專利名稱：：一種酯酶新基因及其重組表達(dá)體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及不可培養(yǎng)微生物的基因克隆及表達(dá)。
背景技術(shù)：
：數(shù)量巨大的不可培養(yǎng)的微生物中蘊(yùn)藏著豐富的資源優(yōu)勢(shì)，宏基因組的研究為挖掘這一資源優(yōu)勢(shì)提供了可靠的技術(shù)保障。95%的海洋微生物在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下無(wú)法或很難實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)，直接從環(huán)境中提取DNA,建立理論上可以覆蓋環(huán)境中所有微生物的遺傳信息宏基因組文庫(kù)。在海洋深度100米以上的極端環(huán)境中獲得的基因片段，將這些基因異源表達(dá)，有可能得到具有應(yīng)用價(jià)值的新基因。通過(guò)構(gòu)建海洋底泥宏基因組文庫(kù)，保存海洋微生物的基因多樣性，以利于不同類型新型基因的研究與開(kāi)發(fā)利用。脂肪酶和酯酶是重要的工業(yè)酶制劑品種，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。不同來(lái)源的酯酶和脂肪酶具有不同的催化特點(diǎn)和催化活力。其中用于有機(jī)相合成的具有轉(zhuǎn)酯化或酯化功能的脂肪酶和酯酶的規(guī)?；a(chǎn)對(duì)于酶催化合成精細(xì)化學(xué)品和手性化合物有重要意義。當(dāng)前能源危機(jī)備受人們的關(guān)注，傳統(tǒng)化石能源已不能滿足人類的需求，通過(guò)脂肪酶生物催化作用合成生物柴油的技術(shù)，具有提取簡(jiǎn)單、反應(yīng)條件溫和、醇用量小、甘油易回收和無(wú)廢物產(chǎn)生、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明擬從海洋底泥宏基因組文庫(kù)中篩選抗逆性強(qiáng)，性質(zhì)優(yōu)良的新型酯酶和脂肪酶基因，為生物柴油的轉(zhuǎn)化和制備工藝提供備選資源。發(fā)明人在前期的工作中，成功構(gòu)建了我國(guó)南海0100米深底泥宏基因組文庫(kù)，該庫(kù)容DNA達(dá)194MB，經(jīng)酶切、連接和轉(zhuǎn)化，共獲得118,000個(gè)含有外源基因片段的重組子，其外源片段長(zhǎng)度在1.0-8.0Kb之間。建立了酯酶和脂肪酶的篩選模型，為下一步篩選提供了技術(shù)保障。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種新的酯酶基因，用于脂類降解及其他油脂類化合物的生物轉(zhuǎn)化。本發(fā)明從南海底泥宏基因組文庫(kù)中，通過(guò)功能篩選獲得一種新的酯酶基因eW^7，其核苷酸序列如SEQIDNo.l所示。eW大小為891bp，石威基組成226A(25.4%),232C(26.0%)，247G(27.7%),186T(20.9%)，0其他(0.0%);編碼蛋白大小為296aa,其氨基酸序列如序列表SEQIDNo.2所示。將該基因序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與之相似性最高為59%的蛋白來(lái)源于一株未培養(yǎng)細(xì)菌的酯酶/脂肪酶(其在GenBank的注冊(cè)號(hào)為ABQ11268)。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Est_pl具有完整的a/卩水解折疊保守結(jié)構(gòu)域(COG0596)，該結(jié)構(gòu)域包含了絲氨酸、谷氨酸和組氨酸組成的催化三聯(lián)體，構(gòu)成酯酶/脂肪酶的催化中心，歸屬于酯酶/脂肪酶超級(jí)家族(cl09107)。綜上所述，EsU)l應(yīng)為酯酶/脂肪酶超級(jí)家族(c109107)一名新成員。將M^p7克隆到表達(dá)載體pET28a并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到pET28a-Est_pl/BL21重組表達(dá)體系。搖瓶培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)Est_pl，經(jīng)純化后獲得Est_pl，SDS-PAGE表明其表觀分子量為33.5kD，與預(yù)測(cè)值相符；通過(guò)酯酶活力測(cè)定表明Est_pl能夠特異地打斷化合物pNP-丁酸酯的酯鍵；通過(guò)對(duì)Estjl的最適反應(yīng)pH測(cè)定表明，其最適反應(yīng)pH值為pH8.57，偏堿性；通過(guò)對(duì)Estjl的最適反應(yīng)溫度測(cè)定表明，其最適反應(yīng)溫度約為40°C。酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定表明，Est_pl的最適底物為pNP-丁酸酯，對(duì)于酰基碳鏈較短酯類的水解活力優(yōu)于長(zhǎng)鏈酯類。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響Est一jDl蛋白活性的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響表達(dá)的條件下，可對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對(duì)SEQIDNo.l所示的核苷酸序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，且編碼上述蛋白的核苷酸序列。進(jìn)而，本發(fā)明還提供一種含有上述基因的克隆載體或表達(dá)載體，含有所述載體的宿主細(xì)胞。進(jìn)一步，本發(fā)明還提供一種制備Estjl的方法，其是通過(guò)培養(yǎng)含有上述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離得到Est_pl。本發(fā)明還提供所述Estjl在催化解酯、酯交換或酯合成中的應(yīng)用。優(yōu)選的反應(yīng)pH值為pH8.57，優(yōu)選反應(yīng)溫度為40。C。本發(fā)明從我國(guó)海洋底泥宏基因組文庫(kù)中釣出新型酯酶基因不僅為酯酶家族增添了新成員，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，可以應(yīng)用于酶法合成酯產(chǎn)品，將有望成為補(bǔ)充和取代部分化學(xué)合成產(chǎn)品的新生產(chǎn)工藝的備選者。該酶的生產(chǎn)，將會(huì)在生物柴油制備(催化解脂，酯交換等反應(yīng))，廢紙漿脫墨再生等工藝中顯示其重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。圖1顯示的是pNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2顯示的是表達(dá)產(chǎn)物Est_pl各純化階段的SDS-PAGE圖，其中，M:低分子量蛋白Marker;CL:粗酶提取液；FL:NTA-Agarose柱流出液；EL:Est_pl蛋白于50mM咪唑溶液洗脫；圖3顯示的是pH對(duì)Estjl活性的影響；圖4顯示的是溫度對(duì)酯酶Estjl活性的影響；圖5顯示的是Est_pl在pNP-丁酸酯和pNP-癸酸酯底物條件下的雙倒數(shù)曲線圖，其中圖5A是測(cè)定底物為pNP-丁酸酯的Est_pl動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定，圖5B是測(cè)定底物為pNP-癸酸酯的Est_pl動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1j57基因的獲得1.文庫(kù)初篩將文庫(kù)中的菌株稀釋涂布在含有1%三丁酸甘油酯的LB平板上，37"培養(yǎng)，12天后挑出產(chǎn)生透明圈的菌落備用；2.文庫(kù)復(fù)篩將挑取得菌株重新點(diǎn)接在含有1%三丁酸甘油酯的LB平板上，37°C培養(yǎng)，12天后確定并挑選出產(chǎn)生透明圈的菌落。3.挑取產(chǎn)生透明圈的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，通過(guò)TIANGEN質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送公司測(cè)序；4.測(cè)序結(jié)果該質(zhì)粒外源DNA插入片斷大小為3650bp。通過(guò)ORFFinder預(yù)測(cè)得到4段完整的ORF序列。其中，編碼酯酶或脂肪酶的基因eWj77位于插入片斷的7281618bp。eW大小為891bp,其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.l所示編碼蛋白大小為296aa。將該基因序列在GenBank中進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與之相似性最高為59%的蛋白來(lái)源于一株未培養(yǎng)細(xì)菌的酯酶/脂肪酶(其在GenBank的注冊(cè)號(hào)為ABQ11268)。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，Est_pl具有完整的a/p水解折疊保守結(jié)構(gòu)域(COG0596),該結(jié)構(gòu)域包含了絲氨酸、谷氨酸和組氨酸組成的催化三聯(lián)體，構(gòu)成酯酶/脂肪酶的催化中心，歸屬于酯酶/脂肪酶超級(jí)家族(cl09107)。綜上所述，Est_pl應(yīng)為酯酶/脂肪酶超級(jí)家族(clO需)一名新成員。5、根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR，得到MUW完整基因。PCR引物5，-CATGCCATGGCAAACATTATTGCG5，-ACGCGTCGACGATAAAAATTTTTTGGGTPCR反應(yīng)體系dNTPs(2mM)KOD酶(lU/pl)0.2|il10xPCR反應(yīng)緩沖液2|ilMgS04(25mM)0.5(il上游引物l^il下游引物l^il質(zhì)粒模板lfilddH2013.3|il總體積20(ilPCR反應(yīng)條件94°C，預(yù)變性2min;94°C,變性15s;51°C,退火30s;68°C，延伸lmin;共30個(gè)循環(huán)；68°C,再延伸lOmin。以MarkerIV為DNA分子量標(biāo)記，甲基溴酚蘭為染料，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。實(shí)施例2Est一pl表達(dá)體系的構(gòu)建及其酶學(xué)活性考察1、Est_pl表達(dá)體系的構(gòu)建設(shè)計(jì)在Est_pl的5，端和3，端分別引入A^I和IoI酶切位點(diǎn)，交付上海生工合成，測(cè)序正確后用于構(gòu)建表達(dá)載體。用A^I和^/zo1對(duì)合成的as/基因進(jìn)行雙酶切；2Vco1和5WI對(duì)pET28a(Novagen)載體進(jìn)行雙酶切，然后用DNA連接酶將上述片斷連接，最后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，在LB(含kan50yg/ml)平板上培養(yǎng)，初步篩選陽(yáng)性克隆，經(jīng)酶切驗(yàn)證后得到pET28a-Estjpl/BL21重組表達(dá)體系。2、目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化；，本例釆用Ni-agarose親和層析純化(pET表達(dá)系統(tǒng))目的蛋白，具體步驟如下1)誘導(dǎo)培養(yǎng)將表達(dá)菌株接種到裝有5mlLB(含kan50ng/ml)的試管中，37°C、轉(zhuǎn)速250rpm、培養(yǎng)至OD600-0.5。以1%(V/V)接種量將菌液轉(zhuǎn)接到500ml同樣的培養(yǎng)基中，當(dāng)OD600為0.51.0之間時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mM誘導(dǎo)1215小時(shí)。2)蛋白粗提將經(jīng)誘導(dǎo)的培養(yǎng)物10000g、4°C、離心10分鐘收集細(xì)胞，用裂解緩沖液洗滌2次。溶于30ml裂解緩沖液中，超聲波破碎細(xì)胞(240伏特，3秒超聲波破壁，7秒間歇，60個(gè)循環(huán))后，離心(15000g、4°C、IO分鐘)，取上清。3)蛋白純化i.往柱子內(nèi)添加lmlNi-agarose，用10倍體積雙蒸水洗滌，并用適量裂解緩沖液平衡柱子。ii.將Ni-agarose取出，與蛋白粗提液以體積比1:4混合，轉(zhuǎn)速200rpm，水浴結(jié)合1小時(shí)。iii.將結(jié)合后的Ni-agarose與蛋白粗提液重新添加到柱子中，用50倍體積的裂解緩沖液平衡柱子。iv.用50倍體積的清洗緩沖液洗去未結(jié)合的蛋白，直到流出液中蛋白含量為零。v.用5倍柱體積的洗脫緩沖液洗脫。用1,5ml離心管，每管收集10滴。vi.洗脫結(jié)束后進(jìn)行柱體保存。依次用10倍柱體積的0.3M乙酸、10%甘油、雙蒸水洗滌，30%乙醇浸泡，4。C保存。vi.電泳分析目的蛋白，將合乎要求的蛋白透析，進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定。裂解緩沖液50mMNaH2PO4、300mMNaCl、10mM咪哇，用NaOH調(diào)pH至8.0。清洗緩沖液50mMNaH2PO4、300mMNaGt、20mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0。洗脫緩沖液50mMNaH2PO4、300mMNaCl、50mM咪唑，用NaOH調(diào)pH至8.0。透析緩沖液50mMNaH2P04、300mMNaCl，用NaOH調(diào)pH至8.0。3、酯酶酶活測(cè)定酯酶可以特異地打斷化合物pNP-脂肪酸酯的酯鍵，釋放出相同物質(zhì)的量的脂肪酸和pNP,而pNP在堿性環(huán)境下405nm處有特殊的吸收峰，通過(guò)測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物pNP的生成量來(lái)計(jì)算脂肪酶/酯酶的活力。反應(yīng)體系為Buffer940|ilpNP-脂肪酸酯10^1無(wú)水乙醇40fil酶液lOpl將緩沖液、底物溶液(pNP-丁酸酯，4-Nitrophenylbutyrate購(gòu)自Sigma)和無(wú)水乙醇在40'C水洛中保溫lOmin,加入適當(dāng)稀釋的酶液(0.128mg/ml),反應(yīng)3min,測(cè)定405nm的吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。酶活單位(unit)定義為，在上述反應(yīng)條件下，每分鐘釋放出l(imolpNP的酶量為一個(gè)酶活單位。。",ApNPA化5X稀釋倍數(shù)酶活力(iamol/min'm1^——x100='冊(cè)歸x100ttXpNP消光系數(shù)酶活力Omol/min'ml)-(14.312+3+16.731)x100=28.514比酶活0^101/11^11'11^)=28.514+0.128=222.7654、酶學(xué)性質(zhì)分析1)SDS-PAGE方法測(cè)定分子量SDS-PAGE方法測(cè)定酶的亞基分子量，根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白在SDS-PAGE中的相對(duì)遷移率Rf作圖，得其分子量。結(jié)果如圖2所示，Est_pl的SDS-PAGE表觀分子量約為33.5kDa。并且SDS-PAGE電泳表明，經(jīng)過(guò)Ni-agarose親和層析純化后的Est_pl可達(dá)到電泳純。2)酶的最適反應(yīng)pH值配制各種50mM的緩沖液，pH分別為3.12、4.55、5.11、5.53、6.15、6.45的獰檬酸緩沖液，pH分別為6.33、6.62、6.94、7.33、7.45、7.83、8.09的MOPS緩沖液，pH分別為6.9、7.16、7.55、8.05、8.57、8.93的Tri-HCl緩沖液，pH分別為8.94、9.42、9.95的CHES緩沖液，以及pH分別為9.73、9,9、10,41、10.88的CAPS緩沖液。將酶液分別加入到上述pH的緩沖液中，按標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以酶活最高者定位100%，以相對(duì)活力和對(duì)應(yīng)的pH值作圖。結(jié)果表明(圖3),Est_pl的最適pH值約為pH8.57,偏堿性。3)酶的最適反應(yīng)溫度將底物溶液和pH8.57、50mmol/L的Tri-HCl緩沖液分別在0°C、5°C、9。C、15°C、18。C、24.5。C、30.5。C、35°C、37°C、40°C、42。C、45°C、50°C、55°C、60°C的不同溫度的水洛中保溫lOmin,然后加入酶液按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，得到酶液在不同反應(yīng)溫度下具有的酶活力，以酶活最高者定為100%，以相對(duì)活力對(duì)溫度作圖。，結(jié)果表明(圖4)，酶的最適反應(yīng)溫度約為40°C。4)酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定釆用的底物為pNP-丁酸酯(4-Nitrophenylbutyrate)和pNP-癸酸酯(4-Nitrophenylstearate)購(gòu)自Sigma公司，配制一系列不同濃度的底物，使反應(yīng)體系中底物的濃度分別為O.lmM、0.05mM、0.025mM、0.0125mM、0扁25mM、0扁13mM。將配好的底物、無(wú)水乙醇和pH8.57的Tri-HCl緩沖液在4(TC下預(yù)熱10min，分別加入10pl適當(dāng)稀釋的酶液(稀釋后0.0128mg/ml),根據(jù)底物濃度和測(cè)得的反應(yīng)初速度v(計(jì)算公式同酶活力測(cè)定)，以1/[S]對(duì)1/v作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖，求得《m，《cat，i^at/《m。結(jié)果表明(見(jiàn)圖4及表2)，Est_pl的較佳的底物是pNP-丁酸酯，對(duì)于?；兼溳^長(zhǎng)酯類的水解活力不如短鏈酯類，因此，EstjDl是一個(gè)酯酶。計(jì)算公式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>][E]為酶蛋白濃度表2不同底物的Estjl的酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>ArgMetLysGlyGluGluPheArgProProTyrThrLeuGluAspMet859095gccgacgatgcggtcgggctgctggatgetttagaaateg3aaaggcc336AlaAspAspAlaValGlyLeuLeuAspAlaLeuGlulieGluLysAla100105110catgtctgcggtatgteaatgggagggatgategcccagaccateggg384HisValCysGlyMetSerMetGlyGlyMetlieAlaGinThrlieGly115120125ctgaatcatcagcagegggtgttaageetcatttegatatacagecat432LeuAsnHisGinGinArgValLeuSerLeulieSerlieTyrSerHis130135140acgggcaaccctgaacttccgccgccgacacccgaagcattggaatac480ThrGlyAsnProGluLeuProProProThrProGluAlaLeuGluTyr145150155160ctggtcacgccgccacctatggaacgtgaagccaacateacctatacc528LeuValThrProProProMetGluArgGluAlaAsnlieThrTyrThr165170175etcgatgtgtggcgcacgtttteagggaagggctttccgctggatgag576LeuAspValTrpArgThrPheSerGlyLysGlyPheProLeuAspGlu180185190gattggaacagaaaaategccgccaaagcctatgaccgcgccttttac624AspTrpAsnArgLyslieAlaAlaLysAlaTyrAspArgAlaPheTyr195200205ccggaaggcgtggcccgtcagatggcggccgtcttaacccaaaaaaat672ProGluGlyValAlaArgGinMetAlaAlaValLeuThrGinLysAsn210215220cgaaaattcgaactgggtteggtcaccatgcccacactggtgattcac720ArgLysPheGluLeuGlySerValThrMetProThrLeuVallieHis225230235240ggagccgatgacccgctggtgccggttgaaggcggcaaagatacggetGlyAlaAspAspProLeuValProValGluGlyGlyLysAspThrAla245250255768gaagcaataccgggggetgagctgataateattgacggaatgggacacGluAlalieProGlyAlaGluLeulielielieAspGlyMetGlyHis260265270816gatctgccgcatggtggagcctggccgcagatagtcgatgcgategtaAspLeuProHisGlyGlyAlaTrpProGinlieValAspAlalieVal275280285864aatcacAsnHis290ThrGin3333tttttLysliePhe295atelietg3891〈210>2〈211〉296<212〉PRT<213〉未知<400>2MetAlaAsnlielieAlaAsnGlylieGinlieGluTyrAspThrPhe151015GlyAsnProAspGluProProLeuLeuLeulieMetGlyLeuAlaCys202530GinLeulieHisTrpAspGluAspLeuCysGluGinLeuAlaArgArg354045GlyHisTyrVallieArgPheAspAsnArgAspThrGlyLeuSerThr505560LysPheAlaGluAlaGlylieProAsplieGlyGinlielieGluAla65707580ArgMetLysGlyGluGluPheArgProProTyrThrLeuGluAspMet859095AlaAspAspAlaValGlyLeuLeuAspAlaLeuGlulieGluLysAla100105110HisValCysGlyMetSerMetGlyGlyMetlieAlaGinThrlieGly115120125LeuAsnHisGinGinArgValLeuSerLeulieSerlieTyrSerHis130135140ThrGlyAsnProGluLeuProProProThrProGluAlaLeuGluTyr145150155160LeuValThrProProProMetGluArgGluAlaAsnlieThrTyrThr165170175LeuAspValTrpArgThrPheSerGlyLysGlyPheProLeuAspGlu180185190AspTrpAsnArgLyslieAlaAlaLysAlaTyrAspArgAlaPheTyr195200205ProGluGlyValAlaArgGinMetAlaAlaValLeuThrGinLysAsn210215220ArgLysPheGluLeuGlySerValThrMetProThrLeuVallieHis225230235240GlyAlaAspAspProLeuValProValGluGlyGlyLysA印ThrAla245250255GluAlalieProGlyAlaGluLeulielielieAspGlyMetGlyHis260265270A印LeuProHisGlyGlyAlaTrpProGinlieValAspAlalieVal275280285AsnHisThrGinLysliePhelie290295<210〉3<211>304<212>PRT〈213>未知〈400〉3MetAlaAsnlielieAlaAsnGlylieGinlieGluTyrAspThrPhe151015GlyAsnProAspGluProProLeuLeuLeulieMetGlyLeuAlaCys202530GinLeulieHisTrpAspGluAspLeuCysGluGinLeuAlaArgArg354045GlyHisTyrVallieArgPheAspAsnArgAspThrGlyLeuSerThr505560LysPheAlaGluAlaGlylieProAsplieGlyGinlielieGluAla65707580ArgMetLysGlyGluGluPheArgProProTyrThrLeuGluAspMet859095AlaAspAspAlaValGlyLeuLeuAspAlaLeuGlulieGluLysAla100105110HisValCysGlyMetSerMetGlyGlyMetlieAlaGinThrlieGly115120125LeuAsnHisGinGinArgValLeuSerLeulieSerlieTyrSerHis130135140ThrGlyAsnProGluLeuProProProThrProGluAlaLeuGluTyr145150155160LeuValThrProProProMetGluArgGluAlaAsnlieThrTyrThr165170175LeuAspValTrpArgThrPheSerGlyLysGlyPheProLeuAspGlu180185190AspTrpAsnArgLyslieAlaAlaLysAlaTyrAspArgAlaPheTyr195200205ProGluGlyValAlaArgGinMetAlaAlaValLeuThrGinLysAsn210215220ArgLysPheGluLeuGlySerValThrMetProThrLeuVallieHis225230235240GlyAlaAspAspProLeuValProValGluGlyGlyLysAspThrAla245250255GluAlalieProGlyAlaGluLeulielielieA印GlyMetGlyHis260265270AspLeuProHisGlyGlyAlaTrpProGinlieValAspAlalieVal275280285AsnHisThrGinLysliePhelieValGluHisHisHisHisHisHis290295300<210〉4<211>24<212>DNA〈213〉人工序列<400>4CATGCCATGGCAAACATTATTGCG24<210〉5<211>28<212〉DNA<213>人工序列<400〉5ACGCGTCGACGATAAAAATTTTTTGGGT28權(quán)利要求1、一種酯酶，其氨基酸序列為SEQIDNo.2所示的氨基酸序列，或該序列經(jīng)缺失、添加和/或替換一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。2、編碼權(quán)利要求1所述酯酶的基因。3、如權(quán)利要求2所述的基因，其核苷酸序列為SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，或該序列經(jīng)缺失、添加和/或替換一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，且編碼相同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。5、如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其源自pET28a。6、含有權(quán)利要求4或5所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。7、如權(quán)利要求6所述的宿主，其為大腸桿菌。8、權(quán)利要求1所述酯酶在催化解酯、酯交換或酯合成中的應(yīng)用。9、一種制備權(quán)利要求l所述酯酶的方法，其是通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求6或7所述的宿主細(xì)胞，從培養(yǎng)物中分離得到所述酯酶。10、如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)活化取權(quán)利要求7所述宿主的單菌落于5ml含kan50昭/ml的LB培養(yǎng)基中，于37°C、250rpm培養(yǎng)至OD600-0.5;2)培養(yǎng)以1%接種量將菌液轉(zhuǎn)接到500ml含kan50昭/ml的LB培養(yǎng)基中，于37°C、250rpm培養(yǎng)至OD600為0.51.0之間；3)誘導(dǎo)向菌液中添加IPTG至終濃度為0.5mM,于30。C、250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)1215小時(shí)。4)收集細(xì)胞4°C、10000g離心10分鐘收集細(xì)胞；棄上清，沉淀以lxPBS緩沖液洗滌2遍，細(xì)胞重懸浮于3040mlPBS緩沖液中；5)獲取粗酶提取液冰洛條件下，超聲波破碎細(xì)胞；細(xì)胞破壁后，以4。C、15000g離心10分鐘，收集上清即粗酶提取液。全文摘要本發(fā)明提供了一種酯酶新基因Est_p1及其重組表達(dá)體系。該基因克隆自中國(guó)南海海底100米深海洋底泥的宏基因組文庫(kù)?；蛉L(zhǎng)891bp，編碼296氨基酸。構(gòu)建成功大腸桿菌pET28a-Est_p1/BL21重組表達(dá)體系。目的蛋白分子量為33.5kD。以pNP-丁酸酯為催化底物，證明Est_p1是一個(gè)偏堿性的中溫酯酶，對(duì)于短鏈酯類有極高的催化活力，適于脂化、轉(zhuǎn)酯化等工業(yè)領(lǐng)域。文檔編號(hào)C12N15/55GK101402947SQ20081022694公開(kāi)日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月20日優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日發(fā)明者關(guān)國(guó)華,晴彭,穎李,李季倫,王珍芳申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)