專利名稱：：蘋果s基因型快速鑒定方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種蘋果s基因型的快速鑒定方法及其專用試劑盒與其在篩選蘋果授粉品種中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：蘋果屬于配子體型自交不親和性類型,受單一位點(diǎn)的復(fù)等位基因控制，這一位點(diǎn)又稱為S位點(diǎn)，位于蘋果基因組的第17對染色體上，在一個S位點(diǎn)上蘋果種群內(nèi)含有多個S等位基因。S位點(diǎn)包括花柱S基因(S-RNase基因)和花粉S基因(F-box基因)，自花或者異花授粉時，花粉的S等位基因與花柱中兩個S等位基因之一相同時，花粉管在花柱中的生長會受到抑制，從而無法完成受精而表現(xiàn)出自交不親和性(KaoTH，TsukamotoT.ThemolecularandgeneticbasesofS-RNase-basedself-incompatibility.PlantCell,2004，16:S72陽S83)。蘋果品種的S基因型即為自交不親和基因型，表示各個蘋果品種體內(nèi)的包含的S基因信息。絕大多數(shù)蘋果品種表現(xiàn)自交不親和性，但并不是所有的蘋果品種之間授粉都是親和的，S基因型相同的兩個品種之間相互授粉表現(xiàn)不親和性，稱異交不親和性。因此，提早預(yù)知蘋果品種的s基因型,對于生產(chǎn)上合理配置授粉樹,減少因授粉品種選擇不利造成的損失，以及在選配育種親本，鑒定同名異物和異物同名的蘋果品種等方面具有重要的意義。Lewis(1952)利用血清免疫學(xué)方法從配子體自交不親和的月見草(Oe""&erawg朋M^)中發(fā)現(xiàn)了與S特定位點(diǎn)等位基因相關(guān)的蛋白質(zhì)。此后，從茄科等植物中發(fā)現(xiàn)含量豐富并與S位點(diǎn)遺傳連鎖的花柱糖蛋白。目前為止，已從茄科、薔薇科、玄參科等多種植物中分離出大量S-RNase基因。根據(jù)DNA序列的分析比較，發(fā)現(xiàn)其編碼的蛋白產(chǎn)物與真菌的RNaseRH和RNaseT2具有同源性，含相同的活性部位，并具有核酸酶活性，故稱為S-核酸酶(S-RNase)。目前已有的證據(jù)有力證明了S-RNase就是S-基因在花柱中的產(chǎn)物，即花柱S-決定子。S-RNase為一類分泌型糖蛋白，它在雌蕊中特異表達(dá)，活體情況下S-RNase在自交后表現(xiàn)酶的活性。一般認(rèn)為自交不親和是由于自交后花柱中的S-RNase進(jìn)入花粉管，作為細(xì)胞毒素使自己的花粉管RNA降解，細(xì)胞溶解，導(dǎo)致花粉管生長抑制，表現(xiàn)自交不親和。近年來越來越多的蘋果的S-RNase基因被鑒定和克隆，蘋果花柱的S-RNase核苷酸結(jié)構(gòu)具有明顯的5個保守區(qū)(Cl、C2、C3、RC4禾卩C5)和2個高變區(qū)(HVa禾BHVb)，其位于高變區(qū)(HVa)內(nèi)的內(nèi)含子長度具有多態(tài)性，可以根據(jù)它的這些特點(diǎn)利用PCR來鑒定蘋果品種的S基因型。蘋果作為配子體型自交不親和性果樹,有眾多學(xué)者開展其自交不親和性機(jī)理的研究,就品種自交不親和性基因型的鑒定而言,迄今已鑒定出了30多個S等位基因，但是它們存在命名混亂及重復(fù)現(xiàn)象，有關(guān)學(xué)者經(jīng)過對這些s等位基因進(jìn)行測序比對,重新整理和總結(jié)和命名了23個蘋果S基因(S!、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S1()、Sll、S!5、Si6、Si8、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S26、S31禾口S32)。大多數(shù)蘋果品種為二倍體，含有兩個s等位基因，也有部分品種為三倍體含有三個s等位基因，也有個別單倍體蘋果品種，只含有一個s等位基因。人們最早是利用田間雜交和自交座果率高低的方法來判斷蘋果品種的s基因型的。該方法的優(yōu)點(diǎn)是直觀而且易操作，但其也明顯存在工作量大、鑒定周期長(必須蘋果品種開花之后)、效率低等不足之處，特別是當(dāng)雙親或一個親本的s基因型未知或沒有適當(dāng)?shù)臏y試品種時，就無法確定品種的s基因型。之后的研究發(fā)現(xiàn)，蘋果的s基因在花柱中編碼產(chǎn)物是糖蛋白，具有RNase活性，可以根據(jù)花柱S糖蛋白電泳分析法來確定S基因型，但由于其操作過程較復(fù)雜，特別是等電聚焦聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù)要求較高，而且試驗(yàn)條件不太一致，各S-RNase的PI值可能會有偏差，另外，所用試材是成齡樹的花柱，使取材受限制，而且需要試材量大，尤其研究雜種群體時，需要等待雜種個體渡過童期。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種蘋果S基因型的快速鑒定方法及其專用試劑盒與它們的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的鑒定蘋果S基因型的專用試劑盒，包括下述(1)-(16)所示的引物對(1)擴(kuò)增S!基因的引物對序列為序列表中序列1的核苷酸片段和序列為序列表中序列2的核苷酸片段組成的引物對；(2)擴(kuò)增S2基因的引物對序列為序列表中序列3的核苷酸片段和序列為序列表中序列4的核苷酸片段組成的引物對；(3)擴(kuò)增S3基因的引物對序列為序列表中序列5的核苷酸片段和序列為序列表中序列6的核苷酸片段組成的引物對；(4)擴(kuò)增S4基因的引物對序列為序列表中序列7的核苷酸片段和序列為序列表中序列8的核苷酸片段組成的引物對；(5)擴(kuò)增S5基因的引物對序列為序列表中序列9的核苷酸片段和序列為序列表中序列10的核苷酸片段組成的引物對；(6)擴(kuò)增S7基因的引物對序列為序列表中序列11的核苷酸片段和序列為序列表中序列12的核苷酸片段組成的引物對；(7)擴(kuò)增S9基因的引物對序列為序列表中序列13的核苷酸片段和序列為序列表中序列14的核苷酸片段組成的引物對；(8)擴(kuò)增Sh)基因的引物対序列為序列表中序列15的核苷酸片段和序列為序列表中序列16的核苷酸片段組成的引物對；(9)擴(kuò)增Sn基因的引物對序列為序列表中序列17的核苷酸片段和序列為序列表中序列18的核苷酸片段組成的引物對；(10)擴(kuò)增S^基因的引物對序列為序列表中序列19的核苷酸片段和序列為序列表中序列20的核苷酸片段組成的引物對；(11)擴(kuò)增S2o基因的引物對序列為序列表中序列21的核苷酸片段和序列為序列表中序列22的核苷酸片段組成的引物對；(12)擴(kuò)增S2i基因的引物對序列為序列表中序列23的核苷酸片段和序列為序列表中序列24的核苷酸片段組成的引物對；(13)擴(kuò)增S23基因的引物對序列為序列表中序列25的核苷酸片段和序列為序列表中序列26的核苷酸片段組成的引物對；(14)擴(kuò)增S24基因的引物對序列為序列表中序列27的核苷酸片段和序列為序列表中序列28的核苷酸片段組成的引物對；(15)擴(kuò)增S26基因的引物對序列為序列表中序列29的核苷酸片段和序列為序列表中序列30的核苷酸片段組成的引物對；(16)擴(kuò)增S^基因的引物對序列為序列表中序列31的核苷酸片段和序列為序列表中序列32的核苷酸片段組成的引物對。上述引物分別以溶液形式保存，濃度為10pM—100pM;優(yōu)選為10pM;為了確保PCR反應(yīng)不受鹽等雜質(zhì)的干擾，引物溶劑采用滅菌的超純水。各引物分別保存于一個離心管中，共32管，將這些離心管集中放置于一個試劑盒中，方便隨時取用。上述(1)-(16)所示每個S基因的一對引物優(yōu)選為分別以上下游引物相同的濃度混合置于同一試劑容器中，以便PCR反應(yīng)過程中，上下游引物可以于一次取用，節(jié)省PCR體系配制的程序。上述試劑盒中配有滅菌的超純水、dNTP(10mM)、10xTaqBuffer、Taq酶溶液(5U/pL)，以方便PCR體系的配制。本發(fā)明所提供的鑒定蘋果S基因型的方法，是以待檢測蘋果品種的基因組DNA為模板，用上述試劑盒的引物對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物確定基因型。上述根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物確定基因型的方法是檢測上述試劑盒的引物對是否以待檢測蘋果品種的基因組DNA為模板擴(kuò)增得到DNA片段；如果所述擴(kuò)增Si基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有Si基因，如果所述擴(kuò)增S2基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S2基因，如果所述擴(kuò)增S3基因的.引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S3基因，如果所述擴(kuò)增S4基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S4基因，如果所述擴(kuò)增Ss基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S5基因，如果所述擴(kuò)增S7基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S7基因，如果所述擴(kuò)增S9基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S9基因，如果所述擴(kuò)增Si?；虻囊飳U(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有SH)基因，如果所述擴(kuò)增Sn基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有Su基因，如果所述擴(kuò)增Si9基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有Si9基因，如果所述擴(kuò)增S2?；虻囊飳U(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S2o基因，如果所述擴(kuò)增S"基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S2,基因，如果所述擴(kuò)增S23基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S23基因，如果所述擴(kuò)增S24基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S24基因，如果所述擴(kuò)增S26基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S26基因，如果所述擴(kuò)增S31基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，則所述待測蘋果品種含有S3,基因，該待測蘋果品種含有的所有S基因的組合即為該蘋果品種的S基因型。為了確保精確判斷，上述方法還應(yīng)檢測各引物對擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小，如果所述擴(kuò)增S,基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為733bp，則所述待測蘋果品種含有St基因；如果所述擴(kuò)增S2基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為498bp，則所述待測蘋果品種含有S2基因；如果所述擴(kuò)增S3基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為291bp，則所述待測蘋果品種含有S3基因；如果所述擴(kuò)增S4基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為532bp，則所述待測蘋果品種含有S4基因；如果所述擴(kuò)增S5基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為1446bp，則所述待測蘋果品種含有S5基因；如果所述擴(kuò)增S7基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為396bp，則所述待測蘋果品種含有S7基因；如果所述擴(kuò)增S9基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為521bp，則所述待測蘋果品種含有S9基因；如果所述擴(kuò)增Su)基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為202bp,則所述待測蘋果品種含有Su)基因；如果所述擴(kuò)增Su基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為677bp，則所述待測蘋果品種含有Sn基因；如果所述擴(kuò)增S^基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為480bp，則所述待測蘋果品種含有S,9基因；如果所述擴(kuò)增S2o基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為881bp，則所述待測蘋果品種含有S2o基因；如果所述擴(kuò)增S2i基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為583bp，則所述待測蘋果品種含有S2i基因；如果所述擴(kuò)增S23基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為450bp，則所述待測蘋果品種含有S23基因；如果所述擴(kuò)增S24基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為420bp，則所述待測蘋果品種含有S24基因；如果所述擴(kuò)增S26基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為422bp，則所述待測蘋果品種含有S26基因；如果所述擴(kuò)增Sw基因的引物對擴(kuò)增得到DNA片段，并且大小是為556bp，則所述待測蘋果品種含有S3i基因。所述待檢測蘋果品種的基因組DNA是以待檢測蘋果品種幼葉為材料提取DNA得到的。本發(fā)明所提供的上述方法及其專用試劑盒應(yīng)用于給自交不親和蘋果品種選配合適的授粉蘋果品種。所述篩選用于給自交不親和蘋果品種授粉的蘋果品種的方法是利用上述方法確定蘋果品種的s基因型，選擇與種植蘋果品種具有不同S基因型的蘋果品種作為用于授粉的蘋果品種。本發(fā)明的方法經(jīng)過對蘋果各個S-RNase基因一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列分析，在各基因序列特異區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，建立穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系，用各蘋果品種DNA為模板，對供試蘋果品種基因組DNA特異擴(kuò)增來確定其S基因型。該方法具有方便實(shí)驗(yàn)取材，簡化實(shí)驗(yàn)操作，可快速鑒定蘋果品種的S基因型。將使用的引物制成試劑盒，更方便使用，大大節(jié)省了鑒定時間。該方法可快速鑒定蘋果自交不親和品種S基因型，通過其S基因型篩選授粉樹，對蘋果種植及雜交研究具有重大的應(yīng)用價值。圖i是蘋果S-RNase基因特異性引物PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖。圖2為蘋果S-RNase基因特異性引物PCR擴(kuò)增鑒定S基因型實(shí)例結(jié)果。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、蘋果S基因型的鑒定1、蘋果各S基因特異性片段的擴(kuò)增經(jīng)過對蘋果各個S-RNase基因一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行序列分析，在各基因序列特異區(qū)域設(shè)計(jì)各個S基因的特異性引物，弓l物序列和各引物預(yù)測擴(kuò)增的特異性片段大小如表1所示。表1.蘋果S基因特異性引物<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>分別利用上述引物，從已知s基因型的蘋果品種中擴(kuò)增各個s基因特異性片段，從蘋果品種富士(Fuji)(SiS9)中擴(kuò)增S,、S9基因特異性片段；從蘋果品種金冠(GoldenDelicious)(S2S3)中擴(kuò)增Sz和S3基因特異性片段，從蘋果品種伏花皮(Gravenstein)(S4SS2())中擴(kuò)增S4基因特異性片段，從蘋果品種嘎拉(Gala)(S2S5)中擴(kuò)增S5基因特異性片段，從蘋果品種紅玉(Jonathan)(S7S9)中擴(kuò)增S7基因特異性片段，從蘋果品種旭(Madntosh)(S1()S22)中擴(kuò)增81()基因特異性片段，從蘋果品種維琴尼(Virginiacrad)(SsSu)中擴(kuò)增Sn基因特異性片段，從蘋果品種元帥(Delicious)(S9S19)中擴(kuò)增Sw基因特異性片段，從蘋果品種印度(Indo)(S7S2())中擴(kuò)增S2o基因特異性片段，從蘋果品種楸子(M^^/^m/o/ZaBorkh)(S!Su)中擴(kuò)增Su基因特異性片段，從蘋果品種澳洲青蘋(Gra皿ySm池)(S3S23)中擴(kuò)增823基因特異性片段，從蘋果品種英格蘭(Ingram)(S^^)中擴(kuò)增824基因特異性片段，從蘋果品種光輝(Radiant)(S4S26)中擴(kuò)增826基因特異性片段，從蘋果品種昆瑪斯(Appleofcommerce)(S23S31)中擴(kuò)增S31基因特異性片段。其中，分別以蘋果品種幼嫩葉片，CTAB法提取其基因組DNA作為模板；PCR反應(yīng)體系如表2所示，各引物擴(kuò)增的退火溫度如表l所示。表2:S基因片段的特異性PCR擴(kuò)增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>擴(kuò)增條件為先94"預(yù)變性3min;然后94°C變性30s;退火30s(根據(jù)不同引物選擇退火溫度，如表2所示)；72'C延伸1min;35個循環(huán)；最后72"延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，檢測其大小，結(jié)果如圖l所示，結(jié)果表明，上述每次擴(kuò)增均得到一個預(yù)計(jì)的蘋果品種基因型特異性片段，片段大小與表1所示的預(yù)測擴(kuò)增片段大小一致。圖1中泳道M為分子量Marker(M)，條帶大小從上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，泳道St至S31是各個S基因特異性擴(kuò)增片段電泳圖。2、蘋果S基因型鑒定本發(fā)明的方法鑒定蘋果S基因型，是以待測蘋果品種的基因組DNA為模板，用表1所述16種S基因(Si，S2，S3，S4，S5，S7,S9，Sui，Su，S19，S20，S21，S23，S24，S26，S31)的擴(kuò)增引物對分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后進(jìn)行凝膠電泳，檢測是否可以擴(kuò)增得到PCR產(chǎn)物片段，如果擴(kuò)增得到一個片段，則該蘋果品種的S-RNase基因含有該引物對擴(kuò)增的相應(yīng)S基因，該蘋果品種的S基因位點(diǎn)由該S基因控制，所有控制該蘋果品種S基因位點(diǎn)的S基因種類的組合，即為該蘋果品種的基因型。如果為了精確，可以將電泳檢測的PCR產(chǎn)物片段的大小與表1所示的預(yù)測片段大小進(jìn)行比對，以確保擴(kuò)增片段即為該基因特異性片段。如果表1所示的引物對若擴(kuò)增得到特異性PCR產(chǎn)物片段，則該蘋果品種的S-RNase基因含有該引物對擴(kuò)增的相應(yīng)S基因。上述PCR反應(yīng)的體系如表2所示。為了方便批量檢測，以及方便檢測技術(shù)人員的操作，合成表l所述的引物，并將它們分別以溶液形式保存，濃度為10pM—100^iM;本實(shí)施例為10^M;為了確保PCR反應(yīng)不受鹽等雜質(zhì)的干擾，引物溶劑采用滅菌的超純水。各引物分別保存于一個離心管中，共32管，將這些離心管集中放置于一個試劑盒中，方便隨時取用，即組成了本發(fā)明的蘋果品種S基因型檢測專用試劑盒。為了方便PCR體系的配置，將表l中鑒定每個S基因的一對引物溶于同一溶液中，得到檢驗(yàn)表1中相應(yīng)S基因的引物對溶液，表l中共有鑒定16種S基因的引物對，即試劑盒包括16種引物對溶液。將每個S基因檢測的一對引物溶液保存于一個離心管中。本實(shí)施例中，還在上述試劑盒中配有滅菌的超純水、dNTPUOmM)、10xTaqBuffer、Taq酶溶液(5U/(aL)，以方便PCR體系的配制。利用上述試劑盒，按照上述方法，進(jìn)行PCR擴(kuò)增時擴(kuò)增條件為先94"C預(yù)變性3min;然后94t變性30s;退火30s(根據(jù)不同引物選擇退火溫度，如表2所示)；72。C延伸1min;35個循環(huán)；最后72。C延伸10min。本實(shí)施例以鑒定下述蘋果品種為例，說明本發(fā)明的方法及其專用試劑盒的效果按照上述方法，分別鑒定蘋果自交不親和品種'紅國光，、'昂林，、'巖木，、'靜香，、'秦冠，、'奧州，、'澳洲青萍，、M犬花皮，、'長紅，、'皇后桔蘋，、'姬神，、'北之幸，、'瑞光，、'帝國，、'發(fā)現(xiàn)，、'楸子，、'光輝，和'昆瑪斯'的S基因型。采取以上18個待檢測蘋果品種幼嫩葉片，CTAB法提取其基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，于-2(TC貯存?zhèn)溆?，作為模板。按照上述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5-10)aLPCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖電泳檢測，表1所示的引物對是否擴(kuò)增得到DNA片段，以此判斷該蘋果品種的S-RNase基因含有該引物對擴(kuò)增的相應(yīng)S等位基因。結(jié)果如圖2所示，圖中1-18分別為蘋果品種'紅國光，、<昂林，、'巖木，、'靜香，、'秦冠，、'奧州，、'澳洲青萍，、M犬花皮，、'長紅，、'皇后桔蘋，、'姬神，、'北之幸，、'瑞光，、'帝國，、'發(fā)現(xiàn)，、'楸子，、'光輝，和'昆瑪斯，。可以看出18個蘋果品種中'紅國光'、'昂林，禾P'楸子'在S,中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S,的引物對擴(kuò)增得到S,基因特異性片段；'紅國光'、'巖木'、'靜香'與'秦冠'在S2中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S2的引物對擴(kuò)增得到S2基因特異性片段；'巖木，、'靜香'、'奧州'和"澳洲青萍'在S3中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S3的引物對擴(kuò)增得到S3基因特異性片段；'伏花皮'和'光輝'在S4中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S4的引物對擴(kuò)增得到S4基因特異性片段；'秦冠'、'長紅'和'皇后桔蘋'在S5中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S5的引物對擴(kuò)增得到S5基因特異性片段；'長紅'、'姬神'與'北之幸'在S7中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S7的引物對擴(kuò)增得到S7基因特異性片段；'昂林，、'奧州，、'皇后桔蘋，、'姬神，、'瑞光'在S9中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S9的引物對擴(kuò)增得到S9基因特異性片段；'帝國'與'發(fā)現(xiàn)'在Sw中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S,。的引物對擴(kuò)增得到Su)基因特異性片段；'伏花皮'在Su中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S的引物對擴(kuò)增得到Su基因特異性片段;'瑞光'與'帝國'在Sw中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S,9的引物對擴(kuò)增得到Sw基因特異性片段；'靜香'、'伏花皮，禾卩'北之幸，在S2。中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S2。的引物對擴(kuò)增得到S2?；蛱禺愋云危?楸子'在S^中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S21的引物對擴(kuò)增得到Sa基因特異性片段；'澳洲青萍'與'昆瑪斯'在S23中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S23的引物對擴(kuò)增得到S23基因特異性片段；'發(fā)現(xiàn)'在S24中有擴(kuò)增條帶，即用表l的S24的引物對擴(kuò)增得到S24基因特異性片段；'光輝'在S26中有擴(kuò)增條帶，即用表1的S26的引物對擴(kuò)增得到S26基因特異性片段；'昆瑪斯'在S3沖有擴(kuò)增條帶，艮P用表1的S3,的引物對擴(kuò)增得到Sw基因特異性片段。從而得出'紅國光'的S基因型是SiS2、'昂林，的S基因型是S"9、'巖木'的S基因型是S2Ss、'靜香，的S基因型是S2S3S2Q、'秦冠，的S基因型是S2Ss、'奧州，的S基因型是S3S9、'澳洲青萍'的S基因型是S3S23、M犬花皮，的S基因型是S4SnS2。、'長紅'的S基因型是SsS7、'皇后桔蘋，的S基因型是SsS9、'姬神，的S基因型是S7S9、'北之幸'的S基因型是S7S2。、'瑞光，的S基因型是S9Si9、'帝國'的S基因型是Su)Sw、'發(fā)現(xiàn)'的S基因型是Sk)S24、'楸子'的S基因型是SiS2,、'光輝'的S基因型是S4S26、'昆瑪斯'的S基因型是S23S^上述結(jié)果確定了各個蘋果品種的s基因型，如果具有不同s基因型的蘋果品種所攜帶的s基因均不相同，他們之間可以互相作為授粉樹，確保其坐果率。通過Kobel(1939)的方法(KobelF，SteineggerP，AnlikerJ.WeitereUntersuchungentiberdieBefruchtungsverhItnissederApfel-undBimsorten.LandwJbSchweiz,1939,53:160-191)對上述品種進(jìn)行自交和相互間雜交試驗(yàn)，分析其坐果率，結(jié)果與上述基因型鑒定方法得到的結(jié)論相同。序列表〈160>32<210〉1<211〉23<212><213>人工序列<220〉<223〉〈400〉1tgtaaggcaccgccatatcatac23<210>2<211>25<212〉腿〈213〉人工序列<220>〈223〉<400>2caacctcaaccaattcagtcaatga25<210〉3<211>25<212>腿<213>人工序列〈220〉<223><400〉3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><210>4〈211>23<212〉DNA〈213>人工序列<220>〈223〉〈400>4ttgaggtttggttccttaccatg23〈210>5〈211>24〈212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223〉<400>5ggcgaaaattaaaccggagaagaa24〈210〉6〈211>26〈212>醒〈213〉人工序列〈220〉<223>〈400〉6cctctcgtcctatatatggaaatcac加〈210〉7<211〉25<212〉DNA〈213>人工序列〈220〉〈223><400>7attgcaagacaaggaatcgtcggaa<210>8<211>23〈212>腿<213>人工序列〈220><223>〈400〉8agaaatgtgctctgtttttatcg<210>9〈211>21<212〉腿<213〉人工序列<220〉，〈223〉〈400〉9ggtcaaacccacggcgtctca<210〉10<211>21<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223><400>10attcagttatcccattcttcg21〈210>11〈211〉24<212>薩〈213>人工序列〈220>〈223〉〈400>11agtaaatcaaccgtggatgctcag24<210>12〈211>25<212〉腿<213>人工序列〈220>〈223>〈400>12ttacaatatctacctgtttcctggg25〈210>13〈211〉25〈212>薩<213>人工序列<220〉〈223〉〈400>13ccactttaatcctactccttgtaga25〈210>14<211〉25<212〉NDA<213〉人工序列<220><223〉〈400〉14tcaatttccttctgtgtcctgaatt25<210>15<211〉20<212>NDA<213〉人工序列〈220〉<223〉<400〉15ccaaacgtactcaatcgaag20<210〉16<211>20<212〉NDA<213〉人工序列<220>〈223〉<400>16tcccgtgtcctgaatctccc20<210>17<211>19<212>靈〈213>人工序列<220>〈223〉〈400>17aaatattgcaaggcgccgc19<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<220〉<223〉<400>18tttcaatatctaccagtctccggc24<210>19<211>21<212>腿<213>人工序列〈220>〈223〉<400>19gccttcaaacaagaatggacc21<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220〉<223><400〉20tcaatatccaccaatga.cctgtt23<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