專利名稱：一種拯救流感病毒的方法及其專用雙向轉(zhuǎn)錄載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種拯救流感病毒的方法及其專用雙向轉(zhuǎn)錄載體。
技術(shù)背景進(jìn)入20世紀(jì)，流行性感冒病毒至少有過4次全球性大流行，奪去數(shù)千萬人的 生命，給人類造成巨大災(zāi)難。流感的流行與流感病毒的傳播強(qiáng)度、抗原易發(fā)生變異 有關(guān)。當(dāng)新變異型出現(xiàn)時(shí)，人們對(duì)之缺乏免疫力，象征著新的一次流行即將到來。 禽流感病毒廣泛流行于世界各地，長(zhǎng)期在禽類中流行，高致病性禽流感毒對(duì)禽類的 致死率接近100%。自從1997年H5N1亞型高致病性禽流感病毒突然襲擊人類以來， 2003年底至2004年初禽流感在亞洲許多國(guó)家流行，造成人員的死亡，雖還未證明 有人傳人情況，但必須引起足夠重視，而相關(guān)的疫苗的研制已經(jīng)刻不容緩。流感病毒屬正粘病毒科，首先根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(MS)抗原性的不同， 分為A、 B和C三個(gè)型，再按表面抗原區(qū)分為血凝素(H)和神經(jīng)氨酸酶(N)的不同亞 型。高致病性禽流感病毒H5N1亞型為A型流感病毒，可感染禽類，也可感染人類。A型流感病毒的基因組由8個(gè)分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA所組成，因?yàn)镽NA多聚酶 無審校功能，所以流感病毒變異毒株出現(xiàn)的機(jī)遠(yuǎn)高于其他病毒，尤其是其HA和NA 基因的變異，是導(dǎo)致流感暴發(fā)的主要原因。流感病毒基因的單股性，使得兩株病毒 感染同一個(gè)宿主時(shí)，他們之間可能發(fā)生基因重配，從而產(chǎn)生新的毒株。近年來隨著 重組DNA技術(shù)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，使得人們能夠在DNA分子水平上對(duì)病毒基因組進(jìn)行 人工體外操作，如進(jìn)行基因點(diǎn)突變、缺失、插入、顛換、轉(zhuǎn)位和互補(bǔ)等改造，從而 促進(jìn)了病毒的基因組的結(jié)構(gòu)和功能、復(fù)制機(jī)理、致病機(jī)理、病毒與宿主關(guān)系、病毒 疫苗的研制等方面的研究進(jìn)展。由于A型流感病毒復(fù)制周期并不經(jīng)歷DNA階段，而 RNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和不穩(wěn)定性使得人們難以直接在分子水平上對(duì)RNA病毒基因組進(jìn)行 操作。如何將A型流感病毒基因組轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌虿僮鞯牟《净蚪McDNA，成為對(duì)RNA 病毒從基因水平上能否取得進(jìn)展的關(guān)鍵問題。RNA病毒的反向遺傳(reverse gentics)操作系統(tǒng)的出現(xiàn)解決了這一難題，該系統(tǒng)是采用病毒的感染性克隆(一般 是在細(xì)菌質(zhì)粒中插入整個(gè)病毒基因組的cDNA拷貝，使得cDNA本身或從cDNA轉(zhuǎn)錄 所得的RNA具有感染性)，通過定向修飾病毒的基因組序列，檢測(cè)被拯救的人工改
造病毒的表型，在體內(nèi)有效地進(jìn)行病毒基因結(jié)構(gòu)和功能、復(fù)制機(jī)理、致病機(jī)理和病 毒與宿主相互關(guān)系、疫苗等相關(guān)研究。反向遺傳學(xué)是在已知基因序列的基礎(chǔ)上，利用現(xiàn)代生物學(xué)理論與技術(shù)，通過核 苷酸序列的突變、缺失、插入等手段創(chuàng)造突變體并研究突變所造成的表型效應(yīng)，即 直接從生物的遺傳物質(zhì)入手來研究基因的生物學(xué)功能，闡述生物生命發(fā)生的本質(zhì)現(xiàn) 象與規(guī)律，如生物的繁殖復(fù)制機(jī)制、病毒的致病機(jī)制等。目前，反向遺傳學(xué)在病毒 學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面①創(chuàng)造新的病毒和研究新疫苗。根據(jù)一些病毒 的有關(guān)的已知核酸序列，采用反向遺傳學(xué)操作技術(shù)可以構(gòu)建出"人為設(shè)計(jì)"的病毒， 得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列為基因組的新型病毒，這給獲 得高免疫原性的低致病力毒株來制造疫苗提供了一個(gè)全新的途徑。也可在生產(chǎn)疫苗 時(shí)，將流行毒株與高產(chǎn)毒株進(jìn)行基因重配，得到同時(shí)具有高產(chǎn)特性和流行毒株抗原 性的重組毒株，以提高疫苗產(chǎn)量。②病毒致病機(jī)制以及結(jié)構(gòu)功能等研究。反向遺傳學(xué)技術(shù)通過構(gòu)建含有特定序列的感染性RNA病毒，在DNA分子水平上對(duì)RNA病毒感染 性克隆進(jìn)行體外操作，從而研究這些病毒特定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能、病毒各成分之間 及病毒與細(xì)胞間相互作用、病毒致病機(jī)制和構(gòu)建病毒載體等。利用反向遺傳學(xué)技術(shù) 對(duì)負(fù)股RNA病毒基因組操作，能夠以一個(gè)感染性病毒粒子的完整形式來研究病毒單 個(gè)基因的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。與常用其它研究方法相比，前者更能了解病毒的實(shí)際 作用方式。反向遺傳學(xué)技術(shù)的產(chǎn)生大大加快了 RNA病毒在分子水平上研究進(jìn)程，尤其是通 過反向遺傳學(xué)技術(shù)拯救負(fù)鏈RNA病毒的成功，是近10年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最令人 鼓舞的一項(xiàng)成果。通過構(gòu)建含有特定序列的感染性RNA病毒，研究病毒特定的蛋白 結(jié)構(gòu)和功能、病毒各成分之間及病毒與細(xì)胞間相互作用、病毒致病機(jī)理、構(gòu)建病毒 載體及感染性克隆等。對(duì)負(fù)股RNA病毒的反向遺傳學(xué)操作大大拓展了病毒學(xué)研究領(lǐng)域，在未來疫苗研制、基因治療、癌癥治療、生物大分子的制備方面具有很好的前旦 足0發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生重組流感病毒的雙向轉(zhuǎn)錄載體。 本發(fā)明所提供的產(chǎn)生重組流感病毒的雙向轉(zhuǎn)錄載體，是在pVAXl的多克隆位點(diǎn) 插入RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和RNA聚合酶I的終止子得到的環(huán)狀重組載體;所述RNA 聚合酶I的終止子位于所述pVAXl的CMV啟動(dòng)子和所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子之間。
為了便于外源目的基因的插入，所述RNA聚合酶I的終止子和所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子之間具有兩個(gè)相同的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，所述限制性內(nèi)切酶切割DNA后產(chǎn)生平末端。所述兩個(gè)相同的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)具體可為兩個(gè)i s/sBI識(shí)別位點(diǎn)。 為了便于外源DNA片段插入所述雙向轉(zhuǎn)錄載體的兩個(gè)相同的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)之間，所述兩個(gè)相同的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)之間至少間隔一個(gè)脫氧核糖核苷酸。所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子具體可為人的RNA聚合酶I的啟動(dòng)子，所述RNA聚 合酶I的啟動(dòng)子的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1的自5'末端第811-1032 位脫氧核糖核苷酸。所述RNA聚合酶I的終止子具體可為鼠的RNA聚合酶I的終止子，所述RNA聚合酶I的終止子的核苷酸序列具體可為序列表中的序列1的自5'末端第758-792位脫氧核糖核苷酸。上述產(chǎn)生重組流感病毒的雙向轉(zhuǎn)錄載體具體可為pZL2006。pZL2006的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。序列表中的序列1由3261個(gè)脫氧核糖核苷酸組成，序列表中的序列1自5'末端第793-810位脫氧核糖核苷酸為間隔序列。所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子片段和RNA聚合酶I的終止子片段可插在pVAXl的 多克隆位點(diǎn)的任何位置，如限制內(nèi)切酶^3/di I和Z力3 I的位點(diǎn)間。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種拯救流感病毒的方法。 本發(fā)明所提供的拯救流感病毒的方法，包括以下步驟1) 將流感病毒的PB2編碼基因、PB1編碼基因、PA編碼基因、M編碼基因、NS 編碼基因、NP編碼基因、HA編碼基因和NA編碼基因分別插入上述雙向轉(zhuǎn)錄載體的 的RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和RNA聚合酶I的終止子之間，得到8個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒； 所述8個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒為含有PB2編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PB1編碼基因的 重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有HA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì) 粒、含有NP編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有NA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有M 編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和含有NS編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；2) 將所述8個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳細(xì)胞中，培養(yǎng)所述哺乳細(xì)胞，得到重組 流感病毒。
可在MDCK細(xì)胞、Vero細(xì)胞、293T細(xì)胞、C0S7細(xì)胞、WI-38、 HL-8、 Hela細(xì)胞 或Chang C/I/L/K細(xì)胞等哺乳動(dòng)物細(xì)胞中拯救上述重組流感病毒。該方法可用于拯救A、 B和C這3型流感病毒。由該方法拯救的流感病毒也屬 于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明利用真核表達(dá)載體pVAXl作為骨架質(zhì)粒，插入RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和 終止子序列，構(gòu)建成不同于國(guó)外pHW2000系統(tǒng)的8質(zhì)粒反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn) 流感病毒粒子的組裝。本發(fā)明的雙向轉(zhuǎn)錄載體和拯救流感病毒的方法可在拯救流感 病毒和制備流感病毒疫苗中的得到廣泛的應(yīng)用。


圖1為人pol I啟動(dòng)子基因擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果 M: DNA Marker (DL2000) ; 1:人pol I啟動(dòng)子基因片段PCR產(chǎn)物 圖2為pZL2006的物理圖譜圖3為人源禽流感A/Beijing/01/2003(H5N1)株基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖4為有人源禽流感A/Beijing/01/2003(H5N1)株8基因片段插入雙向轉(zhuǎn)錄載 體pZL2006后重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果M. DNA marker DL15000; 1.重組質(zhì)粒pZL2006-PB2 5"sc I酶切產(chǎn)物；2.重組質(zhì) 粒pZL2006-PB2; 3.重組質(zhì)粒pZL2006-PBl 5"ac I酶切產(chǎn)物;4.重組質(zhì)粒 pZL2006-PB1; 5.重組質(zhì)粒pZL2006-PA I酶切產(chǎn)物;6.重組質(zhì)粒pZL2006-PA; 7.重組質(zhì)粒pZL2006-HA 5"ac I酶切產(chǎn)物；8.重組質(zhì)粒pZL2006-HA; 9.重組質(zhì)粒 pZL2006-NP 5"ac I酶切產(chǎn)物；10.重組質(zhì)粒pZL2006-NP; 11.重組質(zhì)粒pZL2006-NA 5"ac I酶切產(chǎn)物；12.重組質(zhì)粒pZL2006-NA; 13.重組質(zhì)粒pZL2006-M Sac I酶切產(chǎn)物； 14.重組質(zhì)粒pZL2006-M; 15.重組質(zhì)粒pZL2006-NS 6^c I酶切產(chǎn)物；16.重組質(zhì)粒 pZL2006-NS; M'.DNA marker DL2000圖5為拯救病毒在MDCK細(xì)胞上引起細(xì)胞病變的情況A.拯救病毒感染細(xì)胞；B.正常細(xì)胞對(duì)照?qǐng)D6拯救重組A/Bei jing/01/2003病毒感染MDCK細(xì)胞上清電鏡負(fù)染照片 (65000 X)圖7為拯救重組A/Bei jing/01/03病毒的血凝效價(jià)測(cè)定結(jié)果 B1:PHW2000載體系統(tǒng)拯救病毒(第一次實(shí)驗(yàn))；B2:PHW2000載體系統(tǒng)拯救病毒 (第二次實(shí)驗(yàn))D1:PZL2006載體系統(tǒng)拯救病毒(第一次實(shí)驗(yàn))；D2:PZL2006載體系統(tǒng)拯救病毒
(第二次實(shí)驗(yàn))陽(yáng)對(duì)原始野生型病毒；空對(duì)空白對(duì)照?qǐng)D8為拯救病毒產(chǎn)物的上清液感染MDCK細(xì)胞48小時(shí)的致細(xì)胞病變(CPE)情況A.拯救病毒上清感染的細(xì)胞；B.正常細(xì)胞對(duì)照具體實(shí)施方式
實(shí)施例l、雙向轉(zhuǎn)錄載體pZL2006的構(gòu)建本發(fā)明通過下述技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn):利用Hela細(xì)胞擴(kuò)增出人RNA聚合酶I(人pol I)的啟動(dòng)子(PIh)序列，人工合成RNA聚合酶I的終止子序列(tl)，利用BsniB I將RNA聚合酶I啟動(dòng)子和終止子連接起來，將RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和終止子反 向插入pVAXl質(zhì)粒中構(gòu)建成雙向轉(zhuǎn)錄載體。具體方法如下1、 PCR擴(kuò)增人poll啟動(dòng)子Hela細(xì)胞DNA的提取按照Takara公司Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver:3.0試劑盒操作說明書步驟進(jìn)行。人pol I啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增采用Promega公 司的pfu DNA酶進(jìn)行，擴(kuò)增引物為P0L1 (其序列是GCGGTACCGTCTCCAATAACCCGGC) 和P0L2 (其序列是CCAGTCTAGAAGCTC TAGCATTTAGGTGAC)，擴(kuò)增條件為94"C變性 5min， 94°C 30s、 55°C 30s、 72°C lmin30個(gè)循環(huán)，最后72。C延伸10分鐘，擴(kuò)增 完成后取PCR產(chǎn)物5ixl， 1.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到240bp的人poll啟動(dòng) 子基因片段(圖1)。2、 人工合成RNA聚合酶I的終止子序列，人工合成RNA聚合酶I的終止子序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。3、 RNA聚合酶I的啟動(dòng)子片段和RNA聚合酶I的終止子片段的連接將步驟1擴(kuò)增的人poll啟動(dòng)子和步驟2合成的RNA聚合酶I的終止子利用Kpn I酶切后純化回收的片段利用Promega公司的T4 DNA連接酶16。C過夜反應(yīng)，得到 324bp的片段。4、 將核苷酸序列表中序列l(wèi)的片段插入pVAXl將步驟3得到的核苷酸片段采用Promega公司的p/w DNA酶進(jìn)行，擴(kuò)增引物為 PVAX1P (其序列是GTTCGGATCCAGCTGTTAACGCTAGCAGTTAACCG)和P0L2 (其序列是 CCAGTCTAGAAGCTCTAGCAT TTAGGTGAC)，擴(kuò)增條件為94。C變性5min, 94°C 30s、 55 °C 30s、72°C lmin30個(gè)循環(huán)，最后72"C延伸10分鐘，擴(kuò)增完成后取PCR產(chǎn)物5iil， 1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物利用I雙酶切后與5』I 雙酶切的pVAXl載體(購(gòu)自Invotrogen公司)連接，得到重組載體pZL2006，利用序 列測(cè)定證實(shí)RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和終止子序列插入pVAXl載體，表明pZL2006載 體結(jié)構(gòu)正確(圖2) 。 pZL2006的核苷酸序列如序列表中的序列l(wèi)所示，序列l(wèi)的 自5'末端第137-724位脫氧核糖核苷酸為CMV啟動(dòng)子；序列1的自5'末端第664-683 位脫氧核糖核苷酸為T7啟動(dòng)子/起始位點(diǎn)(priming site);序列1的自5'末端 第758-792位脫氧核糖核苷酸為鼠pol I終止子；序列1的自5'末端第811-1032 位脫氧核糖核苷酸為人pol I啟動(dòng)子；序列1的自5'末端第1085-1102位脫氧核 糖核苷酸為BGH反轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；序列1的自5'末端第1091-1315位脫氧核糖核 苷酸為BGH多聚腺苷酸尾信號(hào)；序列1的自5'末端第1488-2282位脫氧核糖核苷酸 為卡那霉素抗性基因；序列1的自5'末端第2582-3255位脫氧核糖核苷酸為pUC origin。實(shí)施例2、用本發(fā)明的雙向轉(zhuǎn)錄載體拯救流感病毒 1、流感病毒8個(gè)片段重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)測(cè)定的我國(guó)人禽流感病毒株全基因序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增各基因片段的引物。利 用RT-PCR從提取的病毒RNA中擴(kuò)增病毒相應(yīng)基因節(jié)段，連接PGEM T-Easy載體。① 流感病毒的制備將禽流感病毒A/Beijing/01/2003(H5N1)接種于SPF雞胚， 培養(yǎng)流感病毒，收集尿囊液300ml， 6000rpm(30tt轉(zhuǎn)子)離心15min，取上清，18000rpm 4。C離心1. 5h，用40ml STE (10mM pH8. 0 Tris-HC1， lOOmM NaCl， 5mM pH8. 0 EDTA) 懸浮沉淀。用10%蔗糖墊底，小心加入懸浮液，18000rpm 4°。離心1. 5h去雜蛋白， 去上清，沉淀用30ml STE懸浮，18000rpm 4。C離心lh去蔗糖，沉淀用7ml STE懸 浮，分裝，每管450ul。② 流感病毒基因組RNA的提取按照Qiaqen公司QIAamp Viral RNA Mini Kit 試劑盒操作說明書步驟進(jìn)行。③ 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增各基因片段反轉(zhuǎn)錄按照Invitrogen公 司的S卯erScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit說 明進(jìn)行操作，條件為50°C 50min; PCR按照Invitrogen公司的PlatinumR Taq DNA Polymerase High Fidelity說明進(jìn)行操作，條件是94。C預(yù)變性5min，在75。C加聚 合酶0. (2. 5U)，用94°C 40s、 48°C 50s、 72°C 2min 5個(gè)循環(huán)，再用94°C 40s、 50°C 50s、 72°C 2min運(yùn)行25個(gè)循環(huán)，最后72 。C延伸10分鐘、4 °C運(yùn)行10min。
取PCR產(chǎn)物5W，用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其中，用于擴(kuò)增PB2編碼基因的引物是1FW (其序列是 GGAGCGAAAGCAGGTCAMTATATT)和1RV (其序列是GGAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAA);用于擴(kuò)增PB1編碼基因的引物是2FW(其序列是GGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTG) 和2RV (其序列是GGAGT AGAAACAAGGCATTTTTTCA);用于擴(kuò)增PA編碼基因的引物是3FW (其序列是GGAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAA) 和3RV (其序列是GGAGTA GAAACAAGGTACTTTTTTG);用于擴(kuò)增HA編碼基因的引物是4FW (其序列是GGAGCGAAAGCAGGGGTCCAATCTG) 和4RV (其序列是GGAGT AGAMCAAGGGTGTTTTTAA);用于擴(kuò)增NP編碼基因的引物是5FW (其序列是GGAGCGAAAGCAGGGTAGATAAGTC) 和5RV (其序列是GGAGT AGAAACAAGGGTATTTTTCT);用于擴(kuò)增NA編碼基因的引物是6FW (其序列是GGAGCAAAAGCAGGAGTTCAAAATG) 和6RV (其序列是GGAGT AGAAACMGGAGTTTTTTGA);用于擴(kuò)增M編碼基因的引物是7FW (其序列是GGAGCGAAAGCAGGTAGATGTTGAA) 和7RV (其序列是GGAGT AGAAACAAGGTAGTTTTTTA);用于擴(kuò)增NS編碼基因的引物是8FW (其序列是GGAGCGAAAGCAGGGTGACAAAAAC) 和8RV (其序列是GGAG TAGAAACAAGGGTGTTTTTTA)。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示，圖中，1為PB1編碼基因 擴(kuò)增產(chǎn)物(2341bp); 2為PB2編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物(2341bp); 3為PA編碼基因擴(kuò)增產(chǎn) 物(2233bp); 4為HA編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物(1779bp) ; 5為NP編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物 (1566bp); 6為NA編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物(1399bp); 7為M編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物(贈(zèng)bp); 8為NS編碼基因擴(kuò)增產(chǎn)物(875bp); M為Marker (DL2000)?；厥誔CR產(chǎn)物分別與pGEM T-Easy載體連接，進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明含有 GenBank Accession Number :EF587274的自5'末端第1-2341位脫氧核糖核苷酸的重 組載體命名為pGEM T-PB2，將測(cè)序結(jié)果表明含有GenBank Accession Number: EF587275的自5'末端第1-2341位脫氧核糖核苷酸的重組載體命名為pGEM T-PB1， 將測(cè)序結(jié)果表明含有GenBank Accession Number: EF587276的自5'末端第1-2233 位脫氧核糖核苷酸的重組載體命名為PGEM T-PA，將測(cè)序結(jié)果表明含有GenBank Accession Number :EF587277的自5'末端第1-1779位脫氧核糖核苷酸的重組載體命 名為pGEM T-HA，將測(cè)序結(jié)果表明含有GenBank Accession Number :EF587278的自5 '末端第1-1566位脫氧核糖核苷酸的重組載體命名為pGEM T-NP，將測(cè)序結(jié)果表明 含有GenBank Accession Number:EF587279的自5'末端第1-1399位脫氧核糖核苷 酸的重組載體命名為pGEM T-NA，將測(cè)序結(jié)果表明含有GenBank Accession Number:EF587280的自5'末端第1-1027位脫氧核糖核苷酸的重組載體命名為pGEM T-M，將測(cè)序結(jié)果表明含有GenBank Accession Number :EF587281的自5'末端第1-875位脫氧核糖核苷酸的重組載體命名為pGEM T-NS。分別以pGEM T-PB2、 pGEM T-PBl、 pGEM T-PA、 pGEM T-HA、 pGEM T-NP、 pGEM T-NA、 pGEM T-M和pGEM T-NS為模板，按照Invitrogen公司的PlatinumR Taq DNA Polymerase High Fidelity說明進(jìn)行操作，條件是94。C預(yù)變性5min，在75。C加聚 合酶O. (2. 5U)， 94°C 40s、 52°C 50s、 72°C 2min運(yùn)行30個(gè)循環(huán)，最后72 °C 延伸IO分鐘、4°C運(yùn)行10min，取PCR產(chǎn)物5W，用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。其中，擴(kuò)增NS編碼基因片段的引物如下Bsa-NS1:TTATGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTGACBsa-NS2:ATTAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT;擴(kuò)增M編碼基因片段的引物如下BsmB-Ml:TTATCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTAGATGBsmB-M2:ATTACGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTTTAC;擴(kuò)增NA編碼基因片段的引物如下Bsa-NAl:TTATGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTTCAAAATGBsa-NA2:ATTAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTTGA;擴(kuò)增NP編碼基因片段的引物如下Bsa-NPl: TTATGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGTAGATAATCACTCBsa-NP2: ATTAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTT;擴(kuò)增HA編碼基因片段的引物如下Bsa-HA1:TTATGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGGGTCCAATCBsa-HA2:ATTAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTT(引物序列部分Bsa-HA2與Bsa-NS2相同)；擴(kuò)增PA編碼基因片段的引物如下BsmB-PA1:TTATCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTACTGATCCAAAATGG BsmB-PA2:ATTACGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTTTTTTGGACAG;
擴(kuò)增PB1編碼基因片段的引物如下BsmB-PB11:TTATCGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGCAAACCATTTGAATGGBsmB-PB12:ATTACGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTTTTTCACG;擴(kuò)增PB2編碼基因片段的引物如下Bsa-PB21:TTATGGTCTCAGGGAGCGAAAGCAGGTCAATTATATTCBsa-PB22:ATTAGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTTTTAAAC。上述引物中，帶下劃線的序列為禽流感病毒A/Beijing/01/2003(H5N1)株的序列。將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶vfeal或A5^fil酶切后回收，與^s』1酶切回收 的pZL2006連接后得到的重組載體命名為pZL2006-PB2、pZL2006-PBl、pZL2006-PA、 pZL2006-HA、 pZL2006-NP、 pZL2006-NA、 pZL2006-M、 pZL2006-NS。利用5"ac I進(jìn) 行酶切鑒定的結(jié)果見圖4，根據(jù)酶切出片段大小及測(cè)序后的結(jié)果說明pZL2006-PB2、 pZL2006-PB1、 pZL2006-PA、 pZL2006-HA、 pZL2006-NP、 pZL2006-NA、 pZL2006-M、 pZL2006-NS的結(jié)構(gòu)正確。2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救病毒1) 細(xì)胞準(zhǔn)備MDCK和293T細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%FBS的MEM和含5%FBS的 Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基(Invitrogen， USA)。用6孔板進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前 1天將生長(zhǎng)于75cm2細(xì)胞瓶中鋪滿單層的293T和MDCK細(xì)胞用胰酶消化，每種細(xì)胞取 10%細(xì)胞按照1: 1比例用18ral的Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基懸浮混勻，接種6孔板， 每孔3ml。用共培養(yǎng)的MDCK和293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)(每孔0. 2-1 X 106個(gè)細(xì)胞)。2) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用50W不含血清的Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基稀釋步驟1的質(zhì) 粒DNA pZL2006-PB2、 pZL2006-PB1、 pZL2006-PA、 pZL2006-HA、 pZL2006-NP、 pZL2006-NA、 pZL2006-M、 pZL2006-NS，這8個(gè)質(zhì)粒等量混勻。用前將脂質(zhì)體2000溫和混勻， 然后吸取20W用的Opti-MEM I低血清培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。室溫下孵育5分鐘。 注意應(yīng)在25分鐘內(nèi)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。5分鐘后，將稀釋好的質(zhì)粒和稀釋好的脂質(zhì) 體2000混合(總體積100ul)。溫和混勻，室溫下孵育20分鐘(溶液可能會(huì)呈現(xiàn) 云霧狀)。(注意復(fù)合物在室溫下6小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定)。6小時(shí)后，用0pti-MEM I 低血清培養(yǎng)基替換DNA轉(zhuǎn)染混合物。轉(zhuǎn)染36小時(shí)后，測(cè)定上清中病毒的滴度。同 時(shí)以轉(zhuǎn)染pZL2006空質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果轉(zhuǎn)染后36小時(shí)，轉(zhuǎn)染上述8質(zhì)粒的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，大部分
細(xì)胞死亡脫落，而轉(zhuǎn)染對(duì)照空質(zhì)粒細(xì)胞則完全正常(圖5)。圖5中A為轉(zhuǎn)染8質(zhì)粒 的細(xì)胞，圖5中是為轉(zhuǎn)染pZL2006空質(zhì)粒的細(xì)胞。3) 電境觀察轉(zhuǎn)染8質(zhì)粒后細(xì)胞上清3000rpm離心30分鐘，吸取上清保留備 用。固定取20ul的病毒上清，加入等體積的2.5%戊二醛(0. lmol/L磷酸緩沖液， pH7.4，含有2.5ramol/L的氯化鈣配制)于4。C固定1小時(shí)或過夜；制膜準(zhǔn)備直徑 2rara或3mm、每英寸200 300目、網(wǎng)孔呈圓形或方形的載網(wǎng)，用前進(jìn)行徹底清洗。 取0.25 0.3g聚乙烯醇縮甲醛，用三氯甲烷制成0.25% 0.3%的溶液密閉備用。制 膜時(shí)，手持表面無劃痕的潔凈玻片浸入上述溶液中，隨即慢慢提出，在液面停留l 2分鐘，使溶劑揮發(fā)。室溫自然干燥后用刀片在玻片四周劃切，然后將玻片與水面 呈45度角緩緩壓入水中，借助燈光可見隨著玻片的壓入一層薄膜漂浮在水面上。 將潔凈銅網(wǎng)一個(gè)個(gè)擺在薄膜上，把比膜稍大的濾紙條蓋在載網(wǎng)上，用手指壓入水面 后在水內(nèi)翻轉(zhuǎn)180度托出水面，烤干備用；采用懸滴法進(jìn)行負(fù)染色。用毛細(xì)管吸取 少量病毒懸液，直接滴在有支持膜的網(wǎng)上，懸液在網(wǎng)上呈半球形。數(shù)分鐘后，用一 片干凈濾紙從網(wǎng)邊吸去液體。稍干后用另一毛細(xì)管吸一滴染液滴在網(wǎng)上染色數(shù)十秒 至1分鐘左右。用濾紙吸去染液，立即進(jìn)行電鏡觀察或置于干燥器內(nèi)短期保存。結(jié)果如圖6四幅圖片所示，每幅圖片上均出現(xiàn)1或2個(gè)具有甲型流感病毒典型 形態(tài)的病毒粒子(放大倍數(shù)為x 65000)，其直徑大小約80-120nm，具有包膜，表面 有棘突，表明在轉(zhuǎn)染上述8質(zhì)粒的細(xì)胞上清中存在禽流感病毒。4) 血凝試驗(yàn)、MDCK細(xì)胞和雞胚接種 A、血凝試驗(yàn)取紅細(xì)胞懸液l份，用5-10倍量的生理鹽水洗滌3次，直至上清無色透明。 取沉淀紅細(xì)胞，于生理鹽水中制成1%紅細(xì)胞懸液。由轉(zhuǎn)染上述8質(zhì)粒的細(xì)胞得到的病毒液3000rpm離心15分鐘，除去較大顆粒； 轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒(pZL2006)的細(xì)胞上清3000rpm離心15分鐘，除去較大顆粒做為陰 性對(duì)照。在血凝板上將待檢病毒液用生理鹽水作2倍系列稀釋，直至29，每孔25ul。 最后1孔只加生理鹽水作為對(duì)照。隨即向各孔內(nèi)加入25ul的1%紅細(xì)胞懸液，充分 混勻，于室溫放置45分鐘后判定結(jié)果。同時(shí)以轉(zhuǎn)染pZL2006對(duì)照空質(zhì)粒上清液作 為空白對(duì)照，以pHW2000載體系統(tǒng)拯救的病毒為其它類似載體系統(tǒng)對(duì)照。結(jié)果如圖7所示，Bl (PHW2000載體系統(tǒng)拯救病毒)的滴度為26， B2 (PHW2000
載體系統(tǒng)拯救病毒)的滴度為27， Dl (pZL2006載體系統(tǒng)拯救病毒)的滴度為27， D2 (pZL2006載體系統(tǒng)拯救病毒)的滴度為26，表明拯救的禽流感病毒粒子具有血凝活 性及病毒滴度較高。B、 MDCK細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上MDCK細(xì)胞鋪滿單層后，吸掉細(xì)胞孔中的培養(yǎng)基。 每孔接種500ul步驟2)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清，置37。C、 5y。C02作用l小時(shí)。 取出后每孔補(bǔ)加2ml含2%FBS的MEM維持液，置37°C、 5%C02繼續(xù)培養(yǎng)，觀察 細(xì)胞CPE的情況。結(jié)果如圖8所示，表明48小時(shí)后接種轉(zhuǎn)染上述8質(zhì)粒的細(xì)胞上 清的MDCK細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，90%細(xì)胞死亡脫落(圖8 A)，而轉(zhuǎn)染pZL2006 的細(xì)胞上清未出現(xiàn)任何變化(圖8 B)。C、 雞胚接種挑選活力強(qiáng)、胚體發(fā)育好的8日齡的SPF雞胚，在照蛋器上標(biāo)出氣室和胚體的 位置。依次用碘酊和酒精對(duì)氣室部位進(jìn)行消毒處理。利用注射器的針尖在胚體一側(cè)距氣室邊沿上方2-3mm處打孔。用lml注射器吸取轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清，將注射器針頭沿所打孔插入雞胚，深度約0. 5-lcm。每枚雞胚接種O. 2ml。用熔化的蠟燭將接種孔封閉，置濕度合適的37'C孵廂中繼續(xù)孵育，每天觀察雞胚死亡情況。連續(xù)觀察4天。結(jié)果表明接種48小時(shí)后，轉(zhuǎn)染上述8質(zhì)粒的細(xì)胞上清接種的10枚雞胚全部死亡，而轉(zhuǎn)染pZL2006空質(zhì)粒對(duì)照的細(xì)胞上清的10枚雞胚全部存活，證明構(gòu)建的8質(zhì)粒系統(tǒng)pZL2006拯救的病毒粒子對(duì)雞胚具有致死作用。
序列表〈110〉中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所<120>—種拯救流感病毒的方法及其專用雙向轉(zhuǎn)錄載體<130> CGGNAR81875<160〉2<210〉1 <211>3261 〈212〉DNA <213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉1gactcttcgcg"gtacggggcgttgacattgatta"ttgactagttatta60attacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacata120acttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaat180aatgacgtatgttcccatagta^cgcc肌tagggactttccattgacgtcaatgggtgga240ctatttacggtaaactgcccacttggcagttatcatatgccaagtacgcc300ccctattgacgtcaatgacggt3MtggCCcgcctggcattatgcccagtacatgacctt360cctacttggcagtacatctacgtatta^gtcatcgctattaccatggtgat420gcggttttggcagtacatca"gggcgtggatagcggtttg3CtC3Cggggatttccasg480tctccaccccattgacgtcagttttggcacgggactttcc540a肌atgtcgtaacaactccgccccattgacgca犯tgggcggtaggcgtgtacggtggga600ggtctatataagcagagctctctggctaactagag^cccactgcttactggcttatcga660aatta^tacgactcactateiggg卿cccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggt720accgagctcggatccagctgtt犯cgctagcagttaaccggagtaccggtcgacctccga780sgttgggggggetgg卿cggtaccgtctcc3ataacccggcggcccaaaatgccgactcg840
tatacctcccccggggccgggaggtcgcgtC3ccgacc3cgccgccggcc900caggcgacgcgcgacacggacacctgtcccca^sa^cgccaccatcgcagccacacacgg960agcgcccggggccctctggtcaaccccaggacacgcgcgggagcagcgccgggccgggga1020cgccctcccggcggtcacct3aatgctag3gcttctagagggcccgtttaaacccgctga1080tcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcct1140tccttgaccctgg鄉(xiāng)gtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgagg3ttgC31200tcgcattgtctgagt鄉(xiāng)tgtcattctattctggggggtggggtggggcsggacagcaag1260gggga,ttggg肌gac^tagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttct1320actgggcggttttatggacagc肌gcga3ccggaattgccsgctggggcgccctctggta1380鄉(xiāng)ttggg33gccctgcaaagtsaactggstggctttctcgccgccaaggatctgatggc1440gcaggggatc犯gctctgatcaagagacaggatgaggatcgtttcgcatga_ttg33caag1500atggattgcacgcaggttctccggccgcttgggtggggctattcggctatgactggg1560aatcggctgctctgatgccgccgtgttccggctgtcagcgcaggggcgcc1620cggttctttttgtc^gaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcgacgaggcag1680CgCggCt￡LtCgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtca1740ctgaagcgggaagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcat1800ctcaccttgctcctgccgag肌3gtatccatcatggctgatgctgcggcggctgcata1860cgcttgatccggctacctgcccattcgacc3cca_agcga8acatcgcatcgagcgagcac1920gtactcggatgggccggtcttgtcgatcaggatgatctggacgaagagCEitcaggggc1980tcgcgccagccgaactgttcgccaggctcaaggcgagcatgcccgacggcgaggatctcg2040tcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggccgcttttctg2100gattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggcta2160cccgtgatattgctgagcttggcggcgaatgggctgaccgcttcctcgtgctttacg2220gtatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgccttctatcgccttcttgacgagttcttct2280gaattattaacgcttacaatttcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggta2340tttcacaccgcatac￡Lggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgttt2400atttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccct2460tc^t^tagcacgtgct33aacttcatttatct3ggtgaagatcct2520ttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcaga2580ccccgtagaa犯gatc犯3ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg2640
aaaaaac c accgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc2700aactctttttccgaaggtaactggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct2760agtgtagccgtagttaggccaccacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc2820tctgctaatcctgttaccagtggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt2880ggactc^gacgatagttaccggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg2940cac3cagcccagcttggagcgaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct30003tgagaa^gcgccacgcttcccgaagggag犯aggcggac aggtatccgg t犯gcggcag3060ggtcgg雄agg卿gcgcacgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag3120tcctgtcgggtttcgccacctctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg3180gcggagcctatgg犯33acgccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg gcttttgctg3240gccttttgctcacatgttctt3261<210>2 <211>69 <212〉DNA <213〉人工序列〈220〉<223><400>2gtt33cgct3 gc3gtt犯cc ggsgtaccgg tcgacctccg a^gttggggg ggagg3g3cg 60 gtaccgtct 69
權(quán)利要求
1、雙向轉(zhuǎn)錄載體，是在pVAX1的多克隆位點(diǎn)插入RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和RNA聚合酶I的終止子得到的環(huán)狀重組載體；所述RNA聚合酶I的終止子位于所述pVAX1的CMV啟動(dòng)子和所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子之間。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙向轉(zhuǎn)錄載體，其特征在于所述RNA聚合酶I的終 止子和所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子之間具有兩個(gè)相同的限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，所 述限制性內(nèi)切酶切割DNA后產(chǎn)生平末端。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙向轉(zhuǎn)錄載體，其特征在于所述兩個(gè)相同的限制性 內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)為兩個(gè)^s/zfil識(shí)別位點(diǎn)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的雙向轉(zhuǎn)錄載體，其特征在于所述兩個(gè)相同的限制性 內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)之間至少間隔一個(gè)脫氧核糖核苷酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙向轉(zhuǎn)錄載體，其特征在于所述RNA聚合酶I的啟 動(dòng)子的核苷酸序列是序列表中的序列1的自5'末端第811-1032位脫氧核糖核苷酸， 所述RNA聚合酶I的終止子的核苷酸序列是序列表中的序列1的自5'末端第758-792 位脫氧核糖核苷酸；所述雙向轉(zhuǎn)錄載體優(yōu)選為序列1所示的pZL2006。
6、 一種拯救流感病毒的方法，包括以下步驟1) 將流感病毒的PB2編碼基因、PB1編碼基因、PA編碼基因、M編碼基因、NS 編碼基因、NP編碼基因、HA編碼基因和NA編碼基因分別插入權(quán)利要求1至5中任一 所述的雙向轉(zhuǎn)錄載體的RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和RNA聚合酶I的終止子之間，得到8 個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒；所述8個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒為含有PB2編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有 PB1編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有PA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有M編碼基因的 重組表達(dá)質(zhì)粒、貪有NS編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、含有NP編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒、 含有HA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒和含有NA編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒；2) 將所述8個(gè)重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，培養(yǎng)所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，得 到重組流感病毒。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為293T細(xì)胞、 C0S7細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、VER0細(xì)胞、WI-38、 HL-8、 Hela細(xì)胞或Chang C/I/L/K。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述流感病毒為A型流感病 毒、B型流感病毒或C型流感病毒。
9、 由權(quán)利要求6至8中任一所述的方法制備的重組流感病毒。
10、 權(quán)利要求1至5中任一所述的雙向轉(zhuǎn)錄載體在制備重組流感病毒或流感病毒 疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種拯救流感病毒的方法及其專用雙向轉(zhuǎn)錄載體。該雙向轉(zhuǎn)錄載體，是在pVAX1的多克隆位點(diǎn)插入RNA聚合酶I的啟動(dòng)子和RNA聚合酶I的終止子得到的環(huán)狀重組載體；所述RNA聚合酶I的終止子位于所述pVAX1的CMV啟動(dòng)子和所述RNA聚合酶I的啟動(dòng)子之間。本發(fā)明的雙向轉(zhuǎn)錄載體和拯救流感病毒的方法可在拯救流感病毒和制備流感病毒疫苗中的得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101397572SQ20081022558
公開日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2008年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月6日
發(fā)明者劉伯華, 夏玉坤, 張永國(guó), 戰(zhàn)大偉, 義 戶, 靖 李, 楊保安, 祝慶余, 淵 羅 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所