圖2所示)。由附圖3可以看出，10個陽性參考品的熒光擴增曲線 有明顯指數(shù)增長期，并與設(shè)定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值分別為16. 95、 19. 60、20. 08、21. 51、22. 46、25. 37、26. 40、26. 75、27. 09、28. 14 ;在附圖4中，由于IO個陰性 參考品的擴增曲線平直或斜向下且與閾值線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。最后 由儀器自動分析計算出未知標本的測定數(shù)值。 實施例3 :應(yīng)用禽流感病毒一步法實時熒光RT-PCR檢測試劑盒定量檢測臨床樣品
所有實驗過程在哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室完成，臨床樣品由哈爾 濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室提供，包括咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本等 樣品類型；標本RNA提取、RT-PCR反應(yīng)與結(jié)果分析參照實施例2進行。
RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴增曲線先調(diào)節(jié)分析參數(shù)，使標準曲線(Std curve)窗 口下的定量參考品標準曲線達到最佳(即相關(guān)系數(shù)的平方(R2) >0.97)，然后分析臨床樣 品。臨床樣品的檢測結(jié)果如附圖5所示6個臨床陽性標本擴增曲線的Ct值分別是20. 20、 21.23、22. 44、28. 75、29. 40、31. 85，結(jié)合擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，均能夠判定為陽性； 參照同一次試驗中定量參考品的標準曲線圖(如附圖2所示)可以判定6個臨床陽性標本 的AIV濃度分別為6. 08X1()6個EID50、3. 58X 106個EID50、 1. 92X 106個EID50、7. 38X104 個EID50、5. 30X1()4個EID50、1. 50X 104個EID50。序列表〈110〉中山大學達安基因股份有限公司〈120〉 一種實時熒光RT-PCR檢測禽流感病毒的試劑盒〈140〉〈141〉〈160>3〈210>1〈211>27〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物?！?00>1
〈210>2 〈211>27 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的引物。 〈400>2 gattggtcttgtctttagccattccat 〈210>3 〈211>31 〈212>DNA <213>人工序列 〈220〉 〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計，以用作PCR擴增的探針。 〈400>3 gttttctctatcgttccatcaggccccctca
權(quán)利要求
一種檢測樣品中禽流感病毒存在的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液、RT-PCR擴增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和定量參考品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中RT-PCR擴增反應(yīng)液包括耐熱DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，兩末端分別結(jié)合有熒光報告基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針，其特征在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴增的正向和反向引物的序列分別為正向引物AIV-F5’-CAAAAGCAGGTAGATGTTTAAAGATGA-3’；反向引物AIV-R5’-GATTGGTCTTGTCTTTAGCCATTCCAT-3’。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中所使用的寡核苷酸探 針AIV-P的序列為5' -GTTTTCTCTATCGTTCCATCAGGCCCCCTCA-3，。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中正向引物濃度為 0. 44 ii mol/L、反向引物濃度為0. 44 y mol/L、寡核苷酸探針濃度為0. 22 y mol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中耐熱DNA聚合酶的濃 度為5U/反應(yīng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為 100U/反應(yīng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中RNA酶抑制劑的濃度 為20U/反應(yīng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴增反應(yīng)液中脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs)的濃度為0. 24mmol/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于用于RT-PCR擴增的反應(yīng)溫度和時間為 40。C逆轉(zhuǎn)錄25min ;然后94。C預(yù)變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個循環(huán)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于所檢測的樣品可選自但不局限于咽喉拭 子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實時熒光RT-PCR檢測試劑盒，特別是涉及以一步法實時熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)早期、快速診斷禽流感病毒感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實現(xiàn)對咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的禽流感病毒的快速早期檢測和定量分析。
文檔編號C12Q1/68GK101736089SQ200810218938
公開日2010年6月16日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者何蘊韶, 李明, 李 杰, 王秋泉, 程鋼, 胡守旺, 鄧中平, 高秀潔 申請人:中山大學達安基因股份有限公司