專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種h5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禽流感病毒屬于正粘病毒科流感病毒屬A型流感病毒。禽流感即由禽流感病毒感染禽類(lèi)后引起的一種以呼吸系統(tǒng)乃全身性敗血癥為特征的傳染病。2003年12月以來(lái)，越南、韓國(guó)和日本等亞洲國(guó)家先后爆發(fā)了大規(guī)模的禽流感(均為高致病性禽流感H5N1)，不僅給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且給人類(lèi)健康和生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)截至2007年5月31日全世界人確診感染禽流感309例，死亡187例。現(xiàn)有的檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的方法很多，大致可以分為三大類(lèi)，即病原學(xué)診斷方法、血清學(xué)診斷方法和分子生物學(xué)診斷法。病原學(xué)診斷方法包括動(dòng)物接種試驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)法，過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)。血清學(xué)診斷方法包括瓊脂擴(kuò)散(AGP)試驗(yàn)、血凝試驗(yàn)、血凝抑制(HI)試驗(yàn)、神經(jīng)氨酸酶抑制(NI)試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、病毒中和試驗(yàn)(SN)及免疫熒光技術(shù)(IF)等，血清學(xué)診斷方法的缺點(diǎn)是只能檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)禽流感病毒抗體而無(wú)法檢測(cè)病原。分子生物學(xué)診斷方法包括PCR、核酸探針技術(shù)等，比前兩種方法快速、靈敏，但需要使用特殊的儀器(如PCR儀)，而熒光探針的制備比較昂貴，不適于基層應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)技術(shù)的快速檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明提供的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，包括三對(duì)引物，一對(duì)引物是與禽流感H5N1病毒GenBankAccessionNumberAY653200中HA基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與禽流感H5N1病毒GenBankAccessionNumberAY653200中HA基因結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與禽流感H5N1病毒GenBankAccessionNumberAY653200中HA基因結(jié)合的環(huán)形引物對(duì)。因?yàn)橐镒R(shí)別的八個(gè)區(qū)域是通過(guò)比對(duì)最近幾年所有H5亞型的HA基因(包括H5N1至H5N9)得到的保守區(qū)，所以引物能識(shí)別所有這些H5亞型的HA基因，從而本發(fā)明的試劑盒可以用于所有H5亞型的禽流感病毒的檢測(cè)。本發(fā)明提供的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒在使用過(guò)程中，所述的內(nèi)側(cè)引物對(duì)、外側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)作為一個(gè)整體組使用，使用時(shí)應(yīng)該盡量避免引物二聚體的形成。所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)包括上游引物(FIP)和下游引物(BIP)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)包括上游引物(F3)和下游引物(B3)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對(duì)包括上游引物(LF)和下游引物(LB)，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照；所述陽(yáng)性對(duì)照為H5亞型禽流感病毒RNA。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑具體可為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HCl、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、脫氧核苷酸、BstDNA聚合酶和層反轉(zhuǎn)錄酶。在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)、所述外側(cè)引物對(duì)及所述環(huán)形引物對(duì)，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；每23nL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HCl0.5umo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025nL、MgS040.2umo1、甜菜堿20nmol、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04-0.06ymol，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004-0.008umol，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02-0.04umol;每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量?jī)?yōu)選如下Tris-HC10.5umol、KC10.25umol、(NH4)2S040.25umol、Tween200.025uL、MgS040.2umol、甜菜堿20umol、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04ixmo1，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004umol，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02師1。所述試劑盒還包括熒光顯色劑，任何常規(guī)熒光顯示劑均可，如熒光染料SYBRGREENI。所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液與所述熒光顯色劑的體積比為23:(1-3)，優(yōu)選23:1。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒的方法，是用所述的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒對(duì)來(lái)自動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。所述檢測(cè)動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘的步驟。應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)H5亞型禽流感病毒，可以通過(guò)直接檢視判斷樣本是否含有H5亞型禽流感病毒，也可以通過(guò)顯色檢測(cè)判斷樣本是否含有H5亞型禽流感病毒。直接檢視時(shí)，LAMP反應(yīng)液陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照的體積配比為23:2:2。顯色檢測(cè)時(shí)，LAMP反應(yīng)液陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照熒光顯色劑的體積配比為23:2:2(l-3);LAMP反應(yīng)液陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照熒光顯色劑的體積配比優(yōu)選為23:2:2:1。可以通過(guò)直接檢視判斷樣本是否含有H5亞型禽流感病毒，也可以通過(guò)顯色檢測(cè)判斷樣本是否含有H5亞型禽流感病毒。①直接檢視裝有陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)管有白色沉淀，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為澄清液體。如果裝有待檢測(cè)樣品的反應(yīng)管仍為澄清液體，則說(shuō)明待檢樣品中H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測(cè)樣品的反應(yīng)管有白色沉淀，則說(shuō)明樣品中H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。②顯色檢測(cè)在反應(yīng)管中加入熒光顯色劑，在紫外燈照射下觀察顏色變化。裝有陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)管顏色為綠色，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為黃色。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為黃色，則說(shuō)明H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為綠色，則說(shuō)明樣品中H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。本發(fā)明提供的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)原理如下根據(jù)H5亞型禽流感病毒HA基因序列(序列表的序列l(wèi))保守區(qū)的特定區(qū)域設(shè)計(jì)了一組用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的引物，即內(nèi)側(cè)引物對(duì)(內(nèi)側(cè)上游引物FIP和內(nèi)側(cè)下游引物BIP)、外側(cè)引物對(duì)(外側(cè)上游引物F3和外側(cè)下游引物B3)和環(huán)形引物對(duì)(環(huán)形上游引物L(fēng)F和環(huán)形下游引物L(fēng)B)。三對(duì)引物和H5亞型禽流感病毒HA基因序列保守區(qū)的八個(gè)特定區(qū)域的序列完全配對(duì)，確保反應(yīng)的徹底進(jìn)行，也保證了H5亞型禽流感病毒檢測(cè)方法的特異性。F3:AIVIDNO2:GTGAATTGGAATATGGTAACTGC(序列表的序列2);B3:AIVIDNO3:CCATTCCCTGCCATCCTC(序列表的序列3);FIP:AIVIDNO4:CGATGGTGAGAGGGTGTATGTTTTCAAACTCCAATGGGGGCG(序列表的序列4);BIP:AIVIDNO5:CTTGCGACAGGGCTCAGAAATTTTCTGCTATAGCTCCAAATAGTCC(序列表的序列5);LF:AIVIDN06:TGTGGAATGGCATACTAGAGTT(序列表的序列6);LB:AIVIDN07:AGCCCTCAAGGAGAGAGA(序列表的序列7)。所述的引物組與所述的禽流感H5N1病毒AY653200序列HA基因上8個(gè)特定結(jié)合區(qū)域結(jié)合，見(jiàn)表l。表1引物組與所述的禽流感H5N1病毒AY653200序列HA基因的結(jié)合區(qū)域<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>上述引物組在AMV反轉(zhuǎn)錄酶和具有高度鏈置換催化活性的DNA聚合酶的作用下可完成對(duì)模板RNA的擴(kuò)增。擴(kuò)增過(guò)程分為三個(gè)階段，具體如下(1)反轉(zhuǎn)錄階段在AMV反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，樣本RNA被反轉(zhuǎn)錄為cDNA。(2)循環(huán)起始階段一端內(nèi)惻引物先與模板結(jié)合并啟動(dòng)DNA合成。相同一端的外側(cè)引物隨后與模板結(jié)合啟動(dòng)DNA合成，并發(fā)生鏈置換釋放出含有內(nèi)側(cè)引物序列的DNA單鏈。該單鏈DNA作為模板先后與另一端的內(nèi)側(cè)引物和外側(cè)引物結(jié)合，啟動(dòng)DNA合成并發(fā)生鏈置換，最后形成一個(gè)初始的莖環(huán)DNA。(3)反應(yīng)循環(huán)階段內(nèi)側(cè)引物與初始莖環(huán)DNA結(jié)合，啟動(dòng)鏈置換DNA合成，可產(chǎn)生另一個(gè)初始莖環(huán)DNA和一個(gè)新的兩倍長(zhǎng)度的莖環(huán)DNA。這些莖環(huán)DNA可作為模板繼續(xù)與內(nèi)側(cè)引物結(jié)合啟動(dòng)鏈置換DNA合成，并且每次合成均可使莖環(huán)DNA的莖長(zhǎng)度成倍增長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)一個(gè)小時(shí)的等溫?cái)U(kuò)增，目的DNA可累積109拷貝。應(yīng)用本發(fā)明提供的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，特異性高且靈敏度高，可檢測(cè)出6-IO個(gè)拷貝的目的RNA。與PCR檢測(cè)方法相比，應(yīng)用本發(fā)明提供的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，不需要昂貴的PCR儀，只需普通的金屬或水浴鍋即可，并且檢測(cè)結(jié)果使用熒光染料來(lái)觀察即可，操作簡(jiǎn)單方便。本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)及食品中可能污染的H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)，特別適于基層臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)工作及現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)H5亞型禽流感病毒可包括如下步驟(1)RNA的提取本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測(cè)各種分泌物中的H5亞型禽流感病毒，如鼻咽分泌物，肺臟，糞便等。不同來(lái)源的總RNA提取可參考相應(yīng)資料，或使用相應(yīng)RNA提取試劑盒。(2)環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增①在裝有23u1的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中加入2u1模板RNA;②于水浴鍋或金屬恒溫加熱器上60-65。C放置20-90分鐘，取出。在步驟②完成后，取出前，還可以再調(diào)水浴鍋溫度到80-9(TC反應(yīng)2-IO分鐘，目的是能夠終止反應(yīng)，以便長(zhǎng)期保存反應(yīng)結(jié)果。(3)結(jié)果判定可以通過(guò)直接檢視判斷樣本是否含有H5亞型禽流感病毒，也可以通過(guò)顯色檢測(cè)判斷樣本是否含有H5亞型禽流感病毒。①直接檢視裝有陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)管有白色沉淀，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為澄清液體。如果裝有待檢測(cè)樣品的反應(yīng)管仍為澄清液體，則說(shuō)明待檢樣品中H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。如果裝有待檢測(cè)樣品的反應(yīng)管有白色沉淀，則說(shuō)明樣品中H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。②顯色檢測(cè)在反應(yīng)管中加入熒光顯色劑，在紫外燈照射下觀察顏色變化。裝有陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)管顏色為綠色，裝有陰性對(duì)照的反應(yīng)管仍為黃色。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為黃色，則說(shuō)明H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性。如果裝有待檢樣品的反應(yīng)管顏色為綠色，則說(shuō)明樣品中H5亞型禽流感病毒檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例l、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的制備一、引物的合成人工合成以下3對(duì)引物F3:GTGAATTGGAATATGGTAACTGC;B3:CCATTCCCTGCCATCCTC;FIP:CGATGGTGAGAGGGTGTATGTTTTCAAACTCCAATGGGGGCG;BIP:CTTGCGACAGGGCTCAGAAATTTTCTGCTATAGCTCCAAATAGTCC;LF:TGTGGAATGGCATACTAGAGTT;LB:AGCCCTCAAGGAGAGAGA。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umolTris-HC1、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、0.2"molMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、4種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035畫(huà)1、0.04umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.04umol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.004umol上游外側(cè)引物(F3)、0.004umol下游外側(cè)引物(B3)、0.02umol上游環(huán)形引物(LF)、0.02umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝該試劑盒由以下物質(zhì)組成步驟二配制的LAMP反應(yīng)液、H5亞型禽流感病毒RNA(陽(yáng)性對(duì)照)(A/Goose/QFY/HLJ/04(H5N1)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所)、滅菌雙蒸水(陰性對(duì)照)、熒光染料SYBRGREENI。實(shí)施例2、H5N1亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5nmolTris-HC1、0.25umolKC1、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、0.2umolMgS04、20iimol甜菜堿(Betaine)、4種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.06umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.06umol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.008umol上游外側(cè)引物(F3)、0.008ymol下游外側(cè)引物(B3)、0.04umol上游環(huán)形引物(LF)、0.04umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟三。實(shí)施例3、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的制備一、引物的合成同實(shí)施例1的步驟一。二、配制LAMP反應(yīng)液每23uLLAMP反應(yīng)液，含有以下組分0.5umolTris-HC1、0.25umolKCl、0.25umol(NH4)2S04、Tween200.025uL、0.2umolMgS04、20umol甜菜堿(Betaine)、4種脫氧核苷酸(dNTPs)各0.035umol、0.05umol上游內(nèi)側(cè)引物(FIP)、0.05umol下游內(nèi)側(cè)引物(BIP)、0.006umol上游外側(cè)引物(F3)、0.006nmol下游外側(cè)引物(B3)、0.03umol上游環(huán)形引物(LF)、0.03umol下游環(huán)形引物(LB)、16U的BstDNA聚合酶、0.2U的AMV反轉(zhuǎn)錄酶、滅菌雙蒸水。三、試劑盒的組裝同實(shí)施例1的步驟三。實(shí)施例4、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩只雞，1只確診為H5亞型禽流感病毒感染的病雞，l只健康雞。用鼻咽拭子分別對(duì)2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例1制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取RNA分別收集鼻咽拭子，用0.2mol/LpH7.4的磷酸鹽緩沖液在離心管中反復(fù)涮洗拭子棉簽，取出棉簽，5000rpm離心lmin，取上清，得到2只雞的檢測(cè)液。提取RNA的具體操作如下在離心管中加入0.25mL檢測(cè)液和0.75mLTRIzolLSReagent,劇烈振蕩，室溫放置5min;加入200uL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置10min后，4。C下12000g離心15min，將上層水相轉(zhuǎn)入新離心管;在水相中加入等體積異丙醇，室溫沉淀10min后，4。C下12000g離心10min，吸棄上清，加入lmL75%乙醇，輕輕振搖后，4°C下7500g離心5min;將沉淀自然風(fēng)干后，溶于20uL無(wú)核酸酶的蒸餾水中，并加0.5uLRNase抑制劑(30U/uL)，所制備RNA應(yīng)立即進(jìn)行檢測(cè)或貯存于-8(TC備檢。二、H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)分別對(duì)上述2只雞的RNA樣本的進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到病雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2ixL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置90分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入1nL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例5、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩只雞，1只確診為H5亞型禽流感病毒感染的病雞，l只健康雞。用鼻咽拭子分別對(duì)2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例2制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)分別對(duì)上述2只雞的RNA樣本的進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本的檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2"L步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在金屬浴鍋上65'C放置70分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入2yL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例6、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩只雞，1只確診為H5亞型禽流感病毒感染的病雞，l只健康雞。用鼻咽拭子分別對(duì)2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例3制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)分別對(duì)上述2只雞的RNA樣本的進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本的檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置50分鐘，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入3iiL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例7、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩只雞，1只確診為H5亞型禽流感病毒感染的病死雞，l只健康雞。用鼻咽拭子分別對(duì)2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例1制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)分別對(duì)上述2只雞的RNA樣本的進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23iiL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23uL的L層P反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2iiL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65。C放置30分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8CTC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測(cè)-在每個(gè)反應(yīng)管中加入3"L熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例8、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用取兩只雞，1只確診為H5亞型禽流感病毒感染的病死雞，l只健康雞。用鼻咽拭子分別對(duì)2只雞進(jìn)行采樣。采用實(shí)施例1制備的試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)分別對(duì)上述2只雞的RNA樣本的進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到病雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到健康雞的RNA樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23"L的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上6(TC放置20分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到9(TC反應(yīng)2min,取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入3uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。健康雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色，病雞檢測(cè)組的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。實(shí)施例9、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用制備0.5Xl()4拷貝/uL、0.5Xl()3拷貝/uL、0.5X102拷貝/uL、5拷貝/uL和0.5拷貝/uL含H5亞型HA基因的質(zhì)粒樣本。采用實(shí)施例3制備的試劑盒對(duì)質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測(cè)。一、質(zhì)粒的制備使用A/Goose/QFY/HLJ/04(H5N1)毒株RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增得到此毒株的HA基因片段。再與T載體連接后即得到含HA基因的質(zhì)粒，一個(gè)質(zhì)粒分子對(duì)應(yīng)一個(gè)拷貝的HA基因。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，在合適的條件下培養(yǎng)感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)?？呻S著感受態(tài)細(xì)胞的繁殖而復(fù)制。最后從感受態(tài)細(xì)胞中提取純化HA基因質(zhì)粒。得到的質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)分光光度計(jì)法測(cè)定并計(jì)算拷貝數(shù)濃度。用雙蒸水將質(zhì)粒稀釋到所需要的濃度，即0.5Xl()4拷貝/uL、0.5Xl()3拷貝/yL、0.5X102拷貝/uL、5拷貝/wL禾tl0.5拷貝/yL。檢測(cè)時(shí)加入各濃度質(zhì)粒2uL，每個(gè)反應(yīng)中對(duì)應(yīng)含有104拷貝/nL、1()3拷貝/yL、1()2拷貝/uL、10拷貝/uL、l拷貝/yL的質(zhì)粒樣本。(可參考《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版,所需要的試劑和儀器均為市面可購(gòu)買(mǎi)的。)二、H5N1亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用分別對(duì)上述各濃度的質(zhì)粒樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下-(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X104拷貝/uL的質(zhì)粒樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23wL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5Xl()3拷貝/uL質(zhì)粒樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5X102拷貝/tiL質(zhì)粒樣本，作為檢測(cè)組3;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到5拷貝/uL質(zhì)粒樣本，作為檢測(cè)組4;在3支裝有23iiL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到0.5拷貝/uL質(zhì)粒樣本，作為檢測(cè)組5;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65t:放置50分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8(TC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。檢測(cè)組l的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測(cè)組2的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測(cè)組3的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測(cè)組4的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，檢測(cè)組5的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入3yL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。檢測(cè)組1的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測(cè)組2的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測(cè)組3的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測(cè)組4的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色，檢測(cè)組5的三個(gè)反應(yīng)管均為黃色。實(shí)施例IO、H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用提取以下病毒的RNA，采用實(shí)施例3制備的試劑盒對(duì)病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)A/duck/HongKong/698/79(H5N3)、A/shorebird/Delaware/230/2000(H5N4)、A/mallard/麗/105/2000(H5N5)。一、提取RNA同實(shí)施例4的步驟一。二、H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)對(duì)上述H5N3、H5N4、H5N5亞型的RNA樣本的進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下(1)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增在3支裝有23ixL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2yL步驟一得到H5N3的RNA樣本，作為檢測(cè)組l;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到H5N4的RNA樣本，作為檢測(cè)組2;在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL步驟一得到H5N5的RNA樣本，作為檢測(cè)組3;在3支裝有23yL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL陽(yáng)性對(duì)照，作為陽(yáng)性對(duì)照組；在3支裝有23uL的LAMP反應(yīng)液的反應(yīng)管中各加入2uL滅菌雙蒸水，作為陰性對(duì)照組。上述反應(yīng)管同時(shí)在水浴鍋上65。C放置50分鐘，調(diào)水浴鍋溫度到8CTC反應(yīng)10min，取出。(2)直接檢視結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管均為澄清液體。檢測(cè)組l、2、3的三個(gè)反應(yīng)管均有白色沉淀。(3)顯色檢測(cè)在每個(gè)反應(yīng)管中加入3uL熒光顯色劑。結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均變?yōu)榫G色，陰性對(duì)照組的三個(gè)反應(yīng)管的顏色均為黃色。檢測(cè)組l、2、3的三個(gè)反應(yīng)管均變?yōu)榫G色。結(jié)果表明，本發(fā)明的試劑盒可應(yīng)用于各種H5亞型禽流感的檢測(cè)。序列表〈110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)<120〉一種H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用〈130〉CGGNARY81638〈160〉7〈210〉1〈211〉1706<212>DNA<213〉H5亞型禽流感病毒(H5SubtypeAvianInfluenzaVirus)〈400〉1agtgcttcttcttgc犯tagtcagtcttgttaaaagtgatcagatttgca60ttggttaccatgcaaacaactcgacagagc3ggttg6lC3Caataatggaaaagaacgtta120ctgttacacatgcccaagaccggg^gctctgcgatctag1803tgg3gtg^gcctctaattgtagtgtagctggatggctcctcggaaacc240ctatgtgtgacgaattcatc感g(shù)tgccggaatggtcttacatagtgg站33ggCC3gtC300cagccaa/tgacctctgttaccc鄉(xiāng)ggatttc肌cgact3tgaagaactgaaacacctat360tg3gC3g肌taaacwttttg3g犯^ttCagatcatccccaaaagttcttggtccaatc420atgaagcctc3tceiggggtgagctcagcatgtccataccaggggaagtcctcctttttca■gaaatgtggtatggcttatcgtacatacccaacaat肌ag540ataataccaacca^ga3gatcttttggtactgtgggggattcaccatcct組gatgcgg600cag3gc3g3caaagctctatcaaaacccaaccacctatatttccgttgggacatcaacac660ta犯cca^gattggtaccaaaaatagctactagatccaaagtaaacgggcaaagtggaa720gaatgg服ttcttctggacaattttaaagcCg犯tg3tgCtatcaacttcg卿gt肌tg780gaaatttcattgctccagaatatgcatacaaa3ttgtc3agaaaggggactcagcaatta840tg犯aagtg3attggaatatggt犯ctgcaac8cca^a_tgtcaaactccaatgggggcga■taaactctagtatgccattcaccctctcaccstcgggg肌tgccccaaat960atgtga肌tcgtccttgcgacagggctcagaaatagccctcaaagagaga1020gaagaagaaacta/tttggagctatagcaggttttatagaggg3gg3tggC1080鄉(xiāng)g肌tggt卿tggttggtatgggtaccaccatagc6iatg叫caggggagtggatacg1140ctgcagacMagaatccacttagatggeigtcaccaataaggtcaactcgei1200tcattgaca^aatgaacactCELgtttg站gccgttggaagggaatttaataactt3g6ia^1260gg卿at卿aaga卿tggaagacggattcctagatgtctggacttata1320atgctgaacttctggttctcatggaaaatgagagaactctagacttccatgactcaaatg1380tcaagaacctttacgacaaggtccgactacagcttagggataatgcaaaggagctgggta1440acggttgtttcgagttctatcacaaatgtgataatgaatgtatggaaagtgtaagaaacg1500gaacgtatgactacccgcagtattcagaagaagcaagactaaacagagaggaaataagtg1560gagtaaaattggaatcaataggaacttaccaaatactgtcaatttattcaacagtggcga1620gttccctagcactggcaatcatggtggctggtctatctttatggatgtgctccaatggat1680cgttacaatgcagaatttgcatttaa1706〈210〉2<211>23〈212〉DNA<213>人工序列〈400>2gtg8attgg33t3tggt6iEictgc23<210>3<211>18<212〉DNA〈213〉人工序列<400〉3ccattccctgccatcctc18<210>4〈211〉42〈212>DNA〈213〉人工序列〈400〉4cgstggtg3gagggtg城gttttcaaactccaatgggggeg42<210>5〈211〉46<212>DNA<213>人工序列〈400〉5cttgcgacagggctcagaaattttctgctatagctccaaatagtcc46〈210〉6〈211〉22〈212〉DNA<213>人工序列<400>6tgtggaatggcatactagagtt22〈210〉7〈211〉18<212〉腿〈213〉人工序列<400〉7agccctcaaggagagaga18權(quán)利要求1、一種H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，包括三對(duì)引物，一對(duì)引物是與禽流感H5N1病毒GenBankAccessionNumberAY653200中HA基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與禽流感H5N1病毒GenBankAccessionNumberAY653200中HA基因結(jié)合的外側(cè)引物對(duì)，一對(duì)引物是與禽流感H5N1病毒GenBankAccessionNumberAY653200中HA基因結(jié)合的環(huán)形引物對(duì)。2、如權(quán)利要求l所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列4，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列5;所述外側(cè)引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列2，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列3;所述環(huán)形引物對(duì)包括上游引物和下游引物，上游引物的核苷酸序列是序列表中的序列6，下游引物的核苷酸序列是序列表中的序列7。3、如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照；所述陽(yáng)性對(duì)照為H5亞型禽流感病毒RNA。4、如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑為含有如下溶質(zhì)的水溶液Tris-HC1、KC1、(NH4)2S04、Tween20、MgS04、甜菜堿、脫氧核苷酸、BstDNA聚合酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶。5、如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中加入所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)、所述外側(cè)引物對(duì)及所述環(huán)形引物對(duì)，形成環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液；每23uL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述溶質(zhì)的物質(zhì)的量如下Tris-HC10.5umo1、KC10.25umol、(NH4)2S040.25timol、Tween200.025uL、MgS040.2ixmol、甜菜堿20umol、4種脫氧核苷酸各0.035umol、BstDNA聚合酶16U、AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.2U，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.04-0.06nmol，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.004-0.008umol，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物各0.02-0.04nmol;每23ixL所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液中，所述內(nèi)側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物優(yōu)選0.04iimo1，所述外側(cè)引物對(duì)的上游引物和下游引物優(yōu)選0.004umo1，所述環(huán)形引物對(duì)的上游引物和下游引物優(yōu)選0.02umol。6、如權(quán)利要求1至5中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括熒光顯色劑。7、如權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述熒光顯色劑為熒光染料SYBRGREENI。8、如權(quán)利要求6或7所述的試劑盒，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液與所述熒光顯色劑的體積比為23:(1-3)，優(yōu)選23:1。9、一種檢測(cè)死亡動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒的方法，是用權(quán)利要求l至8中任一所述的試劑盒對(duì)來(lái)自死亡動(dòng)物的樣品的總RNA進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定死亡動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒；所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的條件為60-65°C、20-90分鐘。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述檢測(cè)死亡動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒的方法中還包括將進(jìn)行完所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的樣本80-9(TC反應(yīng)2-10分鐘的步驟。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括三對(duì)引物，即與禽流感H5N1病毒HA基因結(jié)合的內(nèi)側(cè)引物對(duì)、外側(cè)引物對(duì)和環(huán)形引物對(duì)。試劑盒還包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、和熒光顯色劑，陽(yáng)性對(duì)照為H5亞型禽流感病毒RNA。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)動(dòng)物中是否攜帶H5亞型禽流感病毒的方法。本發(fā)明的H5亞型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)靈敏度高，6-10個(gè)拷貝即可檢測(cè)出目的RNA，操作簡(jiǎn)單方便，特別適于基層現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的病原檢測(cè)及動(dòng)物食品中可能污染的H5亞型禽流感病毒的檢測(cè)。文檔編號(hào)C12Q1/70GK101381781SQ20081022307公開(kāi)日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年9月26日優(yōu)先權(quán)日2008年9月26日發(fā)明者吳文學(xué),黃書(shū)林申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)