專利名稱：：木霉sc9及利用木霉sc9制備耐冷木聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種木霉及利用這種木霉制備耐冷木聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
：木聚糖酶(EC.3.2丄8)能夠以內(nèi)切方式作用于木聚糖主鏈的^4，4-木糖苷鍵產(chǎn)生不同聚合度的木寡糖和少量木糖，是木聚糖降解酶中最關(guān)鍵的酶，可廣泛應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化、食品、飼料、醫(yī)藥、能源、造紙、紡織等行業(yè)。近幾十年來，木聚糖酶的應(yīng)用潛力一直為眾多的研究者所關(guān)注。國(guó)內(nèi)外對(duì)木聚糖酶的研究已比較深入，從菌種篩選、誘導(dǎo)產(chǎn)酶、酶的分離純化、酶學(xué)特性以及木聚糖酶基因的克隆與表達(dá)等方面都有大量報(bào)道。這些報(bào)道中，關(guān)于中溫和高溫微生物產(chǎn)木聚糖酶的比較多，但是關(guān)于低溫微生物產(chǎn)木聚糖酶的研究還很少。在低溫條件下具有生長(zhǎng)適應(yīng)能力的微生物都可以稱為低溫微生物，廣泛分布于寒冷環(huán)境中，包括高山地區(qū)、深海海區(qū)、南北兩極、冰川、淡水湖泊以及冷凍食物。Morita把低溫微生物化分為兩類嗜冷菌(Psychrophiles)和耐冷菌(Psychrotrophs)。能在低溫條件下生長(zhǎng)，在05。C可生長(zhǎng)繁殖，但最適生長(zhǎng)溫度>20r的微生物，稱為耐冷菌。低溫微生物的研究在近年得到較大發(fā)展，其所產(chǎn)生的低溫酶(Cold-adaptedenzymes)備受關(guān)注。低溫酶的i^值較低，對(duì)底物的親合力較強(qiáng)，提高了對(duì)底物的利用效率。這類酶催化反應(yīng)最適溫度較低，可以節(jié)約能源，適合低溫長(zhǎng)時(shí)的工藝過程，另外低溫下的酶反應(yīng)也可提高一些產(chǎn)品的質(zhì)量。低溫環(huán)境下的纖維質(zhì)材料特別是半纖維的生物降解，主要是由微生物產(chǎn)生的耐冷木聚糖酶引起?，F(xiàn)有已報(bào)道的可用于制備耐冷木聚糖酶的主要微生物有青霉、產(chǎn)黃細(xì)菌和酵母菌。Inglis等(InglisGD，PoppAP,SelengerLB.Productionofcellulasesandxylanasesbylow-temperaturebasidiomycetes.JMZcra^V/,2000,46(9):860~865)和Petrescu等(PetrescuI,LamotteBJ，ChessaJP.XylanasefromthepsychrophilicyeastQyj!7tococciw<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>曾分別報(bào)道了酵母和擔(dān)子菌的低溫木聚糖酶，在5'C仍具有顯著酶活。劉世利等(劉世利，汪天虹，秦楠.Isolationandmutagenesisofcold-adaptivexylanase-producing戶<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(菌物系統(tǒng))，2003，22(2):272276)報(bào)道從深海污泥樣品中分離到產(chǎn)低溫木聚糖酶的青霉，其最適生長(zhǎng)溫度為18°C。Hou等(HouYH,WangTH,LongH.Novelcold-adaptivePem'c/〃z'調(diào)strainFS010secretingthermo-labilexylanaseisolatedfromYellowSea.Jcto說<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>從黃海中篩選出了產(chǎn)木聚糖酶的低溫真菌，該菌屬于產(chǎn)黃青霉(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>入利用這些微生物制備耐冷木聚糖酶的缺點(diǎn)是產(chǎn)率較低或者是所得到的耐冷木聚糖酶的酸堿適應(yīng)性較差，所得到的耐冷木聚糖酶在20。C以下，特別是0-10。C時(shí)的酶活非常低。另外，目前報(bào)道的還有一些產(chǎn)耐冷木聚糖酶的微生物為基因改造后的微生物(LeeCC,RenaE,GeorgeHR，etal.Cloningandcharacterizationofacold-activexylanaseenzymefromanenvironmentalDNAlibrary.Ext腿叩hiles，2006,10:295300)，這可能會(huì)導(dǎo)致這些菌株不穩(wěn)定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠制備耐冷木聚糖酶的木霉，以及利用這種木霉比較高效地制備性能較好的耐冷木聚糖酶的方法，所述性能包括較低溫度下的酶活和穩(wěn)定性、酸堿適應(yīng)性。本發(fā)明提供的木霉是木霉SC9，是從海拔2000m以上的四川九寨溝采到的土樣中篩選得到新的木霉菌株。于2008年9月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCCNo.2680，分類命名為木霉OHc/zo血wwsp.義該保藏單位地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。本發(fā)明提供的利用所述木霉SC9制備耐冷木聚糖酶的方法為以木聚糖為碳源，將所述木霉SC9在10-30'C發(fā)酵制得發(fā)酵液，過濾所述發(fā)酵液得到粗酶液，純化所述粗酶液得到耐冷木聚糖酶。所述發(fā)酵的發(fā)酵時(shí)間較佳為3-10天。較佳地，所述發(fā)酵為液體發(fā)酵，所述液體發(fā)酵是將所述木霉SC9接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為5-8，含有以下組分木聚糖10-40g/L，酵母提取物(含氮量為10.0-12.5%，Oxoid公司產(chǎn)品)5-20g/L，胰蛋白胨5-20g/L，CaCl20.1-1g/L，MgS047H200.1-1g/L，F(xiàn)eS040.1-1g/L，(NH4)2S040.1-1g/L。較佳地，所述木聚糖為選自樺木木聚糖、燕麥木聚糖和玉米芯木聚糖的一種或多種。較佳地，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.5-7.5，含有以下組分玉米芯木聚糖20-30g/L，酵母提取物8-12g/L，胰蛋白胨8-12g/L，CaCl20.2-0.5g/L，MgS04'7H200.2-0.5g/L，F(xiàn)eS040.2-0.5g/L，(NH4)2S040.2-0.5g/L。較佳地，純化所述粗酶液包括下述步驟1)向液體發(fā)酵得到的粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末至酶液中硫酸銨達(dá)到30-40%飽和度，冰水浴中攪拌30-60分鐘，然后冷凍離心，取上清液繼續(xù)添加硫酸銨粉末至酶液中硫酸銨達(dá)到50-60%飽和度，冰水浴中攪拌30-60分鐘，冷凍離心，將沉淀用少量的緩沖液溶解，溶液即為初步純化的耐冷木聚糖酶；2)將初步純化的耐冷木聚糖酶酶液，過DEAE52弱陰離子柱層析，平衡液選用pH5.5-6.5，20-30mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液，收集未吸附蛋白；3)將歩驟2)得到的未吸附蛋白(即木聚糖酶液)過SephadexG50凝膠過濾柱層析，用pH5.5-6.5，20-60mM檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液洗脫并收集，在280nm處測(cè)定各管的吸光值，并測(cè)定峰值附近樣品的木聚糖酶活力，酶活力較高的收集液經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)純度，蛋白單一的即為純酶液。收集目標(biāo)蛋白峰即為純化的耐冷木聚糖酶。本發(fā)明提供的利用木霉SC9制備耐冷木聚糖酶的方法產(chǎn)率較高，制得的耐冷木聚糖酶具有很強(qiáng)的底物特異性，僅作用于木聚糖，對(duì)其它非木聚糖多糖均沒有活性，在較冷的溫度下具有較高的酶活性，穩(wěn)定性和酸堿適應(yīng)性都比較好。圖1為該實(shí)施例得到的耐冷木聚糖酶純酶SDS-PAGE圖；圖2為不同反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活的測(cè)定結(jié)果曲線；圖3為酶液的溫度穩(wěn)定性曲線；圖4表示了不同pH值及體系的緩沖液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的相對(duì)酶活曲線;圖5表示了不同pH值及體系的緩沖液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果；圖6為木聚糖酶純酶水解樺木木聚糖和櫸木木聚糖所得產(chǎn)物的薄層層析圖7為木聚糖酶純酶水解木寡糖所得產(chǎn)物的薄層層析圖。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實(shí)施例l、耐冷木聚糖酶的制備1)粗酶液的制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基玉米芯木聚糖25g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，CaCl20.3g/L，MgS04.7H200.3g/L，F(xiàn)eS040.3g/L，(NH4)2S040.3g/L，初始pH值為7的培養(yǎng)基。液體發(fā)酵低溫木霉菌SC9種子從保存的PDA斜面上劃線于新配制的PDA平板上，然后將平板放置于10-20。C培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2-8天。從生長(zhǎng)良好的平板上刮下1cr^大小的低溫真菌菌絲體，接種在裝有50ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，在空氣浴振蕩搖床中，20。C、160rpm振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)5天后將發(fā)酵液在10,000xg冷凍離心10分鐘，上清液即為含有木聚糖酶的粗酶液。木聚糖酶活力的測(cè)定方法采用DNS(3，5,二硝基水楊酸)法，參照文獻(xiàn)(Bailey,MJ,Biely，P，Poutanen,K.Interlaboratorytestingofmethodsforassayofxylanaseactivity.J腸fec/wo/，1992,23:257-270)中所述的方法。具體步驟如下取0.1ml適當(dāng)稀釋的上述方法制備的酶溶液，加入到0.9ml用0.05mol/L，pH5.5的檸檬酸緩沖液配制的1%樺木木聚糖底物溶液中，于3(TC下反應(yīng)10分鐘，用DNS法測(cè)定釋放的還原糖量(Miller,GL.Useofdinitro-salicylicacidreagentfordeterminationofreducingsugars.J"a/C/^m,1959,31:426-428)，同時(shí)以木糖作標(biāo)準(zhǔn)。木聚糖酶活力單位(U)定義為在上述條件下，每分鐘水解木聚糖生成lpmol木糖所需要的酶量。結(jié)果表明，液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的產(chǎn)量在第4天時(shí)開始顯著增加，到第6天時(shí)達(dá)到最高，為36.7U/ml，第7天酶活力開始緩慢下降。2)耐冷木聚糖酶的純化①硫酸銨沉淀向粗酶液中緩慢加入硫酸銨粉末，使酶液中硫酸銨達(dá)到35%飽和度，冰水浴中攪拌60分鐘，然后12,000xg離心10分鐘，取上清液繼續(xù)添加硫酸銨粉末至酶液中硫酸銨達(dá)到55%飽和度，冰水浴攪拌60分鐘，10,000xg離心10分鐘取沉淀，將沉淀用少量的緩沖液溶解，溶液即為初步純化的耐冷木聚糖酶酶液；②弱陰離子柱層析經(jīng)硫酸銨沉淀純化后的酶液，經(jīng)弱陰離子柱層析進(jìn)一步純化。選用Whatman公司的DEAE52為離子柱填料，層析柱長(zhǎng)10cm，直徑1.0cm。平衡緩沖液為pH6.025mM檸檬酸-檸檬酸三鈉，流速lml/min。木聚糖酶液上樣后，收集未吸附的蛋白，每lmin收集一管(lml)。測(cè)定各管在280nm處的吸光值和木聚糖酶活力，酶活力較高的收集液進(jìn)行超濾濃縮至lml左右，4。C冷藏備用。③凝膠過濾層析上述所得酶液經(jīng)離子交換層析純化，采用Pharmacia公司的SephadexG50為凝膠柱填料，層析柱長(zhǎng)60cm，直《5l.0cm。平衡緩沖液及洗脫緩沖液pH6.050mM檸檬酸-檸檬酸三鈉，流速0.083ml/min，12min收集lml，通過測(cè)定木聚糖酶活力來確定目標(biāo)蛋白峰，最后通過電泳(SDS-PAGE)檢驗(yàn)其純度，見圖l。SDS-PAGE方法按照Laemmli方法，如文獻(xiàn)(LaemmliUK.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.淑臟，1970，277:680-685)中所述進(jìn)行。分離膠12.5%，濃縮膠4.5%，考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白帶，低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白與樣品在同一條件下電泳。蛋白含量的測(cè)定方法采用Lowry法，如文獻(xiàn)(Lowryetal.Proteinmeasurementwiththefolinphenolreagent,/owrwa/o/CTzem/W^y,1951，193:265-275)中所述，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照如上方法檢測(cè)粗酶液、硫酸銨沉淀得到的目標(biāo)蛋白、經(jīng)DEAE52離子交換層析和SephadexG50凝膠過濾得到的酶蛋白的量、酶比活，計(jì)算回收率和純化倍數(shù)。其中，回收率=各步驟總酶活/粗酶總酶活，純化倍數(shù)=各歩驟比活/粗酶比活。經(jīng)過上述三步純化得到了電泳級(jí)木聚糖酶，純化過程中，按照步驟l)所述木聚糖酶活力的測(cè)定方法，比酶活達(dá)到349.2U/mg，與粗酶液相比純化了35.9倍，回收率為8.1%，具體結(jié)果如下表l。_表1液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶純化表_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖1為該實(shí)施例得到的耐冷木聚糖酶純酶SDS-PAGE圖，其中，M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；列l(wèi):純酶。實(shí)施例2耐冷木聚糖酶的性質(zhì)耐冷木聚糖酶的最適溫度及不同溫度下的穩(wěn)定性測(cè)定分別在不同溫度(0-80°C)下測(cè)定實(shí)施例l得到的耐冷木聚糖酶的活力，以酶活力最高點(diǎn)時(shí)的溫度作為耐冷木聚糖酶的最適溫度，以此酶活力作為100%。測(cè)定耐冷木聚糖酶的不同溫度下的穩(wěn)定性將酶液分別在不同溫度下處理30min，冰水浴冷卻，然后測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液做為對(duì)照(100%)來測(cè)定耐冷木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。木聚糖酶活力的測(cè)定按照步驟l中所述方法進(jìn)行。圖2為不同反應(yīng)溫度下的相對(duì)酶活的測(cè)定結(jié)果曲線，該測(cè)定結(jié)果表明耐冷木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為40-45。C，當(dāng)溫度達(dá)到和高于50。C時(shí)酶活力迅速下降，50°(:時(shí)酶活力降為最高值的56%。該酶在4'C時(shí)的酶活力仍為最高值的10%左右，在20"時(shí)的酶活力為最高值的22%左右，說明該酶具有耐冷性。圖3為酶液的溫度穩(wěn)定性曲線，可以看出，酶液在低于3(TC時(shí)很穩(wěn)定，處理30min后酶活力損失較少，25。C時(shí)處理30min后酶活力仍保存90。/o左右，45r處理后酶活力急劇下降，損失了50%左右，說明該酶對(duì)溫度比較敏感，溫度稍高時(shí)酶活即損失較大，更說明了該酶在低溫下有較好的穩(wěn)定性。耐冷木聚糖酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性測(cè)定將緩沖液分別換為不同pH值及體系的緩沖液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)加入到底物中30"C條件下測(cè)定該酶最適pH，以酶活力最高點(diǎn)作為100%。將不同緩沖體系下的酶液在3(TC條件下處理30min，冰水浴冷卻，測(cè)定殘余酶活力，以未經(jīng)處理的酶液作為對(duì)照(100%)測(cè)定木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖4表示了不同pH值及體系的緩沖液(分別為檸檬酸、乙酸、Tris-HCl、MES、MOPS、磷酸和GLY)中耐冷木聚糖酶的相對(duì)酶活曲線，結(jié)果表明該耐冷木聚糖酶的最適pH值為pH6.0，當(dāng)pH處于5-7.2之間時(shí)，該酶比較穩(wěn)定，酶活力能保留80%左右，當(dāng)反應(yīng)體系的pH偏酸或偏堿時(shí)，酶活力受到抑制，酶活力下降較快。該耐冷木聚糖酶的pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果顯示在圖5中，當(dāng)pH在3.5-9.0之間時(shí)，該酶比較穩(wěn)定，酶活力可以保留卯％以上，表明該酶具有廣泛的pH穩(wěn)定性。實(shí)施例3、耐冷木聚糖酶的水解特性耐冷木聚糖酶的底物特異性通過在40t:條件下用不同來源的濃度為1%的天然底物進(jìn)行分析。結(jié)果表明實(shí)施例2液體發(fā)酵并純化后的耐冷木聚糖酶具有很強(qiáng)的底物特異性，僅作用于木聚糖，對(duì)其它非木聚糖多糖均沒有活性。下表2顯示了該耐冷木聚糖酶對(duì)樺木木聚糖、燕麥木聚糖和櫸木木聚的底物特異性。表2耐冷木聚糖酶的底物特異性<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>耐冷木聚糖酶分別對(duì)樺木木聚糖、燕麥木聚糖和櫸木木聚糖在30°C下進(jìn)行水解，同時(shí)以木二糖，三糖，四糖和五糖為底物進(jìn)行水解。在O,0.25，0.5，1，2，4，6，12，和24h取樣進(jìn)行TLC(薄層層析)分析。圖6為木聚糖酶純酶水解樺木木聚糖和櫸木木聚糖所得產(chǎn)物的薄層層析圖；圖7木聚糖酶純酶水解木寡糖所得產(chǎn)物的薄層層析圖，從左到右分別為木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。圖6和圖7中左右兩側(cè)的Xn列從上到下依此為木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖。當(dāng)該耐冷木聚糖酶分別以木寡糖(木二糖、木三糖、木四糖和木五糖)為底物進(jìn)行水解時(shí)，水解產(chǎn)物主要為木二糖其次為木三糖，最終水解產(chǎn)物出現(xiàn)少量木糖。該酶不能水解木二糖，可以將木三糖，木四糖和木五糖逐漸水解為木二糖。權(quán)利要求1、木霉SC9，其特征在于，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2680。全文摘要本發(fā)明的目的是提供一種能夠制備耐冷木聚糖酶的木霉，以及利用這種木霉比較高效地制備性能較好的耐冷木聚糖酶的方法。本發(fā)明提供的木霉是木霉SC9，保藏號(hào)為CGMCCNo.2680。本發(fā)明提供的利用所述木霉SC9制備耐冷木聚糖酶的方法為以木聚糖為碳源，將所述木霉SC9在10-30℃發(fā)酵制得發(fā)酵液，過濾所述發(fā)酵液得到粗酶液，純化所述粗酶液得到耐冷木聚糖酶。本發(fā)明提供的利用木霉SC9制備耐冷木聚糖酶的方法產(chǎn)率較高，制得的耐冷木聚糖酶具有很強(qiáng)的底物特異性，僅作用于木聚糖，對(duì)其它非木聚糖多糖均沒有活性，該酶最適反應(yīng)溫度為40-45℃，在較冷的溫度下具有較高的木聚糖酶活性，穩(wěn)定性和酸堿適應(yīng)性都比較好。文檔編號(hào)C12N9/42GK101381683SQ200810224159公開日2009年3月11日申請(qǐng)日期2008年10月24日優(yōu)先權(quán)日2008年10月24日發(fā)明者鵬周,朱會(huì)芳,江正強(qiáng),閆巧娟申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)