專利名稱：：一種檢測(cè)成人早衰老綜合癥的基因診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測(cè)成人早衰老綜合癥的基因診斷試劑盒，更具體地說(shuō)是一種利用WRN基因2806insA突變檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒及方法可用于該疾病的輔助診斷和新藥丌發(fā)，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：沐e(cuò)rner纟宗合癥(沐e(cuò)rnersyndrome,WS)，又禾爾成人早老癥(Adultprogeria),成人早衰老綜合癥(Adultprematureagingsyndrome)，是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳性疾病。WS的臨床表現(xiàn)主要發(fā)生在結(jié)締組織，內(nèi)分泌系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)等。包括身材矮小，早生華發(fā)，皮膚纖維化、硬皮樣改變，白內(nèi)障，皮下組織鈣化，糖尿病，甲狀腺功能低下，高脂血癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，癡呆，精神分裂癥等。ws患者在童年發(fā)育基本正常，到18歲后開(kāi)始出現(xiàn)各種癥狀，由于皮下脂肪菲薄，以及皮膚纖維化，形成了特殊的面部特征，包括假性突眼，喙?fàn)畋牵谥芊派錉顪霞y，牙齒突出，下頜后縮，被稱為"鳥(niǎo)樣面容"。WS患者可伴發(fā)各種腫瘤，包括軟組織肉瘤，骨肉瘤，黑素瘤，甲狀腺癌，腦(脊)膜瘤等。由于WS患者早期出現(xiàn)多系統(tǒng)老化表現(xiàn)，其壽命大大縮短，平均壽命僅47歲。WS發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)闡明人類衰老的發(fā)生機(jī)制以及老齡化相關(guān)疾病具有重要的借鑒作用，因此WS被稱為"人類老化的天然基因模型"。1992年GOTO等將WRN基因(WRN)定位于8pll.1-21.1，WRN全長(zhǎng)5.2kb，包含35個(gè)外顯子，編碼1432個(gè)氨基酸。WRN蛋白是RecQ家族成員DNA解螺旋酶，它包含了7個(gè)解螺旋酶的基序，其中2個(gè)是ATP結(jié)合蛋白。DNA解螺旋酶的重要作用是在DNA復(fù)制過(guò)程中形成解鏈復(fù)合物，參與DNA解鏈和DM損傷修復(fù)。結(jié)構(gòu)分析顯示W(wǎng)RN蛋白包括蛋白中部的RecQ型解螺旋結(jié)構(gòu)域和N端的核酸酶結(jié)構(gòu)域。WRN蛋白既有3'-5'解螺旋酶活性，又有核酸外切酶活性。在DNA代謝過(guò)程中產(chǎn)生的各種DNA結(jié)構(gòu)均是WRN蛋白的底物。WRN蛋白C端1369-1402個(gè)氨基酸殘基具有核酸定位作用。另外，在RecQ解螺旋酶結(jié)構(gòu)域中949-1092個(gè)氨基酸殘基也具有核酸定位作用。WRN蛋白主要定位在細(xì)胞核仁中，當(dāng)DNA損傷時(shí)WRN蛋白在細(xì)胞核DNA損傷部位聚集。在WRN蛋白C端有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域RecQ解螺旋酶保守結(jié)構(gòu)域(helicaseconservedregion，RQC)和解螺旋酶，核糖核酸酶，C端保守結(jié)構(gòu)(helicase，RNaseD，C-terminalconservedRegion,HRDC)。研究證實(shí)WRN蛋白通過(guò)這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與底物DNA或蛋白相互作用。在WS患者中均發(fā)現(xiàn)WRN基因突變，到2006年共發(fā)現(xiàn)50個(gè)突變點(diǎn)，這些突變包括錯(cuò)義突變、框移突變、無(wú)義突變等，分布于各個(gè)外顯子。WRN基因具有明顯的異質(zhì)性，不同種族突變形式完全不同。目前對(duì)于中國(guó)人群中Werner綜合癥的報(bào)道均為個(gè)案報(bào)道，也缺少基因診斷的研究，對(duì)于中國(guó)人群WRN基因突變熱點(diǎn)研究尚屬空白。經(jīng)過(guò)現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)有Werner綜合癥WRN基因2806insA突變的相關(guān)報(bào)道，中國(guó)人群中WRN基因的發(fā)現(xiàn)，不僅會(huì)促進(jìn)該病發(fā)病機(jī)理等基礎(chǔ)研究的發(fā)展，還將大大促進(jìn)Werner綜合癥的基因診斷和治療的開(kāi)展。通過(guò)產(chǎn)前篩查及新生兒WRN基因突變篩查，可以降低Werner綜合癥患兒的出生率，指導(dǎo)攜帶致病基因的患者生活行為，預(yù)防疾病發(fā)生，大大緩解社會(huì)壓力。另外WRN基因研究對(duì)長(zhǎng)壽與衰老的研究都會(huì)起到重要作用。體外檢測(cè)Werner綜合癥相關(guān)基因WRN的2806insA突變的試劑盒對(duì)于這些學(xué)科研究與發(fā)展都是不可或缺的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供一種診斷成人早衰老綜合癥(Werner綜合征)的方法，通過(guò)檢測(cè)疑似患者的待測(cè)樣本是否存在具有本發(fā)明所述的2806msA突變而確認(rèn)患者是否Werner綜合征，為臨床診斷和治療提供參考。本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供一種成人早衰老綜合癥(Werner綜合征)2806insA突變的試劑盒。本發(fā)明要解決的第三個(gè)技術(shù)問(wèn)題是，提供成人早衰老綜合癥(Werner綜合征)2806insA突變?cè)谠\斷Werner綜合征相關(guān)疾病中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種診斷成人早衰老綜合癥的方法，包括如下步驟(1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織標(biāo)本，提取DNA;(2)以該DNA為模板，以針對(duì)WRN基因所述突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將所得標(biāo)本序列與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比較，確認(rèn)是否有突變；(4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測(cè)個(gè)體是否為WRN基因突變導(dǎo)致的Werner綜合癥。在本發(fā)明中，可采用本領(lǐng)域的檢測(cè)點(diǎn)突變的常規(guī)方法來(lái)檢測(cè)WRN基因的突變位點(diǎn)，如PCR測(cè)序法。在本發(fā)明中使用的PCR引物可以依據(jù)已知的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.()進(jìn)行設(shè)計(jì)，通常為15-30個(gè)堿基，GC含量為45-50%左右，在適當(dāng)?shù)臏囟认屡c木端特異性結(jié)合。在本發(fā)明中，WRN基因的序列參考GenbankGeneID:NM—000553。所述針對(duì)WRN基因所述突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物為WRN2806-F:5'-CCCACGGAGGGTTTCTATCT-3'(SEQIDNo.1)WRN2806-R:5'-GAACCATTGGCAGTGCTGTC-3'(SEQIDNo.2)一種檢測(cè)成人早衰老綜合癥2806insA突變的試劑盒，試劑盒的成分和含量如下，于一20。C保存20ul10XPCR緩沖液(Phamiacia)，4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)Fl(SEQIDNO.1)和Rl(SEQIDNO.2)引物，1.5ml純7K。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中提供一個(gè)檢測(cè)WRN基因突變的試劑盒，本容器內(nèi)裝有用以檢測(cè)WRN基因2806突變的成分，與之同時(shí)提供可以是經(jīng)政府藥物管理機(jī)構(gòu)審核的、有關(guān)藥品或生物制品的制造、使用及銷售信息。例如，采用PCR擴(kuò)增后，直接檢測(cè)樣品中WRN基因突變位點(diǎn)的試劑盒，可含有擴(kuò)增引物、dNTP、用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶及其緩沖液、測(cè)序反應(yīng)所需試劑等的一種或多種。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，以上組分僅是示意性的，例如，所述引物可以采用上述的一對(duì)WRN2806-F和WRN2806-R引物，所述的用于PCR反應(yīng)的DNA聚合酶是能夠用于PCR擴(kuò)增的酶。本發(fā)明通過(guò)神經(jīng)外科門(mén)診收集腦膜瘤患者，在患者及家屬自愿的前提下，簽署知情同意書(shū)后，留取5-10ml血樣，建立住院病歷資料庫(kù)，詳細(xì)記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。然后應(yīng)用酚氯仿抽提方法提取基因組DNA，定量后入庫(kù)，-20°C保存，每份DNA均準(zhǔn)確對(duì)應(yīng)登記的患者臨床資料。根據(jù)PrimerPremier5.0進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，包含WRN基因2806位點(diǎn)及兩側(cè)序列，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增引物相同，應(yīng)用ABI公司3730DNA測(cè)序儀進(jìn)行正反向測(cè)序。將得到的序列與Genbank中的標(biāo)準(zhǔn)序列比對(duì)，確定2806突變位點(diǎn)。按正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定WRN基因突變位點(diǎn)。以巖斜腦膜瘤病人作為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)3例該病家系成員及20例正常對(duì)照的WRN基因編碼區(qū)外顯子的篩査，發(fā)現(xiàn)一名患者在外顯子8上具有WRN基因新的突變。該患者為一復(fù)合雜合子。這個(gè)突變?cè)?0例對(duì)照組中均未被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明這一變位點(diǎn)與WRN基因相關(guān)。插入堿基后導(dǎo)致移碼突變，使得插入點(diǎn)下游的DNA編碼框架全部改變，終止密碼子過(guò)早出現(xiàn)，造成多肽鏈合成的提前終止，肽鏈長(zhǎng)度縮短，成為無(wú)活性的多肽片段。由于WRN蛋白是RecQ家族成員DNA解螺旋酶，插入堿基后導(dǎo)致的移碼突變最終影響了DNA解鏈和DNA損傷修復(fù)。本發(fā)明還提供了WS突變基因在診斷和或治療WS中的應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自患者的待測(cè)樣本中是否存在WRN基因所述突變而判斷患者系統(tǒng)疾病的原因及類型，進(jìn)而為臨床診斷和治療提供參考。此外在進(jìn)一步的臨床治療中，在檢測(cè)結(jié)果為發(fā)生了WRN基因的所述突變之后，可以將正常的基因?qū)霐y帶突變基因的細(xì)胞并在其中表達(dá)，它可與內(nèi)源性突變基因發(fā)生重組，從而可以進(jìn)行基因治療。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明通過(guò)對(duì)3例WS的家系成員及20名正常的對(duì)照成員WRN基因進(jìn)行篩查，發(fā)現(xiàn)WS患者具有2806insA突變位點(diǎn)。20名正常人的篩査未檢測(cè)到該突變，說(shuō)明該突變位點(diǎn)與WRN基因密切相關(guān)。本發(fā)明首次提供了中國(guó)人群中存在WRN基因的--種突變，并且說(shuō)明了該突變基因與WS癥的相關(guān)。同時(shí)，本發(fā)明提出了通過(guò)檢測(cè)患者中是否存在WRN基因突變而判斷WS綜合癥發(fā)生的原因和檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)單、成本低，檢測(cè)結(jié)果直接、可靠，適用于對(duì)Werner綜合癥WRN基因2806insA突變的大規(guī)模的篩査和診斷。下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一歩敘述，以使公眾對(duì)
發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對(duì)本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所進(jìn)行的任何本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。圖1為為本發(fā)明方法WRN基因外顯子18的部分測(cè)序結(jié)果，上方為突變序列，下方位正常對(duì)照序列，箭頭所指為突變位點(diǎn)。具體實(shí)施方式實(shí)施例l:WRN基因2806雜合突變的檢測(cè)方法一.研究對(duì)象通過(guò)神經(jīng)外科門(mén)診收集腦膜瘤患者，在患者及家屬自愿的前提下，簽署知情同意書(shū)后，留取5-10ml血樣，建立住院病歷資料庫(kù)，詳細(xì)記錄患者病情、家系中發(fā)病情況以及聯(lián)系方式。本研究己得到了本單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。二.制備基因組DNA第一天1.在抗凝劑EDTA存在下，將收集的5-10ml人外周血在2500rpm，離心分離30分鐘除去血清；2.加入0.2%NaCl溶液，使總體積為50ml。輕輕振蕩溶液5-6次，并使其放置于冰上15分鐘；3.在2500rpm離心分離30分鐘，借此收集沉淀物；4.用0.2%的NaCl溶液，以類似于前面的方式再進(jìn)行洗滌；5.在如此獲得的沉淀物中，加入lOmMTris-HCl(pH8.O)和10mMEDTA(4ml)，以懸浮該沉淀物；6.將10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K禾tllOmg/ml的RNaseA加入懸液中，其加入量分別為4ml、16ul和20ul，接著上下顛倒懸液輕輕混合；7.在37'C過(guò)夜溫育懸液。弟一天1.加入4ml酚/Tris溶液，上下顛倒混合物混合所得的混合物；2.以3000rpm進(jìn)行離心分離IO分鐘除去水層；3.將水層和4ml酚/氯仿溶液混合，接著逆混合并以3000rpm離心分離10分鐘；4.除去水層，用氯仿提取兩次，以獲得水相，往其中加1/10，3MNaAC(pH5.2)，兩倍量的冷無(wú)水乙醇，使DNA沉淀；5.用70%的乙醇洗滌以獲得基因組DNA;6.使這樣獲得的DNA，基因組DNA溶解于TE中，然后定量測(cè)定混合物在260nm的吸收率；7.DNA工作液濃度校正至50ng/ul，置-2(TC冰箱保存。三.WRN基因2806的PCR擴(kuò)增1.引物序列上游引物:WRN2806-F:5'-CCCACGGAGGGTTTCTATCT-3'下游引物WRN2806-R:5'-GAACCATTGGCAGTGCTGTC-3'2.PCR反應(yīng)體系表1:PCR反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2:WRN基因2806片段PCR反應(yīng)過(guò)程<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>三.測(cè)序PCR結(jié)束后，產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，委托美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司(Invitrogen)完成。四.突變分析應(yīng)用DNAStat5.0(LasergeneInc.)軟件包終的SeqmanTM軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。將測(cè)序得到的序列與NCBI檢索到的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，找到突變序列，發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。結(jié)果如圖l所示，插入堿基后導(dǎo)致移碼突變，使得插入點(diǎn)下游的DNA編碼框架全部改變，終止密碼子過(guò)早出現(xiàn)，造成多肽鏈合成的提前終止，肽鏈長(zhǎng)度縮短，成為無(wú)活性的多肽片段。i于WRN蛋白是RecQ家族成員DNA解螺旋酶，插入堿基后導(dǎo)致的移碼突變最終影響了DNA解鏈和DNA損傷修復(fù)。實(shí)施例2:WRN基因2806雜合突變的檢測(cè)的試劑盒一.成分包含有可擴(kuò)增出WRN基因2806雜合突變位點(diǎn)的引物對(duì)，及其測(cè)序相應(yīng)試劑，成分和含量如下，于一20。C保存20ul10XPCR緩沖液(Pharmacia)，4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)Fl(SEQIDNO.1)和Rl(SEQIDNO.2)引物(自制)，1.5ml純水(自制)。二.所述試劑盒的使用方法主要包括如下步驟(1)提取待測(cè)血樣的DNA，利用序列表SEQIDNo.1、SEQIDNo.2所示的一對(duì)WRN2806-F和WRN2806-R引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；(2)PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后直接測(cè)序，將得到的序列與Genebank中的標(biāo)準(zhǔn)序列確定突變位點(diǎn)的存在。(3)按照正常閱讀框進(jìn)行翻譯以確定數(shù)否存在所述氨基酸突變位點(diǎn)。具體方法參見(jiàn)前面實(shí)施例中的詳細(xì)描述。本試劑盒可以簡(jiǎn)便快捷地檢測(cè)WRN基因所述突變位點(diǎn)，從而應(yīng)用于WS病例的突變檢測(cè)及診斷治療。序列表<110>北京市神經(jīng)外科研究所首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院<120〉一種檢測(cè)成人早衰老綜合癥的基因診斷試劑盒<130〉<160〉2〈170>Patent.Inversion3.5<210〉1〈211〉20〈212〉DNA<213〉人工合成，引物1<400>1cccacggagggtttctatct〈210〉2〈211〉20<212〉DNA〈213>人工合成，引物2〈400〉2g肌CCElttggCElgtgCtgtC權(quán)利要求1.一種診斷成人早衰老綜合癥的方法，包括如下步驟(1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織標(biāo)本，提取DNA；(2)以該DNA為模板，以針對(duì)WRN基因所述突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將所得標(biāo)本序列與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比較，確認(rèn)是否有突變；(4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測(cè)個(gè)體是否為WRN基因突變導(dǎo)致的成人早衰老綜合癥。2.成人早衰老綜合癥2806insA突變?cè)谠\斷Werner綜合征相關(guān)疾病中的應(yīng)用。3.—種檢測(cè)成人早衰老綜合癥的試劑盒，其特征在于所述試劑盒的成分和含量如下，于一20'C保存20ul10XPCR緩沖液(Pharmacia)，4ul10mMdNTP混合液(Pharmacia)，2ul(5unit/ul)TaqDNA聚合酶(Takara)，各10ul(10pmol/ul)Fl(SEQIDNO.1)和Rl(SEQIDNO,2)引物，1.5ml純水。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)成人早衰老綜合癥的基因診斷試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。一種診斷成人早衰老綜合癥的方法，包括(1)采集待測(cè)個(gè)體的血液、體液或組織標(biāo)本，提取DNA；(2)以該DNA為模板，以針對(duì)WRN基因所述突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；(3)將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析，將所得標(biāo)本序列與正?；蛐蛄羞M(jìn)行比較，確認(rèn)是否有突變；(4)根據(jù)以上結(jié)果判斷待測(cè)個(gè)體是否為WRN基因突變導(dǎo)致的成人早衰老綜合癥。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是首次提供了在中國(guó)人群中存在WRN基因的一種突變，并且說(shuō)明了該突變基因與WS癥的相關(guān)。本發(fā)明檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、成本低，檢測(cè)結(jié)果直接、可靠，適用于對(duì)Werner綜合癥WRN基因2806insA突變的大規(guī)模的篩查和診斷。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101403008SQ200810225968公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月7日優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日發(fā)明者震吳,張俊廷,張力偉,王忠誠(chéng),郝淑煜申請(qǐng)人:北京市神經(jīng)外科研究所;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院