專利名稱：：一種檢測(cè)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的染色體數(shù)目異常的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及包括核酸的檢測(cè)試劑。
背景技術(shù)：
：自然流產(chǎn)是婦產(chǎn)科的一種常見病，其發(fā)生率約占臨床妊娠的1020%,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，直接針對(duì)流產(chǎn)絨毛進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)觀察(核型分析)，在〈15孕周的自然流產(chǎn)中，染色體異常的發(fā)生率超過(guò)50%(5070%)。在自然流產(chǎn)胚胎中，非整倍體主要表現(xiàn)為三體型及性染色體的單體型(常染色體單體型因具有高度的致死性而極其罕見)，異常染色體核型多為16三體、21三體、18三體、13三體、15三體以及X單體型。目前國(guó)際上己報(bào)道的用于自然流產(chǎn)胚胎遺傳學(xué)檢測(cè)的方法包括核型分析(G顯帶法)、FISH(fluorescencein-situhybridization,熒光原位雜交)、CGH(comparativegenomichybridization,比較基因組雜交)、MLPA(nmlUplexligation-d印endentprobeamplification,多重酶聯(lián)依賴性探針擴(kuò)增)、互補(bǔ)腿(complementaryDNAs,cDNA)微陣列、QF-PCR(quantitativefluorescent—polymerasechainreaction,定量焚光RCR)六禾中。核型分析屬于傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法，優(yōu)點(diǎn)是直觀、全面，可對(duì)每一號(hào)染色體的數(shù)目異?；虼蟮慕Y(jié)構(gòu)異常(〉5Mb)作出判斷，是目前國(guó)際上通用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。但該方法若用于檢查自然流產(chǎn)胚胎(絨毛)，最大的缺陷是無(wú)法區(qū)分母源性的污染，而且因?yàn)樾枰M(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)而對(duì)標(biāo)本要求高，失敗率高(按AmericanCollegeofMedicalGenetics的標(biāo)準(zhǔn)為10~40%)。同時(shí)，由于絨毛細(xì)胞培養(yǎng)不僅耗時(shí)(需23周)而且染色體形態(tài)較差，因而其結(jié)果的觀察和判斷比較依賴于技術(shù)人員的專業(yè)水準(zhǔn)和責(zé)任心。鑒于上述缺陷，目前國(guó)內(nèi)外最為常規(guī)的檢査項(xiàng)目并不是直接進(jìn)行流產(chǎn)胚胎的染色體檢査，而是進(jìn)行夫婦雙方外周血染色體的核型分析(G顯帶法)。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，外周血染色體核型分析只能為2.狄5.0%的自然流產(chǎn)患者找到病因，其低檢出率的原閑在于該檢査一般只對(duì)染色體結(jié)構(gòu)畸變的自然流產(chǎn)具有臨床意義，因?yàn)榇蠖鄶?shù)由染色體結(jié)構(gòu)崎變?cè)斐傻淖匀涣鳟a(chǎn)，其畸變?nèi)旧w是來(lái)源于攜帶染色體平衡易位的雙親之一；而對(duì)于占絕大多數(shù)的以非整倍體為主的染色體數(shù)目異常的自然流產(chǎn)而言，其診斷意義甚微，因?yàn)楫a(chǎn)生這種流產(chǎn)胚胎的雙親的外周血染色體一般均為正常。FISH技術(shù)出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代，其原理是利用炎光標(biāo)記的探針(單鏈DNA分子)與染色體上互補(bǔ)的靶序列進(jìn)行雜交，經(jīng)熒光顯微鏡在雜交位點(diǎn)觀察所要檢測(cè)的染色體區(qū)段。FISH可用于染色體數(shù)目異常與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)，對(duì)染色體異常的檢出率約為核型分析的83%，比較快捷(需23天)，但其同樣無(wú)法區(qū)分母源性的污染，而且價(jià)格高昂(單一探針的價(jià)格就高達(dá)1000元左右)，限制了其廣泛運(yùn)用。CGH始于20世紀(jì)90年代，是一種在FISH技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法。待測(cè)樣本經(jīng)過(guò)一次染色體原位雜交即可在全部染色體或特定的染色體區(qū)域?qū)Σ煌蚪M間DNA序列的拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。CGH所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間約為l周，該檢測(cè)方法需要特殊的分析軟件并且價(jià)格尤其昂貴，難以在臨床上開展。另外，CGH不僅無(wú)法區(qū)分母源性的污染，而且無(wú)法檢出整倍體及低比例的嵌合體，只適于非整倍體及不平衡易位的檢測(cè)。由于在自然流產(chǎn)中多倍體及嵌合體較為常見，因此CGH只能作為核型分析的輔助實(shí)驗(yàn)，即CGH結(jié)果正常的樣本仍需進(jìn)行核型分析。MLPA是一種最近幾年新發(fā)展起來(lái)的基因分子雜交和PCR合為一體的基因劑量測(cè)定技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是不僅能檢測(cè)缺失,也能檢測(cè)基因拷貝數(shù)，可用于定性和半定量檢測(cè)。其缺點(diǎn)是費(fèi)用高昂，要求合成特異的探針，而且不易區(qū)分母源性污染。cDNA微陣列則是通過(guò)PCR擴(kuò)增c咖A文庫(kù)中的已知基因片斷，與不同熒光標(biāo)記的對(duì)照樣品m咖A逆轉(zhuǎn)錄的cDNA片段同時(shí)雜交，對(duì)比不同標(biāo)記雜交信號(hào)的變化來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)水平的變化。其優(yōu)點(diǎn)是能高分辨地檢測(cè)染色體區(qū)段或基因的缺失或重復(fù)并可同時(shí)檢測(cè)許多目標(biāo)序列，但缺點(diǎn)是需要已知的DNA片段和昂貴的設(shè)備，目前尚不適用于臨床。QF-PCR是在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)可與DNA模板發(fā)生特異性雜交的熒光標(biāo)記探針。當(dāng)探針保持完整時(shí)，3'端的淬滅基團(tuán)抑制5'端的發(fā)射基團(tuán)的熒光發(fā)射。在PCR退火過(guò)程中，淬滅基團(tuán)解除而檢測(cè)到發(fā)射基團(tuán)發(fā)出的熒光，而且釋放的熒光基團(tuán)數(shù)和PCR產(chǎn)物量呈一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。從理論上說(shuō)，通過(guò)QF-PCR比較流產(chǎn)夫婦及胚胎的STR(shorttandemr印eat,短串聯(lián)重復(fù))的異同可用于區(qū)分母源性的污染，并診斷非整倍體、二倍體、嵌合體及單親二體。這是由于在人類基因組中，STR總數(shù)大約有510萬(wàn)個(gè)而且分布廣泛，在不同個(gè)體或不同染色體中串聯(lián)的重復(fù)序列拷貝數(shù)相差懸殊，導(dǎo)致其形成高度的遺傳多態(tài)性。除了部分同卵雙生子，個(gè)體之間的STO都是互不相同的。由于高度的多態(tài)性并且能夠穩(wěn)定地遺傳，STR成為一類有用的DNA遺傳標(biāo)志。DanDiego-Alvarez等選擇了13,15,16,18,21,22和X染色體上的2—4個(gè)STR迸行QF-PCR擴(kuò)增，然后用ABI3100遺傳分析儀對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而獲得診斷結(jié)果，該方法的診斷率為94%ApplicationofquantitativefluorescentPCRwithshorttandemrepeatmarkerstothestudyofaneuploidiesinspontaneousmiscarriages.HumReprod.2005May;20(5):1235-43。GangZou等選擇了13、14、15、16、18、21、22和X染色體上共19個(gè)STR位點(diǎn)進(jìn)行QF-PCR擴(kuò)增，然后用MegaBACE1000對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而獲得診斷結(jié)果，該方法的診斷率為98.3。/。(Quantitativefluorescentpolymerasechainreactiontodetectchromosomalanomaliesinspontaneousabortion.IntJGynaecolObstet.2008Sep22.)。上述QF-PCR方法均能對(duì)染色體非整倍體、三倍體、單親二倍體進(jìn)行診斷，并鑒別母源性污染，但是該方法受探針限制較大，熒光探針的好壞直接影響結(jié)果，比普通PCR受影響因素多，直接影響了該方法的準(zhǔn)確率；另外，該方法需要用到的熒光探針比較昂貴，直接限制了該方法在臨床上的應(yīng)用，而且其結(jié)果需要特殊分析軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行處理后才能判讀，不適合大范圍推廣。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種成本低、檢測(cè)范圍廣并能區(qū)分母源性污染的檢測(cè)6然流產(chǎn)常見染色體數(shù)目異常的試劑盒。本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案是一種檢測(cè)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的染色體數(shù)目異常的試劑盒，該試劑盒是一種多重PCR試劑盒，其特征在于包括以下第17組用于檢測(cè)不同STR位點(diǎn)的多重PCR引物，所述的17組引物如下所示第l組STR位點(diǎn)引物序列D2S1242CCAGCAGGATTTCTTTCTGAACA(SEQNO.1)和TGCCCTCCAGCTTTAGTGACATA(SKJNO.2)D21S11AGTCAATTCCCCAAGTGAATTGC(SEQNO.3)和TTCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGTA(SEQNO.4)D21S1270GAGATGGCCTGTGTCTATCCCAC(SEQNO.5)和GCCAATCCTTCGTGATAMTCACTC(SEQNO.6)D21S1411CGGATAGAAAAATAGGATGGATMA(SEQNO.7)和CAGCCTTCTAAATATTCATCCTGTTT(SEQNO.8)第2組STK位點(diǎn)引物序列"~D13S317GGACTCTGACCCATCTAACGCCTATC(SEQNO.9)和CCATAGGCAGCCCAMAAGACAGA(SEQNO.10)D18S535TGACAMAGCCACACCCATAACT和(SEQNO.11)ATGGTAGCCTGGCAGGCTAAGAG(SEQNO.12)D13S258CACGGAGTCATTCTTAAAATAGACAGA(SEQNO.13)和AAGACAGAGAGAGGGAATAAACCA(SEQNO.14)D18S382ATCCATCCATCCTTCCACAGATACAT(SEQNO.15)和CACCATGCCCAGGCTTTTTC(SEQNO.16)第3組STR位點(diǎn)引物序列D22S417ACGGCMGACCCTGTTTTGAGA(SEQNO.17)和TCCAACMGCCAGCTTTTTACC(SEQNO.18)D15S189TGCAGCGAGACTCTGCCMAAAAG(SEQNO.19)和AGGATCCCCATCTTTCCCCTTTC(SEQNO.20)D16S746CCAAAGCTTATCGGTGAGGGTCT(SEQNO.21)和CCTGGGTGACAAGAATGAAACCAGAA(SEQNO.22)D16S675GCGATATTGGCTGAGGCACATTCT(SEQNO.23)和GCCTTCCTGCCTTCCTTCCTGAC(SEQNO.24)D15S523TGCCAGCACTTGGTGMCACTATG(SEQNO.25)和GGCCAGCATCTGGGTMCATAGG(SEQNO.26)第4組STK位點(diǎn)引物序列^D20S438TGAGACTTGATGGGAGTATCCAGAGAG(SEQNO.27)和TGCACCACTGTACTCCAGCATGAATTA(SEQNO.28)DXS8377GCCCCAGCCTACATCTACCAC(SEQNO.29)和TGCTCCTTCGTTCCCTGTCTTCT(SEQNO.30)D2S1244GGATTACAGGCATGAGCCACTACAG(SEQNO.31)和TTCCMGAGGTGGGGMAAAAAG(SEQNO.32)第5組STR位點(diǎn)引物序列DXS6804TTTCCCAGATATTTTGACCACCATA(SEQNO.33)和CCCGTGGCATGTGGTTGCTATA(SEQNO.34)DXS6809TTGCTTTAGGCTGATGTGAGGAAGA(SEQNO.35)和AGCTCAGGAATACTGAGGGCATGAC(SEQNO.36)DYS389GATAGATTGATAGAGGGAGGGATA(SEQNO.37)和TCTACCTMTCTGTCAATGATTTTCTGT(SEQNO.38)第6組STR位點(diǎn)引物序列D15S195GGGATCACGAGAGAAGCAAAATTAA(SEQNO.39)和TCACATGGGCTAATTCCCGTA(SEQNO.40)D2IS1414TCCCCAAGTGAATTGCCTTCTATCTAT(SEQNO.41)和TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGTAG(SEQNO.42)D20S431TCCAGCCTGAGTGACAGAGTGATACCA(SEQNO.43)和GGGGATATTTGGGACTCCTTGACAG(SEQNO.44)D2S1239ACCAGGTGGCCTGCATCATGCT(SEQNO.45)和GGCGACAGAGCAAGACTCCATCA(SEQNO.46)_第7組STR位點(diǎn)引物序列D22S343AAGGCCGAGTGGGAGTATTT(SEQNO.47)和TCTCCCCCACTTGCTGAA(SEQNO.48)D22S689ATCTAGGACATCTCAGGAGCTATCTAA(SEQNO.49)和CMAGTGAGACCCCATCTCAATC(SEQNO.50)D15S184CAGCCTTGTTGCTCACGCAAAGC(SEQNO.51)和CCTGGGTGACAGAGTGAGACTGTCAA(SEQNO.52)本發(fā)明試劑盒的7組引物中的每一組引物分別對(duì)自然流產(chǎn)胚胎及其父親和母親的STR進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，然后在非變性溫度條件下用變性高效液相色譜(DHPLC)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，所得的DHPLC圖譜可反映每個(gè)STR位點(diǎn)的擴(kuò)增情況，由此判斷自然流產(chǎn)是否為染色體數(shù)目異常造成；其中各組引物的多重PCR擴(kuò)增分別條件為第1組引物的擴(kuò)增條件94。C3min,94。C30s，60。C50s,72'C30s，72'C3min，4'C保存，一共25個(gè)循環(huán)；第2組引物的擴(kuò)增條件94。C3min,94'C30s，60。C50s,72'C30s，72。C3min,4'C保存,一共25個(gè)循環(huán)；第3組引物的擴(kuò)增條件94'C3min，94。C30s,62。C50s，72'C30s,72'C3min，4'C保存，一共25個(gè)循環(huán)；第4組引物的擴(kuò)增條件94。C3min，94。C30s，64'C50s，72。C30s,72'C3min,4'C保存,一共25個(gè)循環(huán)；第5組引物的擴(kuò)增條件94。C3min,94。C30s,64。C50s,72。C30s,72。C3min，4'C保存，一共25個(gè)循環(huán)；第6組引物的擴(kuò)增條件94'C3min，94。C30s，62。C50s,72。C30s'72。C3min，4t:保存，一共25個(gè)循環(huán)；第7組引物的擴(kuò)增條件94。C3min,94。C30s,64。C50s,72'C30s,72。C3min，4'C保存，一共25個(gè)循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物的DHPLC圖譜的分析方法如下首先，根據(jù)圖譜上峰的遷移時(shí)間確定其所屬由于本發(fā)明試劑盒中每一對(duì)引物對(duì)應(yīng)一個(gè)STR位點(diǎn)，所得擴(kuò)增片段大小都不一樣(如表l所示)，每對(duì)引物的PCR產(chǎn)物在進(jìn)行DHPLC檢測(cè)時(shí)的遷移速度都不一樣，且片段大小和遷移速度成正相關(guān)，在DHPLC圖譜中表現(xiàn)為小片段的峰出現(xiàn)較快，大片段的峰出現(xiàn)較慢，因此可從PCR產(chǎn)物的遷移時(shí)間對(duì)其進(jìn)行定性分析，即確定DHPLC圖譜中每一個(gè)峰所對(duì)應(yīng)的STR位點(diǎn)。表l引物組別STR位點(diǎn)PCR產(chǎn)物大小(bp)PCR產(chǎn)物序列D2S1242171SEQNO.53第l組D21S11202SEQNO.54D21S1270274SEQNO.55D21S1411314SEQNO.56第2組D13S317136SEQNO.57D18S535183SEQNO,58D13S258211SEQNO.59<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>接著，通過(guò)分析每個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物判斷流產(chǎn)是否由染色體異常造成。自然流產(chǎn)胚胎每個(gè)STR位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)DHPLC檢測(cè)后在DHPLC圖譜有可能表現(xiàn)為以下幾種情況(1)若胚胎某一STR位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為峰高或面積比為接近1:1的雙峰，說(shuō)明該STR位點(diǎn)為雜合子，如果雙峰的位置分別與父母雙方的重合，則所在的染色體為正常；如果雙峰的峰型和位置僅與雙親中的一方吻合，但其他染色體STR位點(diǎn)的雜合峰的位置分別與雙親重合，則可判斷為單親二倍體；(2)若胚胎某一STR位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)為峰高或面積比為接近1:1:1的三峰或2:1的雙峰，說(shuō)明該STR位點(diǎn)為雜合子，所在的染色體為三體；胚胎的2:1雜合雙峰或1:1:1雜合三峰中必然有一部分與父親的位置重合，另一部分與母親的重合，若胚胎的2:1雜合雙峰中的二倍峰或雜合三峰中的兩個(gè)峰的位置與母親(或父親)重合，則該異常染色體為母源性(或父源性)；(3)若胚胎所有染色體上STR位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物均表現(xiàn)為1:1:1或者比例約為2:1的雜合峰時(shí)，則該胚胎標(biāo)本為三倍體；(4)若胚胎所有的染色體上的STR位點(diǎn)的峰型以及出鋒位置完全和母親的重合且為女性，則所檢測(cè)的"絨毛標(biāo)本"不屬于胚胎及其附屬物，而為母體組織，即母源性污染(5)若胚胎某一STR位點(diǎn)為單峰說(shuō)明該STR位點(diǎn)為純合子，無(wú)法判斷所在染色體是否正常。本發(fā)明根據(jù)STR在不同個(gè)體或不同染色體中串聯(lián)的重復(fù)序列拷貝數(shù)不同而形成高度的遺傳多態(tài)性這一特性，設(shè)計(jì)了一系列針對(duì)2號(hào)、13號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、18號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、22號(hào)、X和Y染色體中STR位點(diǎn)的引物，通過(guò)分析其擴(kuò)增產(chǎn)物可以判讀出非整倍體，三倍體，單親二倍體以及區(qū)分母源性污染(但本發(fā)明試劑盒不能檢測(cè)出四倍體以及平衡易位)，并可通過(guò)家系分析幫助患者査明染色體異常的來(lái)源。但是，當(dāng)所檢測(cè)的STR位點(diǎn)為純合峰時(shí)，本發(fā)明試劑盒無(wú)法判斷其所在染色體數(shù)目是否正常，為此，本發(fā)明試劑盒針對(duì)每個(gè)染色體都設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，用以擴(kuò)增同一染色體上不同的STR位點(diǎn)，同一染色體上的多個(gè)位點(diǎn)都為純合子的概率很低，這樣大大提高了本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確率。盡管同一染色體上的多個(gè)位點(diǎn)都為純合子的概率很低，但仍有這樣的可能，為了進(jìn)一步確保本發(fā)明試劑盒的準(zhǔn)確率，本發(fā)明試劑盒還可以含有以下第89組引物中的一組或兩組-第8組ST晚點(diǎn)引物序列W8S1002TACCCCAGGGCAAGACAGAC(SEQNO.79)和ACCACAGGCCTCCTTTCTCTTC(SEQN0.80)D16S475CACTGCAGCAGGGGTTGACAGAG(SEQNO.81)和GGCCAGAAACTACTGGCAGGAAC(SEQNO.82)D13S634GGCAGATTCMTAGGATMATAGACAGA(SEQNO.83)和GCCAATTCCCCTATTTAGTCATCT(SEQNO.84)第9組STR位點(diǎn)引物序列D16S526GGAGGTGCCTTTATGGACCGTAGGT(SEQNO-85)和GCAGCGTGGGCAACAAGGAG(SEQNO.86)D13S631GGGCAACAAGAGCAAAACTCTG(SEQNO.87)和GGCCTCACCATGATTGGATCAC(SEQNO.88〉D18S386AGGAAGGAGMAGAGAGAGCGAGAG(SEQNO,89)和GGTAGAATCTACGCACCCTCTGATTT(SEQNO.90)使用本發(fā)明試劑盒中第17組引物檢測(cè)自然流產(chǎn)胚胎，如果測(cè)出某一染色體上的幾個(gè)STR位點(diǎn)均為純合子，可從第89組中挑選一組或多組有檢測(cè)該染色體STI位點(diǎn)的引物再作檢測(cè)，除各組引物的擴(kuò)增條件不同外，其檢測(cè)步驟和判讀方法均與第17組引物相同；第89組引物的擴(kuò)增條件如下第8組引物的擴(kuò)增條件94。C3min,94'C30s,62°C50s,72°C30s,72°C3min,4'C保存，一共25個(gè)循環(huán);第9組引物的擴(kuò)增條件94。C3rain,94'C30s，67。C50s,72t;30s，72'C3min,4'C保存，共25個(gè)循環(huán)；第89組引物的擴(kuò)增產(chǎn)物及其大小如表2所示表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明試劑盒中的引物均可按照常規(guī)的寡核苷酸合成方法制備。本發(fā)明試劑盒可以為臨床提供10種(2號(hào)、13號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、18號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、22號(hào)、X和Y染色體)染色體的數(shù)目異常的分子檢測(cè)和來(lái)源判斷，檢測(cè)范圍覆蓋了自然流產(chǎn)以及產(chǎn)前診斷中常見的異常染色體類型，診斷率可達(dá)83-98%。本試劑盒所對(duì)應(yīng)的核心技術(shù)--DHPLC技術(shù)對(duì)檢測(cè)樣本的要求低(僅需100l50mg，且可以是陳舊性的胚胎樣本)，靈敏度高，并依靠自動(dòng)化操作的分析儀完成，可進(jìn)行完備的質(zhì)控，能極大地避免人工操作所帶來(lái)的人為出入。通過(guò)家系分析還可以有效鑒別母源性污染減少因母源性污染所造成的誤診。同時(shí)，本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)成本僅為8元/檢測(cè)位點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有的分析技術(shù)。另外，該技術(shù)還具有高通量的特點(diǎn)，每天可完成80個(gè)次的檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒可用于査找自然流產(chǎn)的病因，為患者提供有針對(duì)性的生育指導(dǎo)；還可用于輔助核型分析，提高產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確率。圖1為例1的流產(chǎn)絨毛核型分析結(jié)果。圖2為例1的第1組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖3為例2的流產(chǎn)絨毛核型分析結(jié)果。圖4為例2的第1組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖5為例2的第2組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖6為例2的第3組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖7是例2的第4組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖8是例2的第5組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖9是例2的第6組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖圖10為例2的第7組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖U為例2的第8組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。圖2為例2的第9組引物PCR產(chǎn)物的DHPLC譜圖。具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明試劑盒的使用方法和技術(shù)效果，下面將通過(guò)具體的病例分析和臨床統(tǒng)計(jì)來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述。例l2號(hào)染色體數(shù)目異常病例1、實(shí)驗(yàn)材料-(1)此例標(biāo)本來(lái)自于孕婦孕IO周時(shí)B超提示胚胎停止發(fā)育(無(wú)心管搏動(dòng)、不能見到胎芽等)后行清宮術(shù)時(shí)所收集的絨毛標(biāo)本，同時(shí)采集流產(chǎn)夫婦雙方靜脈血。(2)本發(fā)明試劑盒，其組成如下引物本發(fā)明所述第l-7組引物，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。酶選用的是北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司的Taq酶。試劑北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司的10Xbuffer(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2S04，2raMMgCl2，0,1%TritonX-100禾nlOmMKCl，pH8,8);TAKARA公司dNTP(各2.5mM)。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)核型分析無(wú)菌取出絨毛組織15~20mg，經(jīng)過(guò)粗剪，細(xì)剪，消化后加入培養(yǎng)基接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37°C,5°/。C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)5-10天。提取細(xì)胞中的染色體，并經(jīng)低滲、預(yù)固定、兩次固定后制作成玻片，待烤干后進(jìn)行常規(guī)的G顯帶。(2)本發(fā)明試劑盒分析a.采用本發(fā)明試劑盒第l-7組引物對(duì)父親、母親和胎兒DNA樣本分別進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，每組引物相應(yīng)的反應(yīng)體系如表3所示。第1組PCR反應(yīng)第2組引物(10pmol/ul):d2sl242:lul，d21sll:3ul，d21sl270:lul,d21sl411:6ul，其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第2組PCR反應(yīng)第2組引物(10pmol/ul):dl3s317:3ul，dl8s535:0.75ul，dl3s258:lul，dl8s382:3ul:其余試劑見表3,總反應(yīng)體積35ul。第3組PCR反應(yīng)第3組引物(10pmol/ul):d22S417:0.75ul，dl5sl89:0.5ul，dl6s746:3u1,dl6s675:2ul，dl5s523:3ul:其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第4組PCR反應(yīng)第4組引物(10pmol/ul):d20s438:lul，dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第4組PCR反應(yīng)第4組引物(10pmol/ul):d20s438:lul'dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第5組PCR反應(yīng)第5組引物(10pmol/ul):dxs6804:3ul，dxs6809:0.7ul，dys389:4ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積35ul。第6組PCR反應(yīng)第6組引物(10pmol/ul):dl5sl95:3ul，d21sl414:lul，d20s431:0.75ul，d2sl239:2.5ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積35ul。第7組PCR反應(yīng)第7組引物(10pmol/ul):d22s343:4ul，d22689:0.75ul,dl5sl84:0.75ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積30ul。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b.將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析用DHPLC分析儀(WAVEDNAfragmentanalysissystem,Transgenomic公司)在非變性條件下對(duì)七組STR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。依據(jù)N0N-DHPLC在柱溫5(TC以下DNA雙鏈保持完整狀態(tài)的特性，本試驗(yàn)柱溫選擇在50'C，進(jìn)樣量為8ul，洗脫液濃度梯度由WAVEMaker軟件自動(dòng)計(jì)算出。由于長(zhǎng)片段DNA的P03—與TEAA分子的NH^結(jié)合緊密，故其洗脫時(shí)間延長(zhǎng)，因此，根據(jù)洗脫峰的位置先后及高度差異通過(guò)DNA色譜柱(DNASep，Transgenomic公司)將不同長(zhǎng)度和拷貝數(shù)的STR區(qū)分。洗脫液包括緩沖液A(0.1MTEAA)和緩沖液B(0.1MTEAA，25%乙腈)。3、結(jié)果分析(1)核型分析結(jié)果如圖l所示，可見2號(hào)染色體數(shù)目異常，為三體。(2)本發(fā)明試劑盒分析-第組引物的PCR產(chǎn)物的DHPLC分析如圖2所示，該圖顯示胚胎位于2號(hào)染色體的一個(gè)位點(diǎn)(d2s1242)兩峰之間的比值是1.75:1,考慮為2三體("2三體"表示2號(hào)染色體為3條，正常人為兩條)，核型表達(dá)47,XX，+2。從整個(gè)家系分析，胚胎的異常峰與父親重合，即可判斷胎兒多出的2號(hào)染色體來(lái)自于父親，即父源性的2三體。與此同時(shí)，胚胎21號(hào)染色體的三個(gè)STR位點(diǎn)D21S11、D21S1270和D21S1411均未見異常，即其21號(hào)染色體為數(shù)目和來(lái)源均正常的一對(duì)同源染色體。例216號(hào)染色體數(shù)目異常病例1、實(shí)驗(yàn)材料此例標(biāo)本來(lái)自于孕婦孕7周時(shí)B超提示胚胎停止發(fā)育(無(wú)心管搏動(dòng)、不能見到胎芽等)后行清宮術(shù)時(shí)所收集的絨毛標(biāo)本，同時(shí)采集流產(chǎn)夫婦雙方靜脈血。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)核型分析無(wú)菌取出絨毛組織1520mg,經(jīng)過(guò)粗剪，細(xì)剪，消化后加入培養(yǎng)基接種到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37'C,5%C02溫箱內(nèi)培養(yǎng)5-10天。提取細(xì)胞中的染色體，并經(jīng)低滲、預(yù)固定、兩次固定后制作成玻片，待烤干后進(jìn)行常規(guī)的G顯帶。(2)本發(fā)明試劑盒分析-a.采用本發(fā)明試劑盒第l-9組引物對(duì)父親、母親和胎兒樣本分別進(jìn)行多重PCR反應(yīng)第1組PCR反應(yīng)第2組引物(10pmol/ul):d2sl242:lul，d21sll:3ul，d21sl270:lul，d21sl411:6ul，其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第2組PCR反應(yīng)第2組引物(10pmol/ul):dl3s317:3ul，dl8s535:0.75ul,dl3s258:lul，dl8s382:3ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積35ul。第3組PCR反應(yīng)第3組引物(10pmol/ul):d22S417:0.75ul，dl5sl89:0.5ul，dl6s746:3ul，dl6s675:2ul，dl5s523:3ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第4組PCR反應(yīng)第4組引物(10pmol/ul):d20s438:lul，dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積40ul。第4組PCR反應(yīng)第4組引物(10pmol/ul):d20s438:lul，dxs8377:lul，d2sl244:6ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積衡l。第5組PCR反應(yīng)第5組引物(10pmol/ul):dxs6804:3ul，dxs6809:0.7ul，dys389:4ul;其余試劑見表3,總反應(yīng)體積35ul。第6組PCR反應(yīng)第6組引物(10praol/ul):dl5sl95:3ul，d21sl414:lul,d20s431:0.75ul,d2sl239:2.5ul:其余試劑見表3,總反應(yīng)體積35ul。第7組PCR反應(yīng)第7組引物(10pmol/ul):d22s343:4u1,d22689:0.75ul，dl5sl84:0.75ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積30ul。第8組引物(10pmol/ul):dl8sl002:0.75ul，dl3s634:2ul，dl6s475:lul;其余試劑見表3,總反應(yīng)體積30ul。第9組引物(10pmol/ul):dl6s526:0.75ul，dl3s631:1.5ul，dl8s386:4ul;其余試劑見表3，總反應(yīng)體積35ul。b.將所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行DHPLC分析條件同例l:柱溫選擇在50'C，進(jìn)樣量為8ul，洗脫液濃度梯度由WAVEMaker軟件自動(dòng)計(jì)算出。即直接按照儀器所設(shè)置的多重條件即可。3、結(jié)果分析(1)核型分析-結(jié)果如圖3所示，可見16號(hào)染色體數(shù)目異常，為三體。(2)本發(fā)明試劑盒分析-結(jié)果如圖412所示。圖4為第1組引物的PCR結(jié)果，圖中前3個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果均為1:1的雙峰，說(shuō)明第2號(hào)染色體和第21號(hào)染色體數(shù)目正常。圖5為第2組引物的PCR結(jié)果，圖中第、2、4個(gè)位點(diǎn)均為l:l的雙峰，說(shuō)明第13號(hào)染色體和第18號(hào)染色體數(shù)g正常。圖6為第3組引物的PCR結(jié)果，圖中顯示第3個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果為i:i:i的三峰，說(shuō)明第16號(hào)染色體數(shù)目異常，為三體，且多出來(lái)的峰與母親的重合，說(shuō)明異常來(lái)源于母親；第四個(gè)位點(diǎn)兩個(gè)峰的比值接近于2:1再次證明了流產(chǎn)胚胎16號(hào)染色體為三體。圖7是第4組引物的PCR結(jié)果，從第一個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增情況可判讀出第20號(hào)染色體數(shù)目正常，其余兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果均為單峰，即第2號(hào)染色體和X染色體需要結(jié)合其他位點(diǎn)進(jìn)行分析。圖8是第5組引物的PCR結(jié)果，圖中X染色體的擴(kuò)增結(jié)果為1:1的雙峰，說(shuō)明X染色體數(shù)目正常，并可判斷該流產(chǎn)胎'兒為女性。圖9是第6組引物的PCR結(jié)果，圖中前兩個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果為1:1的雙峰，說(shuō)明第15號(hào)染色體和第21號(hào)染色體數(shù)目正常，后兩個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果為單峰，無(wú)法判讀。圖10為第7組引物的PCR結(jié)果，圖中前兩個(gè)位點(diǎn)的擴(kuò)增結(jié)果為1:)的雙峰，說(shuō)明第22號(hào)染色體數(shù)目正常。圖11是第8組引物的PCR結(jié)果，第二個(gè)位點(diǎn)雙峰峰高的比值近似于2:1，進(jìn)一步驗(yàn)證第16號(hào)染色體數(shù)目異常，且為母源性的三體。圖12為第9組引物的PCR結(jié)果，第l個(gè)位點(diǎn)為三個(gè)比值接近于1:1:1的三峰印證了16三體的結(jié)果，第2和第3個(gè)位點(diǎn)均為純合峰，故無(wú)法判讀。綜合上述19組結(jié)果，該胚胎為16三體的女性胚胎，多余的16號(hào)染色體為母源性。例3本發(fā)明試劑盒的診斷率統(tǒng)計(jì)1、實(shí)驗(yàn)材料絨毛孕6-12周，B超發(fā)現(xiàn)胚胎停育(無(wú)心管搏動(dòng)、不能見到胎芽等)后行清宮術(shù)時(shí)所收集的絨毛標(biāo)本。外周血流產(chǎn)夫婦外周血。2、實(shí)驗(yàn)方法(1)本發(fā)明所選STR位點(diǎn)的理論雜合度的獲得通過(guò)www.gdb.org數(shù)據(jù)庫(kù)査找STR位點(diǎn)的理論雜合度。(2)本發(fā)明所選STR的實(shí)際雜合比例的統(tǒng)計(jì)STR實(shí)際雜合比例是通過(guò)40個(gè)流產(chǎn)家系(流產(chǎn)絨毛DNA和流產(chǎn)夫婦外周血DNA)共120個(gè)DNA樣本經(jīng)9組PCR后統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的雜合峰個(gè)數(shù)計(jì)算所的。實(shí)際雜合比例STR位點(diǎn)為雜合峰的個(gè)數(shù)/總樣本個(gè)數(shù)。3、結(jié)果分析結(jié)果如表4所述，本發(fā)明所選引物與STR都有較高的雜合度，說(shuō)明可以通過(guò)STR的雜合峰比值來(lái)分析樣本待測(cè)染色體的數(shù)目。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>注表中每個(gè)STR位點(diǎn)實(shí)際雜合比例是經(jīng)過(guò)40對(duì)流產(chǎn)夫婦家系共120個(gè)DNA樣本進(jìn)行9組PCR/DHPLC分析后，計(jì)算出的雜合峰比例。實(shí)際的雜合比例和從GDB數(shù)據(jù)庫(kù)中査到的雜合度有差異是因?yàn)椴煌N族與人群所造成。以13號(hào)染色體上的STR雜合比例進(jìn)行說(shuō)明單一D13S317位點(diǎn)在120個(gè)樣本中雜合峰占66.4。/。，即雜合比例是0.664;同理D13S258在120個(gè)樣本中雜合峰比例是58.2。/o;但是在l7組中，D13S317結(jié)合D13S258后，它們總的雜合度提高到了90.9%(注總雜合度提高的原因在丁-如果D13S317這個(gè)位點(diǎn)上為純合峰，但是在D13S258這個(gè)位點(diǎn)上可能就是一個(gè)雜合峰，因此兩個(gè)位點(diǎn)結(jié)合起來(lái)后實(shí)際雜合比例提高，即診斷率提高到了90.9%);同理將19組13號(hào)染色體上的四個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，在120個(gè)樣本中能診斷的雜合峰比例即可達(dá)到％%。同理可得出其他染色體上的STR的實(shí)際雜合比例和總的雜合比例。本發(fā)明人還利用該試劑盒對(duì)100例正常人群和40個(gè)流產(chǎn)家系進(jìn)行了檢測(cè)，并將所得結(jié)果與同步進(jìn)行的核型分析結(jié)果進(jìn)行了比對(duì)，兩者的一致率達(dá)到100%。SEQUENCELISTING<"0>南方醫(yī)科大學(xué)<120>—種檢測(cè)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的染色體數(shù)目異常的試劑盒<160>96<170>PatentInversion3.3<210><211><212><213>123■人工序列<400>1ccagcaggatttctttctgaaca23<210>2<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>2tgccctcc3gctU3gtg3c3t323<210>3<211>23<212>■<213>人工序列<400>3agtcsattcccca3gtg33ttgc23<210>4<211>28<212>隠<213>人工序列<400>4ttctccagagac3g3ct33taggaggta28<210>5<211>23<212>■<213>人工序列<400>5gagatggcctgtgtctatcccac23<210>6<211>25<212>■<213>人工序列<400>6gccaatccttcgtgataaatcactc25<210>7<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>7cgg3tsg33333t3gg3tgg3t33325<210>8<211>26<212>■<213>人工序列<400>8cagccttctaaatattcatcctgttt26<210>9<211>26<212>隠<213>人工序列<400>9ggactctgaccc3tct3acgcct3tc26<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>10ccataggcagcccaaaaagaC3ga24<210>11<211>23<212>謹(jǐn)<213>人工序列<400>11tg3C3333gCC3C3CCC3t33Ct23<210>12<211>23<212>隱<213>人工序列<400>12atggtsgcctggc3ggct3agsg23<210>13<211>27<212>隠<213>人工序列<400>13cacggagtcattctta3aat3gacag327<210>14<211>24<212>謹(jǐn)<213>人工序列<400>14aagacagagagagggaataaacca24<210>15<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>15atccatccatccttccaca'gatac3t26<210>16<2">20<212>隠<213>人工序列<400>16caccatgcccaggctttttc20<210>17<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>17acggcaagaccctgttttgaga22<210>18<211>22<212>隠<213>人工序列<400>18tccaacaagccagctttttacc22<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19tgcagcgsgactctgccaaa333g24<210>20<211>23<212>隠<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><400>25tgccagcacttggtg33cact3tg24<210>26<211>23<212>■<213>人工序列<400>26ggccagcatctgggt33C3t3gg23<210>27<211>27<212>瞧<213>人工序列<400>27tg3gacttgatgggsgtatcC3gagsg27<210>28<211>27<212>隠<213>人工序列<400>28tgcsccactgt3Ctccagc3tgaatta27<210>29<211>21<212>暖<213>人工序列<400>29gccccagcctacatctsccac21<210>30<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>30tgctccttcgttccctgtcttct23<210>31<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>31gg3tt3C3ggC3tgsgcc3ct3C3g25<210>32<211>23<212>■<213>人工序列<400>32ttccaagaggtggggaaaaaaag23<210>33<211>25<212>■<213>人工序列<400>33tttcccagatattttgaccscc3ta25<210>34<211>22<212>■<213>人工序列<400>34cccgtggcatgtggttgctata22<210>35<211>25<212>隱<213>人工序列<400>35ttgctttsgg'ctgatgtgaggaaga25<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>36agctcaggaatactgsgggcatgac25<210>37<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>37gatagattgatagagggagggata24<210>38<211>28<212>■<213>人工序列<400>38tctacctaatctgtcaatgattttctgt28<210>39<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>39ggg3tc3cg3g3g33gc3333tt3325<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40tcacatgggctaattcccgta21<210>41<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>41tccccaagtg3attgccttctatct3t27<210>42<211>28<212>隠<213>人工序列<400>42tctccagagacagactaataggaggtag28<210>43<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>43tcc3gcctg3gtg3c3g3gtg3tacca27<210>44<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>44ggggstatttgggactccttg3c3g25<210>45<211>22<212>■<213>人工序列<400>45accaggtggcctgcatcatgct22<210>46<211>23<212>隠<213>人工序列<400>46ggcgacagagC33gactccatC323<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>47aaggccgagtgggagtattt<210>48<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>48tctcccccscttgctg33<210>49<211>27<212>隠<213>人工序列<400>493tct3gg3C3tctcaggsgct3tct33<210>50<211>23<212>隠<213>人工序列<400>50C33agtgagaccccatctc33tc<210>51<211>23<212>隱<213>人工序列<400>51cagccttgttgctcacgcaaagc23<210>52<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>52cctgggtgsc柳gtg柳ctgtcsa26<210>53<211>171<212>隨<213>入<400>53ccagcaggatttctttctgaacagaatatagagggtgggaactttttctttttctttctt60tctUccUctUctttcUtctttcmctttctttctttctttctttctttctttcat120ttatttattttttgagacagggtctcactatgtcactaaagctggagggca171<210>54<211>202<212>DNA<213>人<400>54agtcaattccccaagtgaattgccttctatctatctatctatctgtctgtctgtctgtct60gtctgtctatctatctatatctatctatctatcatctatctatccatatctatctatcta120tctatctatctatctatctatctatctatctatcgtctatctatccagtctatctacctc■ctattagtctgtctctggag33202<210>55<211>274<212>DNA<213>人<400>55gagatggcctgtgtctatcccactgtattattcagggctacatagagaaacagaaccaat6033a3tag3tagstsgatgatagatg3t3g3tgat3gat3g3tagatagatagatagstsg120atagatagatagacagactatatataatatatatttatctcactgtatatatgtgtgtgt180atatatatgcatgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtatgaagagag240agagagagtgagtgatttatcacgaaggattggc274<210>56<211>314<212>DNA<213>人<400>56cggat3gaa333tsgg3tgg3t3a3t3ga33t3gstgg3t.gggtggstgg3tgg3tgg3t3tac3t3gatg33tggstgg3tsg3tagt3aggtaggtaggt3gt3gat3gatsgatags3acaggatagatagat3g3t柳tagat3gt3ttt3ga3ggctgC3t3ggtagat3cat33at3tgatgaatgc60gg3tggatgg3tgg3tgg3tggstg33tgg120t3t333tggstgg3tggat3gat3cac3gt■tagatagatagatagatagatagatagata2403t3g3t3g3t3g3t3gst333C3ggstg33300314<210>57<211>136<212>DNA<213>人<400>57ggactctgacccatctaacgcctatctgtatttacaaatacattatctatctatctatct60atctatctatctatctatctatctatcaatcaatcatctatctatctttctgtctgtctt120tttgggctgcctatgg136<210>58<211>183<212>DNA<213>人<400>58tgacaaaagccacacccataacttttttcctctagatagacagatagatgatagatagat60sgatagstagatagstagat3g3t3gat3g3tagatagatat3g3ttctctttctctgca120ttctcatctatatttctgtctttctcttaattatgggtaactcttagcctgccaggctac180cat183<210>59<211>211<212>隠<213>人<59C3cggsgtC3ttctt3333t3g3c3g3t3g33g3t3g3tg3t3g3tgstg3t3g3t3gat60agagagatgatagatgatgatagatagatagagagatgatagatggatggatagatagat120ag3t3g3t3g3tag3tagat3gat3g3t3gat3gatgat3gatagagatag3t3t3ga3t■atcttattggtttattccctctctctgtctt211<210>60<211>258<212>隱<213>人<400>60atcc3tcc3tccttccscagatscatctattt3a33t33cagg3aaa333g3a3g33aga60aggaaagaaagaaagaaagaaaaagaaagaaagaaagaagaaagaaagaaaga鄉(xiāng)aaag1203a3gaaag3aagaaag333gaa3ga3aga33gaaag3g33ag3aag33ag333g333g33■agaaag333g333g3aagaaag333g3a3gaaaga卿3aagsasagasag33ag33gg3240a333gcctgggcstggtg<210>61<211>148<212>DNA<213>人258<400>613cggc33gsccctgttttgaga3g3gg333g3g3g33gg33gg33gg33gg33gg33gg3603gg33gg33gg33gg33gg3333g333tc33ttsggg33g333t33gcggt3g33Ct'33t120aa3taaggtaaaa3gctggcttgttgg3148<210>62<211>186<212>DNA<213>人<400>62tgc3gcg3g3ctctgcc333333gg333g333g333g33gga3gg33gg3g3g333g33a60g333g333g3g3g3g3g333g333g3333gasasgsgaasgag333g3a3gagaaggaag120333g333g3g3ggg33g333g333g333t3gsg33gg33g333g333gggg333g3tggg■gatcct186<210><211><212><213>63219DNA人<63ccaaagcttatcggtgagggtctttctttctttctttctttttctttctttcttttcttt60ctttcttttctttatccttccttccttccttccttccttccttccttccttccttccttc120cttccttccttctttcttttctctttctttctttctttctttctttctttctttctttct180ttcttttctttctttctggtttcattcttgtcacccagg219<210>64<211>256<212>隠<213>人<400>64gcgat3ttggctgaggcacattctgcctat33gg333g33gg33gga3gg33gg33gg33333g333g333g33gg33gg333g333g33333gg333g333g3g333g333g3g3g333aggaaggcaggaaggc3tcctggc3g33ggaagg33gg33gg33gg60gg33gg3agg33gg333g333g333g333g120aaaaggaagaagggaaggaaggaaggagag180g333g333333g3g3g333gg33gtc卿3240256<210>65<211>358<212>隨<213>人<400>65tgccagcacttggtgaacactatgttaagactgaatttttcttttcttttcttttcttct60tttctcttccttctttgccttctttccttccttgccttccttcctcccttccttccttcc120cccctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctut180ctctttctuct"cutttcttccttcctttctttctttctttctttcttttctttctt240tctttcatccttcctttcUccttccttccttccttccttcctcttttcttttcttttct300tttcttttctttcatctttcttgagatagagtctccctatgttacccagatgctggcc358<210>66<211>193<212>隠<213>人<400>66tttcccagatattttgaccaccatatatattttcttttctccctagcaatatctatctat60ctatctatctatctatctatctatctatctatctatctatcaatgtgtggtgggactcta120gtgttctat3a33c3caga3gcsc3gtgtgtaggtagcgtcttggcttggttatagcaac■c3c3tgcc3cggg193<210>67<211>232<212>薩<213>人<400>67ttgctttaggctgatgtgagg33g3gat3g3gg3tagat3gat3g3tagatag3t3g3ta60g3tagat3g3t3g3t3g3t3g3t3g3tg3t3g3t33tag3t3g3tag3t3g3tagstg3t120ag3t3g3ta3t3g3tgat3gatagatagatatag3t3g3tagatagatagatag3tagat■3gatagccc3aattcctacat3atctagtcatgccctcagtattcctg3gct232<210>68<211>331<212>■<213>人<400>68gat3g3ttg3t3g3ggg3ggg3t3g3t3g3t3g3t3g3t3gat3g3tagat柳t3g3c360gacagacagstac3t3g3ta3t3c3gatg3g3gttgg3tacagaagtsggt3tsatg3t3120ga-ta—gatsga—t3g3t3g3ta.gatsgstsgst3g3t3g3tag3t鄉(xiāng)csg3c卿c3g3c3180gscag3C3C3cacat3g3ta3t3c3gatg3gaqttggatacagaagtaggt3t3atgata240g3t3g3t3g3t3gst3g3t3g3t3g3t3g3t3g3tsg3t3g3t柳t3g3t3g3tg3t3g3003agacagaaaatcattg3C3gstt3ggt3g3331<210>69<211>162<212>DMA<213>人<400>69ggg3tC3cgsg3卿gc333a"33t33g3柳atga3t3g3tgt3t3g3cstsgstsga60t3g3t3g3tagat柳t3gat柳t3gatag3tagat3g3tatag3tagatag3gagaga120g3gag3gagagagagattt3Uacggg33ttagcccstgtga162<210>70<211>194<212>DNA<213>人<400>70tccccaagtgaattgccttctatctatctat3tctstctatstctstct3tCt3tC3tCtatctatctatctatctatctatctatcgtctctgtctctggagatctatctgtctgtctgtctgtctgtctgtc603tCtatCC3t3tCt3tCt3tCt3tCt3tCt120tatctatccagtctatctacctcctsttag■194<210>71<211>216<212>隱<213>人<400>71tccagcctgagtgacagagtgataccatgtgaaagaaagaaaaaaagaaagagagagaga60aagagagagaggaaggaaggaaggaaggaaggaaggaaggaaggaaggaaggggaaggga120aagaaggaaaggaaggaagggaagggaaggaaggaaaggaaggaaaggaaggaaaggaaa180g3gaagccatcctgtc33gg3gtccc33atatcccc216<210>72<211>269<212>隱<213>人<400>72accaggtggcctgcatcatgctttttgtacagtctatggaaccstgagccaattcaatct60ctUtcttttactttttcttttcttttcttttcttttcttttcttttcttttcttttctt120ttcttttctttcttttcttttctttcttttctttcttctttctttttcttttctttctttctttctttctttctttctttctttctUctttctttcttctttctttttcUtttttttttttttctgstgg3gtcttgctctgtcgcc<210>73<211>182<212>■<213>入<400>73tgagscttgatgggsgt3tcc3gag3gct3ttaa3t3atgtgga3attg3gctgattc3ttttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctctttcUtcttttttcagac3gggtctc3C3ctgtaattC3tgctggagt3cagtggtgC3<210><211><212><213>74239■人<400>74gccccagcctacatctaccacttcatggcttaccacagagagaggagaagaaggagaagg3ggaga鄉(xiāng)3g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g33g3gg33g3gg33g3gg33g3gg33g3gg33g3gg33g33g33g3gg33g33g33g33g33g33g3c3ggg33cg33gg3gc3<210>75<211>302<212>DNA<213>人<400>75ggattacaggcatgagccactacagcttgcttgctttcttctUctttcttttcttutctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttccttccttccttc120cttccttccttccttccttctttctttctttctttctttctttctttctttctttctttc180tttctttctttcttccttccttccttccttccttccttccttccttccUccttccttcc240ttccttcctttctctctctttctttttttttttctttttctttttttccccacctcttgg30033302<210>76<211>169<212>DNA<213>人<400>7633ggccgagtgggagtatttgcttctgtgtt3att3tggactgtaatggaggcttaaaat603ttC3gC3gggCtCagC3tCtCCCCC33CCaC3C3C3C3C3C3C3C3C3C3C3C3CaC3C120ac3C3C3cac3cacacac3c3g3c3c3ctgcttcagcaagtgggggsga169<210>77<211>209<212>DNA<213>人<400>77atctaggacatctcaggagct3tcta3tatgt3tat3tatatatgtatgtatgt3tgtat60gtacatacatataatagatggatagatgattaatggtagatagatagatagatagataga120t3g3t3g3t3g3t3g3t3g3t3gst柳t3g3t3g3c3g3c3g3cag3t3gstsggcsgg■caggcagattgagatggggtctcactttg209<210>78<211>244<212>■<213>人<400>78cagccttgttgctc3cgc333gcctgtttgctggtctcttc3catgg3c3catg3g3ctc60cttcttttcttttcttttcttttcttttcttttcttttcttttcctttctttctttcttt120ctttctctctctccttccttcctctttctttctttctttctttctctccttccttcctct180ttctttcttctttctttctttcttttttctttctttttttgacagtctcactctgtcacc240cagg244<210>79<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>79tsccccsgggc33g3c3g3c20<210>80<211>22<212>隠<213>人工序列<400>803cc3caggcctcctttctcttc22<210>81<211>23<212>隱<213>人工序列<400>81cactgcagcaggggttgacagag23<210>82<211>23<212>隱<213>人工序列<82ggcc3gaaact3ctggcagg3ac23<210>83<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>83ggc3g3ttc33t3gg3t33at3g3c3g328<210>84<211>24<212>隱<213>人工序列<400>84gccaattcccctatttagtcatct24<210>85<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>85ggacctgcctttatccaccctacct25<210>86<211>20<212>DNA<213>入工序列<400>86gcsgcctgggc33c33gg3g20<210>87<211>22<212>■<213>人工序列<87gggc33c33g3gc33a3ctctg22<210>88<211><212><213>■人工序列<400>88gccctcaccatgattggatcac<210>89<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>89aggaaggagaaagagagagcgagag25<210>90<211>26<212>■<213>人工序列<210>91<211>171<212>隠<213>人<400>91tsccccsgggc3ag3c3gacag3t3g3tag3tagatag3t3g3t3g3t3g3t3g3t3g3t60ag3t3gc33t3t3ttgst3tctgttt3tcc3ttgagtcs33c33at333cscacstagst120t3C333ggtccttttctcttcccatgcctg3ag3g333ggsggcctgtggt171<210>92<211>208<212>■<213>人<400>92C3ctgc3gc3ggggttg3cagagtg3gsctcc3tc33333333g3卿333g犯3c3c3g60<400>90ggtagaatctacgcaccctctgattt333g3g3g3g3g3Cg333g333g3g3gag3g3g3g3g3g3g3g333g333g333g333g312033ga33g333g333g333g333g333g333g333g333g333g333gttccgtgcsgtst180tttctgttcctgccagtagtttctggcc208<210>93<211>240<212>DNA<213>人<400>93ggcsg3ttc3at3gg3t333tag3c3g3tg3aag33ag333g3g3gag3gag333g3g3g603g3g3g333g柳g3g333g3g3g3g333g333g3g333g333gag3g33g333g333g312033g333g333g333g333g333gg33g333gg33g333g3333g333g333g3g333gg3■3gga3gg333g33gg33gg33gg333g333g3tg3c3g3tgsctssatsgggg33ttggc240<210>94<211>163<212>■<213>人<400>94gg3cctgcctttatccaccctacctgtattg3gtagtttcagctatttaaccgtcattcc60tctctctccattttacttatctatctatctatctatctatctatctatctatctatctat120ct3tctattt3tagac3g3gtctctccttgttgcccaggctgc163<210>95<211>196<212>DNA<213>人<400>95gggc33caag3gc333actctgtctca333333atagatag3tag3t3g3t3g3t3g3t360gatagatagat3gatagatgatagatagatagatgcgtggatcccacccccag3a3ttat120ttttccaattggcctataaggggaacagac3tcc3t3tttttatggctgtccaggtgatc■csatcatggtgagggc196<210>96<211>224<212>DNA<213>人<400>鄰3gg33gg3g333g3gag3gCg3g3g333g33Sg333333g333g333g3333g3鄉(xiāng)33360g333g3g3g3g3g333g333g33tg333333g333333g333g333g333g33g333g3312033g333g333g333g333g333g333g333g333g333g333g333g333g333g33柳1803ag33柳a3aaga犯33aaatcag3gggtgcgtagattct3cc22權(quán)利要求1、一種檢測(cè)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的常見染色體數(shù)目異常的試劑盒，試劑盒是一種多重PCR試劑盒，其特征在于包括以下第1～7組檢測(cè)不同STR位點(diǎn)的多重PCR引物第1組檢測(cè)D2S1242位點(diǎn)的引物CCAGCAGGATTTCTTTCTGAACA和TGCCCTCCAGCTTTAGTGACATA；檢測(cè)D21S11位點(diǎn)的引物AGTCAATTCCCCAAGTGAATTGC和TTCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGTA；檢測(cè)D21S1270位點(diǎn)的引物GAGATGGCCTGTGTCTATCCCAC和GCCAATCCTTCGTGATAAATCACTC；檢測(cè)D21S1411位點(diǎn)的引物CGGATAGAAAAATAGGATGGATAAA和CAGCCTTCTAAATATTCATCCTGTTT；第2組檢測(cè)D13S317位點(diǎn)的引物GGACTCTGACCCATCTAACGCCTATC和CCATAGGCAGCCCAAAAAGACAGA；檢測(cè)D18S535位點(diǎn)的引物TGACAAAAGCCACACCCATAACT和ATGGTAGCCTGGCAGGCTAAGAG；檢測(cè)D13S258位點(diǎn)的引物CACGGAGTCATTCTTAAAATAGACAGA和AAGACAGAGAGAGGGAATAAACCA；檢測(cè)D18S382位點(diǎn)的引物ATCCATCCATCCTTCCACAGATACAT和CACCATGCCCAGGCTTTTTC；第3組檢測(cè)D22S417位點(diǎn)的引物ACGGCAAGACCCTGTTTTGAGA和TCCAACAAGCCAGCTTTTTACC；檢測(cè)D15S189位點(diǎn)的引物TGCAGCGAGACTCTGCCAAAAAAG和AGGATCCCCATCTTTCCCCTTTC；檢測(cè)D16S746位點(diǎn)的引物CCAAAGCTTATCGGTGAGGGTCT和CCTGGGTGACAAGAATGAAACCAGAA；檢測(cè)D16S675位點(diǎn)的引物GCGATATTGGCTGAGGCACATTCT和GCCTTCCTGCCTTCCTTCCTGAC；檢測(cè)D15S523位點(diǎn)的引物TGCCAGCACTTGGTGAACACTATG和GGCCAGCATCTGGGTAACATAGG；第4組檢測(cè)D20S438位點(diǎn)的引物TGAGACTTGATGGGAGTATCCAGAGAG和TGCACCACTGTACTCCAGCATGAATTA；檢測(cè)DXS8377位點(diǎn)的引物GCCCCAGCCTACATCTACCAC和TGCTCCTTCGTTCCCTGTCTTCT；檢測(cè)D2S1244位點(diǎn)的引物GGATTACAGGCATGAGCCACTACAG和TTCCAAGAGGTGGGGAAAAAAAG；第5組檢測(cè)DXS6804位點(diǎn)的引物TTTCCCAGATATTTTGACCACCATA和CCCGTGGCATGTGGTTGCTATA；檢測(cè)DXS6809位點(diǎn)的引物TTGCTTTAGGCTGATGTGAGGAAGA和AGCTCAGGAATACTGAGGGCATGAC；檢測(cè)DYS389位點(diǎn)的引物GATAGATTGATAGAGGGAGGGATA和TCTACCTAATCTGTCAATGATTTTCTGT；第6組檢測(cè)D15S195位點(diǎn)的引物GGGATCACGAGAGAAGCAAAATTAA和TCACATGGGCTAATTCCCGTA；檢測(cè)D21S1414位點(diǎn)的引物TCCCCAAGTGAATTGCCTTCTATCTAT和TCTCCAGAGACAGACTAATAGGAGGTAG；檢測(cè)D20S431位點(diǎn)的引物TCCAGCCTGAGTGACAGAGTGATACCA和GGGGATATTTGGGACTCCTTGACAG；檢測(cè)D2S1239位點(diǎn)的引物ACCAGGTGGCCTGCATCATGCT和GGCGACAGAGCAAGACTCCATCA；第7組檢測(cè)D22S343位點(diǎn)的引物AAGGCCGAGTGGGAGTATTT和TCTCCCCCACTTGCTGAA；檢測(cè)D22S689位點(diǎn)的引物ATCTAGGACATCTCAGGAGCTATCTAA和CAAAGTGAGACCCCATCTCAATC；檢測(cè)D15S184位點(diǎn)的引物CAGCCTTGTTGCTCACGCAAAGC和CCTGGGTGACAGAGTGAGACTGTCAA2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括以下第89組多重PCK引物中的一組或兩組第8組檢測(cè)D18S1002位點(diǎn)的引物TACCCCAGGGCAAGACAGAC和ACCACAGGCCTCCTTTCTCTTC;檢測(cè)D16S475位點(diǎn)的引物CACTGCAGCAGGGGTTGACAGAG和GGCCAGAAACTACTGGCAGGAAC;檢測(cè)D13S634位點(diǎn)的引物GGCAGATTCAATAGGATAAATAGACAGA和GCCAATTCCCCTATTTAGTCATCT;第9組檢測(cè)D16S526位點(diǎn)的引物GGAGCTGCGTTTATCCACGCTACCT和GCAGCCTGGGCAACAAGGAG;檢刺D13S631位點(diǎn)的引物GGGCAACAAGAGCAAAACTCTG和GCCCTCACCATGATTGGATCAC;檢測(cè)D18S386位點(diǎn)的引物AGGAAGGAGAAAGAGAGAGCGAGAG和GGTAGAATCTACGCACCCTCTGATTT。全文摘要本發(fā)明提供了一種檢測(cè)導(dǎo)致自然流產(chǎn)的染色體數(shù)目異常的試劑盒，該試劑盒包括7～9組多重PCR引物，可對(duì)10種(2號(hào)、13號(hào)、15號(hào)、16號(hào)、18號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、22號(hào)、X和Y染色體)染色體進(jìn)行數(shù)目異常的分子檢測(cè)和來(lái)源判斷，檢測(cè)范圍覆蓋了自然流產(chǎn)以及產(chǎn)前診斷中常見的異常染色體類型，具有靈敏度和準(zhǔn)確度高、檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101407843SQ20081021922公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2008年11月19日優(yōu)先權(quán)日2008年11月19日發(fā)明者嶸曾,麗熊申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)