專利名稱：重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸 綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株的制備，用該基因工程毒株制備的基因工程疫苗及應 用。
背景技術(shù)：
偽狂犬病是由偽狂犬病毒(pseudombiesvirus,簡稱PrV)感染豬、牛、羊、犬、貓、家 兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動物引起的急性傳染病，豬是該病毒的貯存者和傳 播者(Mettenleiter等，Comp Immunol Microbiol Infect Dis.l991,14:151-163)。除豬以外的其它 動物呈散發(fā)形式，發(fā)病后通常具有發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎等癥狀，均為致死性感染。該病對 豬呈爆發(fā)流行，主要導致母豬繁殖障礙和新生仔豬大量死亡。PrV —般經(jīng)鼻咽部感染動物， 并在感染局部的粘膜內(nèi)增殖，然后經(jīng)淋巴循環(huán)或神經(jīng)纖維移行， 一般認為病毒經(jīng)神經(jīng)通路到 達腦而引起中樞神經(jīng)功能紊亂，或在嗅球，三叉神經(jīng)中建立潛伏感染。
偽狂犬病毒的基因組為線狀雙鏈DNA，長約150kb， G+C含量高達74n/。，整個基因組至 少編碼70-100個蛋白，其中胸苷激酶(Thymidine Kinase, TK)基因位于UL區(qū)，全長963bp， 編碼320個氨基酸，催化脫氧胸苷磷酸化。TK基因與是偽狂犬病毒的一個主要毒力基因，也 與病毒的潛伏感染有關(guān)(Kit S等,Am J Vet Res.l985,46:1359-1367; Nunberg等，J Virol. 1989, 63: 3240-3249)。除了TK基因外，與偽狂犬病毒毒力有關(guān)的基因還有g(shù)G、 gE等。TK、 gG、 gE 和gl基因都是病毒增殖所非必需的，缺失這些基因的病毒株與野毒株一樣能正常增殖，而且 不存在毒力返強的危險(Yokyama等，Virol.l991,185:55-65)。但突變病毒株仍具有很好的免疫 原性，接種動物后可產(chǎn)生有效的保護性免疫反應，但是不產(chǎn)生抗gG、 gE、 gl糖蛋白的抗體， 因此可以作為區(qū)分疫苗免疫動物和野毒感染動物的一個標志，有利于建立無偽狂犬病感染的 豬群，為最終根除該病提供有用的工具。華中農(nóng)業(yè)大學在自主分離鑒定的偽狂犬病病毒強毒 Ea株(陳煥春等，畜牧獸醫(yī)學報，1998， 29 (2)， 151-156)的基礎(chǔ)上，通過DNA重組技術(shù) 將主要毒力基因TK、非必需糖蛋白基因gG或gE、 gl缺失，構(gòu)建了一系列的重組突變毒株 用于偽狂犬病的根除(劉正飛等，微生物學報，2002， 42 (3)， 370-374;劉正飛等，畜牧獸 醫(yī)學報，2004， 35(1)， 70-73;徐曉娟等，生物工程學報，2004， 20 (4)， 532-535)。
豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,簡稱PRRSV)引起的一種新的傳染病，主要以母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、 死胎、弱仔等繁殖障礙及各種年齡豬的呼吸系統(tǒng)疾病和高死亡率為特征。由于該病目前危害 嚴重，并且沒有很好的防制措施而引起全球養(yǎng)豬業(yè)和研究者越來越多的注意。已有商品化豬繁殖與呼吸綜合征減毒疫苗問世，但存在安全性問題。而滅活疫苗的免疫 效力不盡人意，同時由于豬繁殖與呼吸綜合征病毒具有抗體依賴增強(ADE)效應(仇華吉 等，中國獸醫(yī)科技，1999， 29(7)， 19-20)，使得常規(guī)疫苗難以奏效(仇華吉等，中國獸醫(yī)學 報，2000， 20(1)， 100-103)，因此有必要開發(fā)新型疫苗。豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基 因編碼的糖蛋白GP5是PRRSV中最主要的保護性抗原，可誘導體液免疫和細胞免疫，因此 是設(shè)計PRRS新型疫苗的首選目標基因(DeaS等，Arch Virol, 2000a， 145， 659-688)。但 單獨基于天然ORF5基因構(gòu)建的疫苗難以誘發(fā)較高的免疫應答(PirzadehB等，JGenVirol， 1998a， 79, 989-999 ; OstrowskiM等，JVirol， 2002， 76， 4241~4250),江云波等對ORF5 基因進行修飾，即將人工合成的編碼輔助性T淋巴細胞表位的核苷酸插入GP5的中和表位和 覆蓋表位間，構(gòu)建的修飾型ORF5M基因具有更好的免疫原性(江云波等，中國獸醫(yī)學報， 2005 (1)， 1-3)。 Balasuriya R等(Balasuriya R等，J Virol, 2000， 74， 10623-10630)在研 究與PRRSV同屬的馬動脈炎病毒(EAV)活病毒載體疫苗時發(fā)現(xiàn)，EAV的E蛋白在體外表 達時其短肽-MHC復合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運的效率很低，因此難以激發(fā)很高的抗體， 而當ORF5與ORF6基因共表達時，二者編碼的蛋白形成異源二聚體，這種異源二聚體的存 在極大地促進了 E蛋白短肽-MHC復合體從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體轉(zhuǎn)運，有利于誘發(fā)機體產(chǎn)生很 強的免疫反應。但目前PRRSV相關(guān)方面的研究尚未見報道。
豬圓環(huán)病毒II型(PCV 2)是新發(fā)現(xiàn)的一種重要病原微生物，可引起斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭 綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合癥(PDNS)、 PCV2相關(guān)繁殖障礙、先天性震顫(CT)等疾 病。我國也于2000年檢測到了該病毒的存在，該病毒在我國豬群的感染率近乎50°%，給我 國的養(yǎng)豬業(yè)也造成了嚴重的打擊。目前對于該病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于該病毒在 細胞上增殖滴度很低，發(fā)展傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗非常困難，因此，研制安全、高效、 廉價的新型疫苗成為越來越多研究者關(guān)注的焦點，但目前的試驗性疫苗誘發(fā)的免疫原性均不 夠理想，使得對于PCV2的新型疫苗的研究進展一直比較緩慢。
與本發(fā)明相關(guān)的一些專利申請，例如偽狂犬病的專利申請，有華中農(nóng)業(yè)大學提出的申請 號為ZL 03156706.1專利(一種偽狂犬病TK7gE7gl—基因缺失標志活疫苗及制備方法)，該專 利公開了一種基因缺失突變株是在人工構(gòu)建的偽狂犬病TK7gE7LacZ+突變株中缺失LacZ基 因，獲得的一株沒有外源基因插入的偽狂犬病毒三基因缺失的突變株TK7gE7gr，該專利只 涉及該毒株制備偽狂犬病基因標記疫苗在防制偽狂犬病單一疾病上的應用。
與本發(fā)明相關(guān)的另一些專利申請，例如豬繁殖與呼吸綜合征的專利申請見于下列文獻 華中農(nóng)業(yè)大學提出的專利號為ZL 200410000238.0(—種豬繁殖與呼吸綜合征的"自殺性"DNA 疫苗)和專利號為ZL 200410009838.3 (—種修飾的豬繁殖與呼吸綜合征病毒ORF5基因及應 用)的專利申請，上述兩項專利申請只涉及對豬繁殖與呼吸綜合征的單一疾病的防制。
與本發(fā)明密切相關(guān)的一篇專利申請是華中農(nóng)業(yè)大學提出的申請?zhí)枮?00510012147.3專 利申請(一種重組偽狂犬病-豬繁殖與呼吸綜合征基因工程毒株及應用)。這項專利申請只涉 及對非變異豬繁殖與呼吸綜合征病毒的防制，對變異豬繁殖與呼吸綜合征病毒的防制效果則 不太理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，研制一種免疫原性更好和安全性更強的重組豬 偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒(rPRV-PRRSV-PCV2)基因工程毒株。
本發(fā)明的第二個目的是利用重組的豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒 基因工程毒株制備豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒三價基因工程疫苗。
本發(fā)明的第三個目的是制備的豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因 工程疫苗的應用。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)
申請人制備了一種重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒毒株 (i^ew^raW^ v/nw ) EOOl，于2008年8月20日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典 型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏編號CCTCCNO: V200808。
本發(fā)明的基本構(gòu)建方法是將華中農(nóng)業(yè)大學動物病毒室從患"高熱癥"的病豬體內(nèi)分離 到的豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株即Nsp2基因部分缺失的豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (j90/r/"e resp/n^0 7 ^sy"t^o附e v/rws ，艮卩PRRSV)毒株(i亥^VuH3毒
株已于2008年11月20日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC) 保藏，其保藏號是CCTCC NO:V200810)的主要免疫原性基因ORF5基因和豬圓環(huán)病毒2型 (PCV-2)主要免疫原性基因ORF2基因的修飾型(ORF2m) (Fan H等，Immunogenicity of porcine circovirus type 2 capsid protein targeting to different subcellular compartments. Mol Immunol, 2008, 45:653-660.)，分別以完整的獨立表達盒的形式(包含人巨細胞病毒CMV強 啟動子和polyA信號，即CMV-ORF5-polyA和CMV-ORF2m-polyA)通過同源重組方法將其 插入到能夠同時表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株的GP5和M蛋白的重組偽狂犬病毒 rPRV-GP5國M疫苗株 (Jiang等,Immunogenicity and protective efficacy of recombinant pseudorabies virus expressing the two major membrane-associated proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vaccine, 2007, 25:547-560)的基因組gG基因位點中，構(gòu)建重組 豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株。 本發(fā)明的主要優(yōu)點是
1、 本發(fā)明通過同源重組的方法使偽狂犬病毒的gG基因插入失活，從而使得重組病毒株 不能表達偽狂犬病毒的gG和gE蛋白，與目前市場上普遍采用的偽狂犬病毒gG或gE鑒別 診斷方法相互配合，為偽狂犬病的凈化奠定基礎(chǔ)。
2、 本發(fā)明針對目前國內(nèi)主要流行的PRRSV變異株，將其主要免疫原性基因ORF5引入 表達PRRSV經(jīng)典毒株GP5和M蛋白的重組偽狂犬病毒中，從而達到可以同時預防PRRSV 經(jīng)典毒株和國內(nèi)當前流行的變異毒株的目的。
3、 本發(fā)明針對當前豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)對養(yǎng)豬業(yè)的危害及缺乏安全有效疫苗的現(xiàn) 狀，將PCV2的主要保護性抗原基因ORF2修飾后(ORF2m)引入重組病毒中，從而達到同時預防豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒感染的目的。
為深入評價用該重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株 制備的豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒疫苗在防制豬偽狂犬病、豬繁殖 與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒感染中的應用，用制備的疫苗在試驗動物(Balb/C小鼠)進行了 免疫效果的評價。
更詳細的發(fā)明方案見《具體實施方式
》所述。


圖1:是本發(fā)明的pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut轉(zhuǎn)移質(zhì)粒構(gòu)建的流程圖。 圖2:是本發(fā)明的pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut轉(zhuǎn)移質(zhì)粒圖譜。
圖中CMVi.e.為人巨細胞病毒立即早期啟動子，polyA為牛生長激素轉(zhuǎn)錄終止信號，gG、 gD和PK為來自偽狂犬病病毒基因組的同源臂序列。 圖3:是本發(fā)明pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut轉(zhuǎn)移質(zhì)粒鑒定結(jié)果。
圖中M為DNAmarker (DL 15000) ， 1為pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut/Sa11。 圖4:是本發(fā)明的重組PrV病毒rPRV-PRRSV-PCV2構(gòu)建流程。
圖5:是本發(fā)明的重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2經(jīng)PCR擴增截去前41個氨基酸的ORF2基因 的鑒定電泳圖。
圖中1-20:重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2 21: PK-15細胞對照22: H20對照 23:質(zhì) 粒pgG-CMVt-ORF2m-ORF5mu對照；M: DL2000 DNA分子量對照。
圖6:是本發(fā)明的重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2經(jīng)PCR擴增包含ORF5mut基因的片段的鑒 定電泳圖。
圖中1-20:重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2 21: PK-15細胞對照；22: H20對照23: 質(zhì)粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut對照；M: DL2000 DNA分子量對照。 圖7:是本發(fā)明的重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2的Southern-blotting分析結(jié)果。
1: Sal I酶切rPRV-PRRSV-PCV2株的基因組；
2: Sal I酶切rPRV-GP5-M親本株的基因組；
3: Sphl+Notl雙酶切rPRV-PRRSV-PCV2株的基因組；
4: Sphl+Notl雙酶切rPRV-GP5-M親本株的基因組。 圖8:是本發(fā)明的重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2經(jīng)RT-PCR檢測截去前41個氨基酸的ORF2 基因mRNA的電泳圖。
圖中M是M: DL2000 DNA分子量對照1:重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2; 2:重組病毒 rPRV-PCV2; 3:重組病毒rPRV-GP5-M; 4:質(zhì)粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut對照；5: H20 對照
圖9:是本發(fā)明的重組偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2免疫小鼠后產(chǎn)生的特異性針對PCV2的 ELISA抗體。
具體實施例方式
實施例l以下結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
1、 引物設(shè)計(用于基因克隆和分子檢測)
根據(jù)分離的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)毒株WuH3 (保藏號為CCTCC NO:V200810)的ORF5基因序列設(shè)計引物Porf5F和Porf5R，擴增片段大小約為603bp,并且 其兩端分別設(shè)計EcoR I、 EcoRV酶切位點。同時根據(jù)GenBank上豬圓環(huán)病毒n型PCV2豫 A株(曹勝波，豬II型圓環(huán)病毒豫A株的全基因組克隆與序列分析，病毒學報，2002， 18 (2): 137-141) ORF2的基因序列設(shè)計引物Porf2F和Porf2R，擴增片段大小約為580bp (截 去ORF2基因的前41個氨基酸)，另外還設(shè)計了一對引物P5、 P6用于擴增串聯(lián)的兩個表達盒 CMV-ORF5mut-polyA和CMV-ORF2m-polyA之間的ORF5mut-polyA-CMV片段，約2.0 kb， 用于對重組病毒中插入的ORF5mut進行鑒定。上述引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司 合成。設(shè)計的引物序列如下
Porf5F: 5'—GTAGAATTCATGTGGGGGAAATGCTTG—3'
Porf5R: 5'—AGTGATATCCTAGAGACGACCCCATTG--3'
Porf2F: 5'-CATGGTACCAATGGCATCTTCAACACCCGC—3'
Porf2R: 5'—TATGCGGCCGCCTTAGGGTTAAGTGGGGG —3'
P5: 5'—AACGCCAGCAACAACAACAGC -3'
P6: 5'隱-GCGGGTGTTGAAGATGCCATT隱-3'
2、 pgG-CMV-ORF2m-ORF5m轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建(見附圖1、 2、 3所示)
以提取的Nsp2基因部分缺失的PRRSV毒株WuH3 (保藏號是CCTCC NO:V200810)的 RNA (提取病毒RNA方法參見江云波，豬繁殖與呼吸綜合征病毒新型疫苗研究，博士論文， 2007年，中國知網(wǎng))為模板，Porf5F/Porf5R為引物對ORF5基因進行RT-PCR擴增，ORF5 基因的擴增條件為5(TC反轉(zhuǎn)錄30min， 95.0'C預變性5min后進入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為95.0°C lmin， 56.0°C lmin， 72.0°C lmin， 35個循環(huán)后72.0'C延伸10min。反應結(jié)束后獲得大小約為 603bp的ORF5基因片段(ORF5mut)。
將獲得的ORF5mut基因克隆到pMD18-T載體(購自TAKARA公司)上構(gòu)建質(zhì)粒 pMD18-ORF5mut測序，測序結(jié)果證實構(gòu)建正確后以EcoRI和EcoRV酶切pMD18-ORF5mut， 回收603bp大小的ORF5mut基因片段，插到華中農(nóng)業(yè)大學動物病毒室構(gòu)建的真核表達載體 pCMVPA(江云波，豬繁殖與呼吸綜合征病毒新型疫苗研究，博士論文，2007年，中國知網(wǎng)) 中的EcoR I和Sma I酶切位點，得到pCMVPA-ORF5mut質(zhì)粒。用Bgl II和BamH I酶切質(zhì)粒 pCMVPA-ORF5mut，回收約2.0kb的片段插入通用轉(zhuǎn)移載體pgG-Uni (方六榮等，偽狂犬病 病毒gG基因缺失通用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建，華中農(nóng)業(yè)大學學報，2001， 20 (4): 306-309)中， 構(gòu)建轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pgG-CMV-ORF5mut。用BglII禾Q Xhol I酶切質(zhì)粒pCDNA-ORF2m (樊慧英， 豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗的研究，博士論文，2007年，中國知網(wǎng))回收1.7kb左右的片 段將其插入pCI-neo(購自Promega公司)的BglII和Xhol I位點之間，構(gòu)建質(zhì)粒pCI-ORF2m; 然后將pCI-ORF2m用BglII禾Q Smal酶切回收約1.58kb的CMV-ORF2m基因片段插入 pgG-CMV-ORF5mut的BamH I和Stu I位點構(gòu)建質(zhì)粒pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut，其構(gòu)建流程如圖1所示，pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut轉(zhuǎn)移質(zhì)粒圖譜如圖2所示，其酶切鑒定如圖3所 示。
3、 重組偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2 (E001)的構(gòu)建
在PK-15細胞上增殖rPRV-GP5-M親本株，提取病毒基因組DNA(提取方法參照王柳等， 人巨細胞病毒的分子克隆及其特異性DNA探針的制備，生物技術(shù)，1994， 4 (4): 33-35)。 應用脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染技術(shù)(方法參照周復春等，偽狂犬病病毒鄂八株60-/1^^^+突變株的構(gòu) 建，畜牧獸醫(yī)學報，2001， 32 (2)， 129-133)將其與pgG-CMV-ORF2m-ORF5mut轉(zhuǎn)移載體 共轉(zhuǎn)染PK-15細胞，通過同源重組交換將CMV-ORF5mut-polyA和CMV-ORF2m-polyA兩個 獨立的完整表達盒導入到rPRV-GP5-M基因組的gG基因位點(圖4)，待產(chǎn)生細胞病變后收 毒。將病毒液接種于PK-15細胞，用含1%低熔點瓊脂糖的DMEM (美國GIBCO公司產(chǎn)品) 維持液覆蓋，于37。C5。/。C02的條件下培養(yǎng)，當出現(xiàn)細胞病變時，用0.01%的中性紅染色lh， 由于病變細胞不能著色，而正常細胞被染成紅色，從而出現(xiàn)圓點狀空斑，挑取單個空斑接種 PK-15細胞擴大培養(yǎng)，通過PCR擴增ORF5mut和ORF2m基因的鑒定陽性重組病毒(PCR結(jié) 果見圖5和圖6)，如此進行三次純化，直到陽性率為100%，從而確定病毒液中只含有重組 偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2，而沒有親本毒株的污染。其構(gòu)建流程如圖4。
4、 重組偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2 (E001)的鑒定及其生物學特性 重組偽狂犬病毒株(rPRV-PRRSV-PCV2，即本發(fā)明已按專利程序送交中國典型培養(yǎng)物保
藏中心保藏的生物材料樣品，即E001)的mRNA水平檢測
以重組偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2 (E001)的mRNA (提取病毒RNA方法參見江云 波，豬繁殖與呼吸綜合征病毒新型疫苗研究，博士論文，2007年，中國知網(wǎng))為模板擴增插 入的外源基因，結(jié)果表明rPRV-PRRSV-PCV2病毒株可以擴增到插入的目的基因，而親本株 rPRV-GP5-M則檢測不到，說明目的基因已經(jīng)插入到了親本株基因組gG基因位點中。
重組偽狂犬病毒株(rPRV-PRRSV-PCV2，即本發(fā)明已按專利程序送交中國典型培養(yǎng)物保 藏中心保藏的生物材料樣品，即E001) Southern-blotting鑒定
主要方法如下提取重組偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2(即E001，保藏編號CCTCCNO: V200808)的基因組DNA (參考文獻王柳等，人巨細胞病毒的分子克隆及其特異性DNA探 針的制備，生物技術(shù)，1994， 4 (4)， 33-35)分別用Sal I和Sphl+Notl酶切后，在0.8%的瓊 脂糖凝膠上30伏電泳6小時后，按常規(guī)方法(薩姆布魯I，弗里奇E和曼尼阿蒂斯T.著， 《分子克隆實驗指南》第二版.金冬雁等譯校，科學出版社，1998)進行Southern-blotting鑒 定。將酶切后電泳的重組毒株的基因組DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，8(TC烤膜后備用。PCR 擴增截去前41個氨基酸的ORF2基因的DNA片段，按DNA回收試劑盒(購自上海生工生 物工程技術(shù)有限公司)操作說明書回收目的DNA后，用地高辛標記(具體方法按Roch公司 的地高辛標記試劑盒說明書操作)，作為DNA探針，置于-2(TC保存?zhèn)溆谩Ｗ詈髮NA探針 與備用的硝酸纖維素膜雜交，結(jié)果如圖7所示。試驗結(jié)果表明，Sal I和Sphl+Notl酶切的 rPRV-PRRSV-PCV2病毒株基因組DNA泳道有明顯的特異性雜交帶，大小與預期相符，而
rPRV-GP5-M病毒株基因組DNA泳道則沒有，證實CMV-ORF5-PolyA和CMV-ORF2m-PolyA表達盒已正確插入到了親本株基因組gG基因位點中。
本發(fā)明構(gòu)建的重組偽狂犬病毒rPRV-PRRSV-PCV2在細胞上的增殖特點與其親本株 rPRV-GP5-M沒有明顯差異。在PK-15細胞上的增殖滴度可以達到l(T75 TCID5()/mL以上，在 PK-15細胞上傳20代，其增殖滴度沒有明顯的變化，并均可穩(wěn)定的擴增出插入的外源基因。
5、 偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒三價基因工程疫苗的制備
將鑒定構(gòu)建正確、增殖滴度高、遺傳穩(wěn)定，并具有良好生物學活性的重組病毒 rPRV-PRRSV-PCV2種毒按1/10的體積比接種雞胚成纖維細胞，收集增殖滴度達 1068TCID5()/mL以上的病毒液，按病毒液明膠為7 : 1的體積比加入明膠作保護劑，充分混 勻后按2.5mL/瓶分裝于滅菌凍干瓶中，置冷凍干燥機中凍干，壓蓋后置4'C保存?zhèn)溆谩?br> 6、 偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒三價基因工程疫苗的安全性評價
將50只偽狂犬病毒抗體陰性的健康Balb/C小鼠隨機分為五組，其中一組接種106TCID5(3 的rPRV-PRRSV-PCV2重組三價基因工程疫苗，另外兩組分別接種同樣劑量的親本株 rPRV-GP5-M和重組偽狂犬病毒-豬圓環(huán)病毒2型rPRV-PCV2 (Ju等，Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fiision protein of porcine circovirus type 2. Vet Micro. 2005， 109:179-190.)作為本發(fā)明中的重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2的對照。 一組接 種同樣劑量的PRV野毒鄂A強毒株(華中農(nóng)業(yè)大學分離鑒定的偽狂犬病病毒強毒Ea株或稱 為鄂A株，兩者為同一毒株(見陳煥春等，畜牧獸醫(yī)學報，1998， 29 (2)， 151-156)作為病 毒毒性對照，余下一組作為不免疫空白對照組，觀察14天。結(jié)果接種本發(fā)明中的三價重組基 因工程疫苗和對照組的小白鼠精神食欲均正常，無異常表現(xiàn)；而接種強毒(PRV野毒鄂A株) 的小白鼠，從接種后72小時開始死亡，至U144小時全部死亡，表明該重組三價基因工程疫苗 對小白鼠是安全的(表l)。
表1本發(fā)明的rPRV-PRRSV-PCV2重組三價基因工程疫苗對Balb/C小鼠的安全性
試驗組別動物數(shù)(只)死亡數(shù)(只)平均死亡時間(小時)
空白對照1000
rPRV-PRRSV-PCV21000
rPRV陽GP5-M1000
rPRV陽PCV21000
PrV鄂A株(又稱Ea株)1010111.3±32.7
將rPRV-PRRSV-PCV2重組基因工程疫苗按107()TCID5o的病毒量接種25日齡的仔豬，部 分出現(xiàn)輕度的發(fā)熱反應，兩天后恢復正常，在此期間仔豬的精神食欲正常，未見異常變化， 可以檢測到偽狂犬病毒中和抗體。PRV野毒鄂A株(來源同上)接種的仔豬，第二天全部呈 現(xiàn)發(fā)熱反應，持續(xù)一周，并有一頭死亡，解剖發(fā)現(xiàn)具有典型的偽狂犬病病理變化，而空白對 照組既沒有體溫升高，也沒有異常臨床表現(xiàn)。按107QTCID5Q的病毒量接種rPRV-PRRSV-PCV2疫苗的妊娠母豬和未接種疫苗的妊娠母豬，窩產(chǎn)仔數(shù)基本相當，均沒有出現(xiàn)死胎、木乃伊胎
等。結(jié)果簡明該疫苗對仔豬和妊娠母豬均是安全的。
7、 rPRV-PRRSV-PCV2重組三價基因工程疫苗的免疫效力檢測
1) 小鼠的免疫程序
將重組病毒rPRV-PRRSV-PCV2制成的凍干活疫苗經(jīng)頸部肌肉注射6-8周齡Balb/c小鼠， 每組6只，每只接種劑量為105TCID5o，共免疫2次，間隔3周；同時設(shè)親本株rPRV-GP5-M、 重組病毒rPRV-PCV2對照，并設(shè)置一組不免疫陰性對照(negative control)。所有免疫小鼠于 首免后3周通過尾靜脈采血，6周眼睚放血，分離血清后分別進行特異性針對PRV的ELISA 抗體禾口中和抗體檢觀lj (方法參照Jiang等，Immunogenicity and protective efficacy of recombinant pseudorabies virus expressing the two major membrane-associated proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vaccine, 2007, 25:547-560.)，針對PRRSV的中和抗體水平檢測 (方法參照方六榮等，表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) GP5的重組偽狂犬病毒TK-/ 80-/0 5+的構(gòu)建及其生物學特性初步探討，病毒學報，2004， 20 (3): 249-254)，以及針對 豬圓環(huán)病毒的ELISA抗體水平檢測(方法參照Ju等，Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1-ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2. Vet Micro. 2005, 109:179-190)。
2) 偽狂犬病毒抗體水平檢測
重組三價基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)首免后3周可以檢測到特異性針對PRV 的ELISA抗體和中和抗體，并于二免后3周達到最高，其抗體滴度達到1:20480，而中和抗 體達到32.6±17.6，和親本株rPRV-GP5-M免疫組所表現(xiàn)出的趨勢和實際值均無顯著性差異(表 2)，表明重組三價基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)可以較好地誘導特異性針對PRV 的免疫應答。
表2重組三價基因工程疫苗免疫小鼠誘發(fā)特異性針對PRV的抗體水平
檢測方法3W6W
rPRV-GP5-MSNa EIJSAb28.3±18.4 2048035.6±17.5 20480
rPRV-PCV2SNa ELISAb26.8±19.4 2048032.6±16.5 20480
rPRV-PRRSV-PCV2SN ELISA27.4±24.3 2048032.6±17.6 20480
Neg controlSN ELISA——
說明a:SN指中和抗體；
b: PRV的ELISA抗體效價是指針對PRV全病毒粒子的ELISA抗體滴度。3)豬繁殖與呼吸綜合征病毒中和抗體檢測
采用文獻(Pirzadeh B等，J Gen Virol， Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 ofporcine reproductive and respiratory syndrome virus, 1998， 79: 989-999)報道 的PRRSV中和抗體檢測方法，檢測血清中特異性針對PRRSV的中和抗體水平。結(jié)果表明， 重組三價基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)免疫組在首免后3周可以檢測到特異性針對 變異和非變異PRRSV的中和抗體(>=1:4)，并隨著免疫時間的延長而上升，于首免后6周 達到最高。重組三價基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)誘發(fā)的特異性針對非變異PRRSV 的中和抗體與親本株(rPRV-GP5-M)免疫組相比差異不顯著(P〉0.05, t-test)，而親本株 (rPRV-GP5-M)免疫組誘發(fā)的針對變異PRRSV的中和抗體水平卻很低。表明本發(fā)明中的重 組三價基因工程疫苗不緊能夠較好地誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生特異性針對非變異PRRSV的中和抗 體也能誘發(fā)免疫小鼠產(chǎn)生特異性針對變異PRRSV的中和抗體。重組病毒rPRV-PCV2和空白 對照組在整個實驗過程中都未檢測到特異性針對變異和非變異PRRSV的中和抗體，試驗結(jié) 果如表3、表4。
表3重組三價基因工程疫苗免疫小鼠誘發(fā)特異性針對^&^^尸JCiWK的中和抗體水平
VaccineTime after primary vaccination<l:8a1:81:161:32
rPRV-PRRSV-PCV23W5b100
6W1131
rPRV-GP5m-M3W6000
6W2031
Neg control3W6000
6W6000
rPRV-PCV23W6000
6W6000
a中和抗體效價.b達到一定中和抗體效價的免疫小鼠數(shù)量.
表4重組三價基因工程疫苗免疫小鼠誘發(fā)特異性針對^^W JWK的中和抗體水平VaccineTime after primary<l:8a1:81:161:32
vaccination
3W4b200
rPRV-PRRSV-PCV2
6W1140
3W6000
rPRV-GP5m-M
6W2400
Neg control3W6000
6W6000
rPRV-PCV23W6000
6W6000
a中和抗體效價.b達到一定中和抗體效價的免疫小鼠數(shù)量
3)豬圓環(huán)病毒抗體檢測
釆用文獻(樊慧英，豬圓環(huán)病毒2型基因工程疫苗的研究，博士論文，2007年，中國知
網(wǎng))報道的抗PCV2的ELISA抗體檢測方法，檢測血清中特異性針對PCV2的ELISA抗體水平。結(jié)果表明，重組三價基因工程疫苗株(rPRV-PRRSV-PCV2)和重組病毒rPRV-PCV2兩 個免疫組在首免后3周可以檢測到特異性針對PCV2的ELISA抗體，并趨于上升，兩組之間 差異不顯著(PX).05,t-test)，表明本發(fā)明中的重組三價基因工程疫苗能夠較好地誘發(fā)免疫小 鼠產(chǎn)生特異性針對PCV2的ELISA抗體。親本株rPRV-GP5-M和空白對照組在整個實驗過程 中都都未檢測到PCV2特異性抗體(0D630nmO.4),試驗結(jié)果如圖9所示。
權(quán)利要求
1、一種重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株(Pseudorabies virus)E001，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCCNOV200808。
2、 包含權(quán)利要求1所述的重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒毒株的 基因工程疫苗。
3、 權(quán)利要求1所述的一種重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工 程毒株在制備偽狂犬病-豬繁殖與呼吸綜合征-豬圓環(huán)病基因工程疫苗上的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株構(gòu)建、疫苗制備及應用。獲得一株重組豬偽狂犬病毒-豬繁殖與呼吸綜合征病毒-豬圓環(huán)病毒基因工程毒株E001，缺失了偽狂犬病毒主要毒力基因TK、糖蛋白基因gG、gE和gI，不表達偽狂犬病毒的功能性糖蛋白gG和gE/gI；能同時表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典毒株的GP5m/M蛋白抗原和豬繁殖與呼吸綜合征病毒國內(nèi)變異株GP5蛋白及豬圓環(huán)病毒的ORF2蛋白。該毒株可刺激豬產(chǎn)生抗偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒攻擊的保護性免疫反應，有效防止偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒的感染。還公開了三價基因工程疫苗的制備與應用。
文檔編號C12N7/01GK101457215SQ20081022785
公開日2009年6月17日 申請日期2008年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月1日
發(fā)明者徐鳳琴, 方六榮, 江云波, 肖少波, 陳煥春 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學