專利名稱：：流感/人禽流感病毒檢測基因芯片及制作方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種基因芯片檢測技術(shù)，尤其涉及一種流感/人禽流感病毒檢測基因芯片及其制作方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：流感病毒基因組由8條負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成，根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的不同分為A型、B型、C型。其中，A型流感病毒根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個HA亞型和9個NA亞型；B型和C型流感病毒不分亞型。A型常引起世界性大流行；B型、C型則以局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。我國是流感多發(fā)地，H1N1亞型、H3N2亞型及B型流感病毒是目前我國主要的季節(jié)性流感病毒流行株，并且H1N1亞型也是1918年西班牙流感和1977年俄羅斯流感病毒株，H3N2亞型為1968年香港流感病毒株。歷史上，這三次流感大流行都不同程度的對人類生命造成威脅，特別是1918年的西班牙流感，造成全世界死亡人數(shù)2100萬，是人類現(xiàn)代史上最大的瘟疫之一。而且在1993年荷蘭出現(xiàn)由豬(H3N2)與禽(H1N1)病毒重配株感染2名兒童。H5N1和H9N2禽流感病毒直接感染人分別于1997年和1998年首發(fā)于我國香港特別行政區(qū)和廣東省。而且H5N1病毒仍在全球范圍，尤其是亞洲地區(qū)肆虐。20032007年，H5N1高致病性禽流感已造成全球359人感染，239人死亡，我國感染30人，死亡20人，63%以上的致死率嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。禽流感病毒具有高度的遺傳變異性和基因重配能力，若長期在人群中引起感染，就可能發(fā)生病原性變異成為人體對其無免疫能力的新毒株，或是與人流感病毒發(fā)生基因重配，獲得對人的致病性和在人間傳播的能力。因此，及早發(fā)現(xiàn)并確診人禽流感病毒對防控人禽流感疫情蔓延至關(guān)重要?，F(xiàn)有技術(shù)中，采用的禽流感病毒檢測方法有以下幾種一種是世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的雞胚病毒分離培養(yǎng)方法，靈敏度高，但操作費時，需3周時間，而且對實驗室的要求也比較高。另一種是血清學(xué)方法，包括血凝、血凝抑制試驗、瓊脂擴散試驗、微量中和試驗、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗和ELISA等，不能高通量處理樣本，而且抗體檢測結(jié)果僅能說明被檢對象曾感染過流感病毒，不能準(zhǔn)確反映當(dāng)前是否感染或攜帶病毒。血清學(xué)的診斷還存在滯后性，主要用于流行病學(xué)分析和回顧性診斷，對人禽流感的預(yù)防沒有實際意義。上述現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下缺點檢測時間長、檢測準(zhǔn)確性低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種檢測時間短、檢測準(zhǔn)確性高的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片及其制作方法和應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，包括固相載體，所述固相載體的表面固定有多條寡核苷酸探針，所述多條寡核苷酸探針可與待檢樣品進行雜交反應(yīng)；所述多條寡核苷酸探針按功能分，包括以下一種或多種探針A型流感病毒特異性探針；B型流感病毒特異性探針；H1N1亞型流感病毒特異性探針；H3N2亞型流感病毒特異性探針；H5N1亞型流感病毒特異性探針；H9N2亞型流感病毒特異性探針；高致病性鑒別探針。本發(fā)明的上述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的制作方法，包括步驟首先，在寡核苷酸探針合成時，首先在5'端加入15個T的延伸，并在所述5'端進行氨基化修飾；然后，利用自動點樣系統(tǒng)在固相載體上完成全部點樣，制成基因芯片；最后，利用O.10.3y。SDS洗滌液洗滌未與所述固相載體共價結(jié)合的探針，并用NaBH4封閉液封閉所述固相載體上未與所述寡核苷酸探針結(jié)合的醛基。本發(fā)明的上述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的應(yīng)用，用于檢測以下一種或多種流感/人禽流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、mNl亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒、H5N1亞型流感病毒、H9N2亞型流感病毒。由上述本發(fā)明提供的技術(shù)方案可以看出，本發(fā)明所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片及其制作方法和應(yīng)用，由于固相載體的表面固定有多條寡核苷酸探針，可以通過寡核苷酸探針與A型、B型、H1N1亞型、H3N2亞型、H5N1亞型、H9N2亞型等流感病毒的基因進行雜交反應(yīng)，區(qū)分流感/人禽流感病毒的型別，檢測時間短、檢測準(zhǔn)確性高。具體實施例方式本發(fā)明的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，其較佳的具體實施方式是，包括固相載體，固相載體的表面固定有多條寡核苷酸探針，多條寡核苷酸探針可與待檢樣品進行雜交反應(yīng)，用于區(qū)分流感/人禽流感病毒的類別。其中，固相載體可以是醛基化的玻片載體，也可以選用其它的固相載體。多條寡核苷酸探針按功能分，可以包括以下一種或多種探針A型流感病毒特異性探針；B型流感病毒特異性探針；H1N1亞型流感病毒特異性探針；H3N2亞型流感病毒特異性探針；H5N1亞型流感病毒特異性探針；H9N2亞型流感病毒特異性探針；高致病性鑒別探針。還可以包括其它的探針等。多條寡核苷酸探針的5'—3'序列及其檢測的靶基因片段分別如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>32TCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGAT2533GATTATGCCTCCCTTAGGTCACTA2434TACTTTTGATTAACAGCACAGGGAA2535AATGTACCAGAGAAACAAACTAGAG2536AACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCT2337TATTGGGAGACCCTCAGTGTGATG2438GAAAGCTTCAATTGGACTGG2039ATGAGATCAGATGCACCCATT2140AGGCATCAAAATTCTGAGGG2041GAGGCATATTCGGCGCAATCGC2242TGCCTGCATAGGGTCAATCAGAAAT2543TGTGATGGCTTCCAAAATAA2044CAAATACCCAGCATTGAACGT2145TTCTGAATGCATCACTCCAAATGG2446ACAGGACAAGCAGCAGATCTTAAAA2547AATATGCGACAGTCCTCATCAGA2348CAGCAACTGTTACCCTTATGATGTG2549_CAAACTGTAATCCCGAATATCG_^^^AGTTGTCACGATGGAAAAGCATGG51GATGGAAATGACGTGTGGATGG2252GTGGACCTCAAACAGTATTGT2153AAAATGCAACTGCTAGCTTCAT2254、，AGATGGGAAGAACGATCAGCGAG2255ATTGTTGTGTTTTGTGGCAC2256ATCCTCGATATCCTGGTGTCAGAT2457CTGTTGAAGGCAAAAGCTGCATCA2458CTTGTTGGAGACACACCCAGAAAA24_^_CATCAATCGGTGCTTTTATGT_^TAGTCCTCTCTTTTTTCTTCTTCTCTCT^61高致病TAGTCCTCTTTTTCTTCTTCTTTCT2562性TAGTCCTCTCTTTTTCCTTCTTCTCTCT2863_TAGTCCTCTCTTTTTCTTTCTTCTCTCT_^~^CATGCAAACAACTCGACAGAGCA65GAGCAGGTTGACACAATAATGGAAA2566CAATGACCTCTGTTACCCAGG2167CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTG2368HAATAAACTCTAGTATGCCATTCCACA25H5N169HACCTCTCACCATCGGGGAATG2070GGTCCGACTACAGCTTAGGGA2171GGTTGTTTCGAGTTCTATCACA2272AACGTATGACTACCCGCAGTATTCA2573_CCTCTATAAAACCTGCTATAGCTCC_^~~^TTCAGTAACATTAGCGGGCAATTCA75AGACAGAAGCCCTCACAGAACA2276NAAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGG2577TATAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATC25_2§_TTTTGTGGTGTAAATAGTGACA_^^CGCCCAATACACAAATAAT80HACAATGGGGTTTGCTGCCTTC2081_TTCTGGGCCATGTCCAATG_^~^GCAGAATACAAGAATTGGT1^",。83GATGGGAAAGCATGGTTACAT21H9N2n71"84ACTATGACACTACATTTCAAGCA2385NATGTGGACCAATCATAATAGAAAGGA2586CCTTTTAATGAATGAGTTGGGTGTT2587GATGGGAAAGCATGGTTACAT2188TCAGGTTATGAGACTTTCAGGGTCA2589AAATTCCAAACAGCAGCACAA2190CGGGGAGTCTTCGAGCTCTC2091CGAACCCGATCGTGCCTTC1992TCGGAGACAATGCAGAGGA19A93NPAGAATGTGCTCTCTGATGCAGGGCT2594TGGATCAAGTGAGAGAAAGTCGGAA2595GTGAGAGAAAGTCGGAACCCAGGAA2596CTGCAGTATCCAGTGGGTACGACTT2597GGAATGGATCCCAGAATGTGCTCTC2598AAGTGCTTATGAGAGAATGTGCAAC2599CCAATCATCAGACCAGCAACCCTT24100GAATGCCAGAGATGTCAAAGAAGGGAA27101ATAAAACCATCTACTTCAGCCCTAT25B102NPCCCTCTGTGGCGAGCAAAGTAGT23103AAATCGCAATTATTCTTCATGTCTT25104GGAACGAAGTAGGTGGAGACGGA23105ATGAATGACTCAATGGCTAAGAAAA25106ATTAAGCAGACCATCCCCAATTTCT25上表中，HA、NA、NP分別表示表面血凝素基因、神經(jīng)氨酸酶基因、核蛋白基因。多條寡核苷酸探針還可以包括兩種陽性參照探針和一種陰性參照探針，其中兩種陽性參照探針可以分別為點樣質(zhì)控探針和雜交質(zhì)控探針，可以分別作為基因芯片制備過程的監(jiān)控指標(biāo)和雜交、顯色系統(tǒng)的監(jiān)視指標(biāo)；一種陰性參照探針可以作為雜交過程中非特異新雜交的監(jiān)控指標(biāo)。多條寡核苷酸探針在固相載體上可以按下表所示的陣列排列<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>上表中，HEX、PC分別表示兩種陽性參照探針；NC表示一種陰性參照探針；BC為空白區(qū)，可以保留用于對環(huán)境因子或其它因子進行檢測等。陣列中的每條寡核苷酸探針可以分別重復(fù)24次，如重復(fù)3次等；每一塊固相載體上可以設(shè)有35個上述的陣列，如設(shè)有4個上述的陣列等。本發(fā)明的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片采用了寡核苷酸探針，可以根據(jù)需要調(diào)整和合成相應(yīng)序列，避免了天然核酸探針中存在的高度重復(fù)序列所帶來的不利影響。寡核苷酸探針序列短，為1928bp，降低了序列的復(fù)雜性，雜交所需時間較短，并可鑒別到單堿基的變異，雜交特異性高，在診斷病原體的準(zhǔn)確性方面具有優(yōu)越性。可以利用MUSCLEv3.6禾圼序禾口GenBank類女據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html)，設(shè)計禾口篩選用于檢測流感病毒的HA、NA和NP基因特異性的寡核苷酸探針，并設(shè)計了H5N1亞型流感病毒致病性鑒別探針。設(shè)計原則與標(biāo)準(zhǔn)為寡核苷酸探針位于亞型高度保守區(qū)(覆蓋率〉90%)，以保證探針的特異性和敏感性；同時探針與人基因組序列、雞基因組序列、其他人呼吸道病毒序列、雞呼吸道病毒序列，流感病毒非靶基因序列盡可能同源性低；Tm值為4259°C;GCy。為2575M;Haipin《4bp;PolyN《4bp。本發(fā)明的流感病毒探針設(shè)計可以由程序自動完成，實現(xiàn)批量化的探針設(shè)計，設(shè)計思路是類似窮舉的方法，將核酸序列內(nèi)全部滿足條件的探針序列一一列出進行比對，選擇最優(yōu)的探針用于芯片實驗，充分保證每條探針的特異性和靈敏度。本發(fā)明的上述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的制作方法，其較佳的具體實施方式是，包括步驟首先，在寡核苷酸探針合成時，可以先在5'端加入15個T的延伸，并在5'端進行氨基化修飾；然后，選用醛基化玻片或其它的材料作為固相載體，利用自動點樣系統(tǒng)在固相載體上完成全部點樣，制成基因芯片；最后，利用O.10.3MSDS洗滌液(如O.2%SDS)洗滌未與固相載體共價結(jié)合的探針，并用NaBH4封閉液封閉固相載體上未與寡核苷酸探針結(jié)合的醛基。本發(fā)明的上述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的應(yīng)用，其較佳的具體實施方式是，用于檢測以下一種或多種流感/人禽流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、H1N1亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒、H5N1亞型流感病毒、H9N2亞型流感病毒。利用基因芯片上的多條寡核苷酸探針通過檢測待檢流感/人禽流感病毒的以下至少一種基因血凝素HA基因、神經(jīng)氨酸酶NA基因、核蛋白NP基因，并根據(jù)檢測到的HA、NA或NP基因序列上的差異，區(qū)分流感/人禽流感病毒的型別。首先，可以利用一條通用引物將所述待檢流感/人禽流感病毒的病毒全基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;然后，可以利用通用引物進行單引物PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng))擴增病毒全基因，作為下一步基因芯片檢測的靶序列；通用引物5'—3'序列可以為AGCAAAAGCAGG。具體包括步驟利用核酸提取試劑從待檢流感/人禽流感病毒中提取流感病毒RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑和通用引物將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA—鏈；利用cDNA二鏈合成試劑，以cDNA—鏈為模板合成cDNA二鏈；利用PCR試劑和通用引物，以cDNA二鏈為模板進行單引物PCR擴增；利用標(biāo)記試劑和熒光素混合物對單引物PCR擴增的產(chǎn)物進行隨機引物熒光標(biāo)記；利用雜交試劑將標(biāo)記好的待檢樣品與流感/人禽流感病毒檢測基因芯片進行雜交；將雜交后的基因芯片進行掃描，區(qū)分流感/人禽流感病毒的型別。本發(fā)明在檢測待檢樣品時，首先提取待檢樣品總RNA，利用通用引物(5'-AGCAAAAGCAGG-3')將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(—鏈)，以cDNA(—鏈)為模板合成cDNA(二鏈)，再利用通用引物單引物PC時廣增cDNA，最后利用隨機引物標(biāo)記熒光素Cy3。帶有標(biāo)記的擴增產(chǎn)物與雜交液混合，經(jīng)變性加至基因芯片探針陣列之上，并保持在42"C雜交過夜。雜交完畢，按照離子強度由高到低的順序?qū)蛐酒礈?。利用芯片掃描儀讀取芯片的熒光信號強度，利用相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析軟件分析掃描結(jié)果，判定樣品病毒的亞型，達到對流感病毒鑒定的目的。本發(fā)明提供了102條用于鑒定流感病毒亞型的特異性寡核苷酸探針序列和4條用于致病性鑒別的寡核苷酸探針；并提供了這種基因芯片的制備方法；還提供了這種基因芯片在流感病毒快速檢測中的應(yīng)用。這種基因芯片克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，能夠在流感病毒的快速、準(zhǔn)確、高效地檢測、分型、診斷、傳染病監(jiān)測、流行病學(xué)調(diào)査、査明傳染病病原體種類及鑒定中應(yīng)用。這種基因芯片可大規(guī)模、高通量的對多種流感病毒進行檢測。具體實施例一人/禽流感病毒檢測寡核苷酸探針的設(shè)計與合成從GenBank的流感病毒資源數(shù)據(jù)庫(Influenzavirusresources,http:〃麗.ncbi.nlm.nih.gov/ge扁es/FUJ/FIU.html)中査找A型流感病毒的畫l、H3N2、H5N1和H9N2亞型的HA基因序列和NA基因序列，以及A、B型的NP基因序列，分別進行聯(lián)配，劃分出保守區(qū)，允許同一變異位點允許2個及2個以下簡并堿基，在保守區(qū)內(nèi)間隔lbp提取備選探針。將所提取的備選探針滿足以下要求進行篩選①探針長度L在1928bp之間；②Tm值在4259。C之間；③GC。/。在2575。/。之間；④polyN《4bp;⑤Hairpin《4bp;⑥覆蓋率〉90%;⑦進行BLAST篩選，特異性分?jǐn)?shù)〉LX0.4。最佳Tm值設(shè)定在47'C，最佳探針長度為25bp。如果有重疊的探針，在特異性和覆蓋率都相同的情況下，優(yōu)先選擇靠近最佳Tm和探針長度的位置。因為在檢測時采用的基片為醛基修飾的基片，為了提高探針在芯片上的延展性，故在探針末端人工添加15個T，并且在探針末端進行5'-Ami「io.linkerC6修飾。具體實施例二流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的制備醛基化玻片購自博奧芯片公司，并在博奧芯片公司制備芯片。將各個探針用ddlI20稀釋至40ymol/L，待用。點樣時，寡核苷酸探針用2X點樣液稀釋至終濃度20umol/L，取10yL轉(zhuǎn)移到384孔板。利用點樣系統(tǒng)將探針點到醛基化芯片上，點直徑160um，點間距300um。點樣后芯片于37。C濕盒中放置12h以上水合，然后芯片用洗滌液(0.2%SDS)洗滌后在封閉液(NaBH4溶液)中封閉5min后用水清洗，離心甩干。具體實施例三本發(fā)明檢測未知病毒的應(yīng)用舉例步驟l、病毒RNA的提取取病毒采樣液200nL，加入600pL裂解液，按RNeasyMiniKit(Qiagen公司，catalog#74104)說明書提取病毒RNA。步驟2、病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA(—鏈)反轉(zhuǎn)錄與cDNA—鏈合成步驟采用M-MLVRTasecDNASynthesisKit(TaKaRa公司，catal。g恥6130)20yL反轉(zhuǎn)錄體系ViralRNA咖L5XlstSt擺dSynthesisBuffer帆■PMix(lOmMeach)lul,RNaseInhibitor(20U/叱)0.IPLUF12(10uM)肌M-MLV(200U/叱)1ft反應(yīng)條件室溫放置10min，42。C反應(yīng)60min，冰浴2min。步驟3、病毒cDNA(二鏈)的合成反應(yīng)體系1st-strandcDM20HL5X2ndStrandSynthesisBuffer20PLdNTPMixture(10mMeach)E.c。li脆PolymeraseI(20U/叱)2現(xiàn)E.c。liRNaseH/E.coliDNALigaseMixture2叱RNase-freeH204亂反應(yīng)條件輕輕混勻，瞬時離心，16'C反應(yīng)2h，70。C加熱10min;35cycles加入機T4DKAPolymerase(1UM.)，輕輕攪拌，37。C反應(yīng)l()min;加入15叱0.25MEDTA(pH8.0)以及15)4」的l()y。SDS溶液，停止反應(yīng)。歩驟4、純化按照NucleoSpinExtractII(MACHEREY-NAGEL，catalogtt740609)說明書純化。歩驟5、單引物PCR擴增擴增體系10XExTaqPCRBuffer2.5uLdNTPMix(lOmM)1uLUF12(IOuM)luLExTaqPolymerase(511/uU0.5yLDouble-Strandedc腿20uL擴增條件94°C5min94°C30s卡40°C30s50°C30s」72°Clmin72°C7min步驟6、純化同步驟4。步驟7、濃縮6(TC真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至14.3uL。步驟8、隨機引物標(biāo)記PCR產(chǎn)物14.3wLrandomprimer4yL95'C變性3min，冰浴5min。10Xkle麗buffer2.5uLdNTP(2.4:1.2)2.5uLcy3-dCTP0.5uLklenow1.2tiL37'C反應(yīng)90min，70。C變性5min，冰浴5min。純化同步驟4。,濃縮6(TC真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至7.4uL。,配制雜交體系甲酰胺一25%甲酰胺4wL20XSSC—3XSSC2.4uL10%SDS—0.2%SDS0.32uL50XDenh虹dt's—5XDenhardt's1.6u1>步驟9、步驟IO步驟ll濃縮的標(biāo)記產(chǎn)物7.4"L外標(biāo)0.28uL95'C變件3rain,冰浴5min步驟12、芯片雜交將16PL雜交體系轉(zhuǎn)移至芯片反應(yīng)區(qū)，蓋蓋片，芯片置于雜交盒中，浸入42'C水浴中，反應(yīng)過夜。步驟13、雜交后洗滌雜交后芯片依次在洗液I(4L體積含有400mL20XSSC、80mL10%SDS)、洗液II(4L體積含有40mL20XSSC)中于室溫各洗滌4min，離心甩干。步驟14、芯片掃描與分析用芯片掃描儀LuxScanlOK-A掃描基因芯片，選用綠色通道，設(shè)定激光強度為95，PMT為800，其它為默認(rèn)值。掃描結(jié)果存為TIFF格式的文件。利用LuxScan3.0軟件提取數(shù)據(jù)。根據(jù)熒光信號出現(xiàn)的強度和位置即可判別樣品病毒的種類。確定此基因芯片判讀標(biāo)準(zhǔn)如下(1)陽性探針判讀標(biāo)準(zhǔn)背景信號值+4SD作為每條型別檢測探針的Cutoff值；背景信號值+3SD作為4條致病力鑒別探針的Cutoff值。(2)陽性探針組判讀標(biāo)準(zhǔn)亞型探針組陽性率》40%確定為陽性，在20%40%之間為疑似陽性，需重新實驗驗證，避免漏檢，陽性率《20%，確定為陰性探針組；A、B型探針組陽性率》20%為陽性，10%~20%為疑似陽性，《10%確定為陰性。(3)芯片結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)利用Fisher檢驗，給出置信度P-value，檢驗通過以上標(biāo)準(zhǔn)得到的陽性探針組中陽性探針率同其他陰性探針組的陽性探針率的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，判讀此張芯片的陽性結(jié)果。本發(fā)明的基因芯片將大量寡核苷酸探針通過點樣系統(tǒng)固定于固相載體上，形成高密度的DNA微陣列，以熒光標(biāo)記的樣品DNA片段，借助堿基互補雜交的原理對樣品的序列信息進行高效解讀和分析。流感病毒的特點是其抗原性持續(xù)不斷地發(fā)生變異，利用基因芯片具有并行性、高通量、大規(guī)模的特點，在檢測流感病毒方面具有三方面優(yōu)勢(1)同時檢測多種病毒，避免了現(xiàn)有技術(shù)(如RT-PCR)檢測的單一性；(2)相同基因型的不同毒株得到不同的雜交結(jié)果，為亞型確定提供充分依據(jù)；(3)應(yīng)用多種型別檢測探針能夠及時發(fā)現(xiàn)重配株。因此，基因芯片在流感病毒感染的分子診斷方面前景廣闊。本發(fā)明將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于流感病毒，特別是人禽流感病毒檢測領(lǐng)域，制備了能通過一次檢測診斷多種病原的檢測基因芯片，從而有效解決了現(xiàn)有檢測技術(shù)不能一次試驗同時檢測多種亞型流感病毒的問題，實現(xiàn)了所需樣品量少、靈敏、特異、快速、準(zhǔn)確的檢測流感病毒。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權(quán)利要求1、一種流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，其特征在于，包括固相載體，所述固相載體的表面固定有多條寡核苷酸探針，所述多條寡核苷酸探針可與待檢樣品進行雜交反應(yīng)；所述多條寡核苷酸探針按功能分，包括以下一種或多種探針A型流感病毒特異性探針；B型流感病毒特異性探針；H1N1亞型流感病毒特異性探針；H3N2亞型流感病毒特異性探針；H5N1亞型流感病毒特異性探針；H9N2亞型流感病毒特異性探針；高致病性鑒別探針。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，其特征在于，所述多條寡核苷酸探針的5'—3'序列及其檢測的靶基因片段分別如下表所示<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>34TACTTTTGATTAACAGCACAGGGAA2535AATGTACCAGAGAAACAAACTAGAG2536AACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCT2337TATTGGGAGACCCTCAGTGTGATG2438GAAAGCTTCAATTGGACTGG2039ATGAGATCAGATGCACCCATT2140AGGCATCAAAATTCTGAGGG2041GAGGCATATTCGGCGCAATCGC2242TGCCTGCATAGGGTCAATCAGAAAT2543TGTGATGGCTTCCAAAATAA2044CAAATACCCAGCATTGAACGT2145TTCTGAATGCATCACTCCAAATGG2446ACAGGACAAGCAGCAGATCTTAAAA2547AATATGCGACAGTCCTCATCAGA2348CAGCAACTGTTACCCTTATGATGTG2549_CAAACTGTAATCCCGAATATCG_~^AGTTGTCACGATGGAAAAGCATGG51GATGGAAATGACGTGTGGATGG2252GTGGACCTCAAACAGTATTGT2153AAAATGCAACTGCTAGCTTCAT2254NAGATGGGAAGAACGATCAGCGAG2255ATTGTTGTGTTTTGTGGCAC2256ATCCTCGATATCCTGGTGTCAGAT2457CTGTTGAAGGCAAAAGCTGCATCA2458CTTGTTGGAGACACACCCAGAAAA24_55_CATCAATCGGTGCTTTTATGT_^^TAGTCCTCTCTTTTTTCTTCTTCTCTCT^61高致病TAGTCCTCTTTTTCTTCTTCTTTCT2562性TAGTCCTCTCTTTTTCCTTCTTCTCTCT2863_TAGTCCTCTCTTTTTCTTTCTTCTCTCT_^~CATGCAAACAACTCGACAGAGCA^65GAGCAGGTTGACACAATAATGGAAA2566CAATGACCTCTGTTACCCAGG2167CAGATCATCCCCAAAAGTTCTTG2368HAATAAACTCTAGTATGCCATTCCACA25H5N169HACCTCTCACCATCGGGGAATG2070GGTCCGACTACAGCTTAGGGA2171GGTTGTTTCGAGTTCTATCACA2272AACGTATGACTACCCGCAGTATTCA2573_CCTCTATAAAACCTGCTATAGCTCC_~^TTCAGTAACATTAGCGGGCAATTCA75AGACAGAAGCCCTCACAGAACA2276NAAGTCTGAATGTGCATGTGTAAATGG2577TATAGCGGGAGTTTTGTCCAGCATC25_2§_TTTTGTGGTGTAAATAGTGACA_^^CGCCCAATACACAAATAAT1^80HACAATGGGGTTTGCTGCCTTC2081_TTCTGGGCCATGTCCAATG_~^GCAGAATACAAGAATTGGT1^tt一83GATGGGAAAGCATGGTTACAT21"丄、厶84ACTATGACACTACATTTCAAGCA2385NATGTGGACCAATCATAATAGAAAGGA2586CCTTTTAATGAATGAGTTGGGTGTT2587GATGGGAAAGCATGGTTACAT21_^_TCAGGTTATGAGACTTTCAGGGTCA_^AAATTCCAAACAGCAGCACAA90CGGGGAGTCTTCGAGCTCTC20<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上表中，HA、NA、NP分別表示表面血凝素基因、神經(jīng)氨酸酶基因、核蛋白基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，其特征在于，所述多條寡核苷酸探針還包括兩種陽性參照探針和一種陰性參照探針；所述兩種陽性參照探針分別為點樣質(zhì)控探針和雜交質(zhì)控探針，分別作為所述基因芯片制備過程的監(jiān)控指標(biāo)和雜交、顯色系統(tǒng)的監(jiān)視指標(biāo)；所述一種陰性參照探針作為雜交過程中非特異新雜交的監(jiān)控指標(biāo)。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，其特征在于，所述多條寡核苷酸探針按下表所示陣列排列<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>上表中，HEX、PC分別表示所述兩種陽性參照探針；NC表示所述陰性參照探針；BC為空白區(qū)。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片，其特征在于，所述陣列中的每條寡核苷酸探針分別重復(fù)24次；所述固相載體為醛基化的玻片載體，每一塊所述固相載體上設(shè)有35個所述陣列。6、一種權(quán)利要求l至5任一項所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的制作方法，其特征在于，包括歩驟首先，在寡核苷酸探針合成時，首先在5'端加入15個T的延伸，并在所述5'端進行氨基化修飾；然后，利用自動點樣系統(tǒng)在固相載體上完成全部點樣，制成基因芯片；最后，利用O.10.3。/。SDS洗滌液洗滌未與所述固相載體共價結(jié)合的探針，并用NaBH4封閉液封閉所述固相載體上未與所述寡核苷酸探針結(jié)合的醛基。7、一種權(quán)利要求l至5任一項所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的應(yīng)用，其特征在于，用于檢測以下一種或多種流感/人禽流感病毒A型流感病毒、B型流感病毒、H1N1亞型流感病毒、H3N2亞型流感病毒、H5N1亞型流感病毒、H9N2亞型流感病毒。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的應(yīng)用，其特征在于，所述基因芯片上的多條寡核苷酸探針通過檢測待檢流感/人禽流感病毒的以下至少一種基因血凝素HA基因、神經(jīng)氨酸酶NA基因、核蛋白NP基因，并根據(jù)所述HA、NA或NP基因序列上的差異，區(qū)分所述流感/人禽流感病毒的型別。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的應(yīng)用，其特點在于，包括首先，利用一條通用引物將所述待檢流感/人禽流感病毒的病毒全基因組RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;然后，利用所述通用引物進行單引物PC財廣增所述病毒全基因，作為下一步基因芯片檢測的耙序列；所述通用引物5'—3'序列為AGCAAAAGCAGG。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的流感/人禽流感病毒檢測基因芯片的應(yīng)用，其特點在于，具體包括步驟利用核酸提取試劑從所述待檢流感/人禽流感病毒中提取流感病毒RNA;利用反轉(zhuǎn)錄試劑和所述通用弓I物將所述脂A反轉(zhuǎn)錄成cDNA—鏈；利用cDNA二鏈合成試劑，以所述cDNA—鏈為模板合成cDNA二鏈；利用PCR試劑和所述通用引物，以所述cDNA二鏈為模板進行所述單引物PCR擴增；利用標(biāo)記試劑和熒光素混合物對所述單引物PC財廣增的產(chǎn)物進行隨機引物熒光標(biāo)記；利用雜交試劑將標(biāo)記好的待檢樣品與所述流感/人禽流感病毒檢測基因芯片進行雜父；將雜交后的基因芯片進行掃描，區(qū)分所述流感/人禽流感病毒的型別。全文摘要本發(fā)明公開了一種流感/人禽流感病毒檢測基因芯片及其制作方法和應(yīng)用，公開了102條用于檢測A型、B型、H1N1亞型、H3N2亞型、H5N1亞型、H9N2亞型流感病毒的探針和4條高致病性鑒別探針，并公開了從樣品處理、雜交、洗脫、芯片判讀的過程，可同時對上述6種病毒進行檢測、分型或鑒定，并能鑒別病毒的高致病性。本發(fā)明不僅大大縮短流感病毒的檢測時間，且提高了檢測準(zhǔn)確率，為臨床診斷、檢驗檢疫等領(lǐng)域的流感疫情早期預(yù)警機制提供了可行的技術(shù)支持。文檔編號C12Q1/70GK101392302SQ200810223269公開日2009年3月25日申請日期2008年9月28日優(yōu)先權(quán)日2008年9月28日發(fā)明者劉宏生,舒躍龍,菲賈,高榮保申請人:中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所;遼寧大學(xué)